ШТАММ BIFIDOBACTERIUM PSEUDOCATENULATUM OV-17, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/00 A23C9/12 A61K35/74 A23L1/29 A61K8/99 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и многих других причин [1, 4].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.

Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].

Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8].

Это дает основания считать, что при конструировании и назначении средств коррекции микрофлоры необходимо учитывать биоразнообразие видового состава бифидофлоры. Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру и повысит эффективность разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-17 с высокой биологической активностью, устойчивостью к внешним воздействиям и средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.

Штамм В. pseudocatenulatum OV-17 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под №213.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. pseudocatenulatum OV-17 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-17, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Штамм В. pseudocatenulatum OV-17 в ходе технологического процесса в короткие сроки на производственных средах накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, кислой среде, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры.

Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства штамма

Клетки штамма В. pseudocatenulatum OV-17 представляют собой Грам + полиморфные, бесспоровые неподвижные, короткие, слегка изогнутые палочки с утолщением на обоих концах, расположенные одиночно или по 2-3 под углом в 60°.

В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии через 16-24 часа роста имеют форму «кометы» с плотным ядром 2 мм в диаметре и вуалевидным хвостом до 7 мм.

Физиолого-биохимические свойства штамма

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания - 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует лактозу, галактозу, раффинозу, эскулин, вариабельно арабинозу, ксилозу. Не ферментирует мальтозу, сахарозу, фруктозу, рамнозу, маннозу, целлобиозу, трегалозу, мелецитозу, сорбитол, салицин, маннитол. Тесты на уреазу, нитраты и индол - отрицательны.

Генотипирование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 334365 и EU 334366.

Культуральные свойства штамма

Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Таблица 1 Показатели содержания бифидобактерий органических кислот после культивирования штамма В. pseudocatenulatum OV-17 на разных средах выращивания Питательная среда КОЕ/мл °T Среда для культивирования бифидобактерий (БС) 5,2×10⁹ 198 МРС 5,6×10⁹ 205 Гидролизатно-молочная среда 6,0×10⁹ 218 Печеночная среда 5,8×10⁹ 212 Молоко восстановленное обезжиренное 6,0×10⁸ 34

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. pseudocatenulatum OV-17 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко не сквашивает; при культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 34°Т.

В таблице 2 представлены данные культивирования штамма В. pseudocatenulatum OV-17 в течение 96 часов на обезжиренном молоке и бифидум-среде.

Таблица 2 Показатели культивирования штамма В. pseudocatenulatum OV-17 в течение 96 часов. Время культивирования (ч) Молоко обезжиренное БС среда °T КОЕ/мл T° КОЕ/мл 0 18 1,0×10⁷ 44 2,1×10⁷ 24 30 5,5×10⁸ 142 5,4×10⁹ 32 32 5,5×10⁸ 164 5,0×10⁹ 48 34 6,0×10⁸ 196 5,0×10⁹ 72 34 5,5×10⁸ 198 5,2×10⁹ 96 34 5,5×10⁸ 198 5,2×10⁹

Результаты, представленные в таблице 2, демонстрируют, что при длительном культивировании штамма В. pseudocatenulatum OV-17 при нарастании содержания органических кислот в культуральной жидкости не происходит снижения содержания жизнеспособных клеток бифидобактерий, что говорит о его высокой устойчивости к кислой среде.

Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. pseudocatenulatum OV-17 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерий и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями.

Полученные результаты говорят о высокой устойчивости штамма В. pseudocatenulatum OV-17 к кислой среде.

Антагонистическая активность штамма изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (таблица 3).

Таблица 3 Антагонистическая активность штамма В. pseudocatenulatum OV-17 № Штамм тестируемого микроорганизма Зона задержки роста в присутствии штамма В. pseudocatenulatum OV-17, мм 1 Staphylococcus aureus ATCC 653 8-P 25±3 2 Shigella flexneri 337 34±5 3 Shigella sonnei 177 30±5 4 Proteus vulgaris 1274 31±0 5 Escherichia coli 157 27±5

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17, выращенную на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. pseudocatenulatum OV-17 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.

Чувствительность к антибиотикам штамма В. pseudocatenulatum OV-17 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2. 1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к стрептомицину, неомицину, гентамицину, полимиксину, амикацину, налидиксовой кислоте, канамицину, тетрациклину, доксициклину и промежуточно устойчив к пефлоксацину, ванкомицину и ципрофлоксацину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.

Безвредность

В опыте изучения острой токсичности штамма В. pseudocatenulatum OV-17 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×10⁷ КОЕ на животное гибели мышей не отмечено.

Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. pseudocatenulatum OV-17 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к кислой среде и широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.

Представленные данные изучения штамма В. pseudocatenulatum OV-17 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения биологически активной добавки к пище в жидком виде.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часов при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.

Пример 2. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 10^6-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.

Пример 3. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения бактерийного препарата.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий.

К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10⁸ КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.

Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10⁹ КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В 1 г БАД к пище содержится не менее 10⁸ КОЕ жизнеспособных бифидобактерий.

Пример 5. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения гигиенических и косметических средств.

Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. pseudocatenulatum OV-17 с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.

Список литературы

1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.

2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. / Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.

3. Гончарова Г.И., Вильшанская Ф.Л., Ж. Микробиол., 1968, №7, с.55.

4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.

5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.

6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника // Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004.

8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования // Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.

Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-17 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №213. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, кислой среде, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. pseudocatenulatum OV-17 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, что обеспечивает пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширяет арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. 4 табл.

Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-17, коллекционный номер №213, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.