ШТАММ BIFIDOBACTERIUM BREVE OV-12, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ И НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/00 A23C9/12 A61K35/74 A23L1/29 A61K8/99 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.

Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3,6].

Применение современных подходов генотипирования бифидобактерии подтвердило присутствие В. breve в составе микрофлоры грудных детей [2, 5, 6, 8].

Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.

Целью настоящего изобретения является штамм Bifidobacterium breve OV-12, который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под №217.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах, в том числе биологически активных добавок, капсул, таблеток, суспензий, суппозиториев; ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. breve OV-12 может быть применен в производстве гигиенических средств, например кремов, гелей, косметических масок.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, которые в качестве действующего начала пробиотической направленности содержат штамм В. breve OV-12, в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливающего биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, органическим кислотам, а также внешним воздействиям, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры.

Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации штаммов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства

Клетки штамма В. breve OV-12 представляют собой Грам+ полиморфные, бесспоровые неподвижные крупные палочки с бифуркацией на одном конце, расположенные попарно крестообразно в виде хромосомы, буквы Х, Т, «рожек улитки».

В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии имеют вид «комет» в форме елочек длиной до 1 см. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Физиолого-биохимические свойства

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания - 37,5-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует мальтозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелецитозу, сахарозу, маннозу, вариабельно сбраживает раффинозу, ксилозу, арабинозу. Не ферментирует салицин, трегалозу, рамнозу, маннозу, эскулин, целлобиозу, сорбитол. На уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна.

Генотипирование штамма В. breve OV-12 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу.

Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272015 и EU 272021.

Культуральные свойства

Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Таблица 1 Накопление биомассы и органических кислот при культивировании штамма В. breve OV-12 на различных питательных средах. Питательная среда КОЕ/мл °T Среда для культивирования бифидобактерий (БС) 5,0×10⁹ 178 МРС 5,6×10⁹ 205 Гидролизатно-молочная среда 6,0 ×10⁹ 210 Печеночная среда 5,8×10⁹ 210 Молоко восстановленное обезжиренное 2,0×10⁸ 135

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. breve OV-12 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко сквашивает к 24 часам до 90°Т с образованием плотного сгустка. Максимальная кислотность в молоке - 150°Т.

Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот (продуктов метаболизма) в процессе культивирования представлены в таблице 2.

Таблица 2 Динамика культивирования штамма В.breve OV-12 в молоке и среде для выделения и культивирования бифидобактерий в стационарных условиях Время выращивания после посева, (ч) Выращивание на молоке Выращивание на БС среде °T КОЕ/мл °T КОЕ/мл 0 18 1,2×10⁷ 34 2,lxl0⁶ 24 90 2,0×10⁸ 140 3,5х10⁹ 48 135 2,2×10⁸ 260 4,0х10⁹

Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.

Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных и лабораторных средах с высокими показателями значения КОЕ/мл.

Антагонистическая активность штамма изучалась на плотных питательных средах методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных микроорганизмов.

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что В. breve OV-12 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых штаммов.

Таблица 3 Антагонистическая активность штамма В. breve OV-12 № Штамм тестируемого микроорганизма Зона задержки роста в присутствии штамма В. breve OV-12, мм 1 Staphylococcus aureus ATCC 6538-P 20±3 2 Shigella flexneri 337 28±3 3 Shigella sonnei 177 26±5 4 Proteus vulgaris 1274 28±2 5 Escherichia coli 157 26±3

Чувствительность к антибиотикам штамма В. breve OV-12 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 Антибиотикочувствительность штамма В. breve OV-12 № Название антибиотика Интерпретация зон Содержание препарата в диске, мкг Диаметр зоны ингибирования роста в мм Устойчив Промежуточно устойчив Чувствителен 1 Бензилпенициллин ≤19 20-27 ≥28 10 37±1 2 Оксациллин ≤10 11-13 ≥14 10 35±0 3 Ампициллин ≤10 11-14 ≥16 10 40±2 4 Карбенициллин ≤14 15-18 ≥19 25 42±2 5 Азлоциллин ≤13 14-16 ≥16 75 40±2 6 Цефалотин ≤14 15-18 ≥19 30 40±2 7 Цефалексин ≤14 15-18 ≥19 30 32±2 8 Цефазолин ≤14 15-18 ≥19 30 30±2 9 Цефтазидим ≤14 15-17 ≥18 30 33±2 10 Цефотаксим ≤14 15-20 ≥21 30 35±2 11 Имипенем ≤13 14-15 ≥16 10 40±0 12 Стрептомицин ≤16 17-19 ≥20 30 15±2 13 Неомицин ≤12 13-16 ≥17 30 0±0 14 Канамицин ≤14 15-18 ≥19 30 0±0 15 Гентамицин ≤12 13-14 ≥15 10 12±2 16 Амикацин ≤14 15-16 ≥17 30 0±0 17 Тетрациклин ≤16 17-21 ≥22 30 27±2 18 Доксициклин ≤15 16-19 ≥20 10 34±0 19 Эритромицин ≤17 18-21 ≥22 15 30±0 20 Азитромицин ≤13 14-17 ≥18 15 20±2 21 Кларитромицин ≤13 14-17 ≥18 15 25±3 22 Рокситромицин ≤13 15-18 ≥19 30 37±2 23 Линкомицин ≤19 20-23 ≥24 15 35±1 24 Клиндамицин ≤14 15-20 ≥21 2 32±2 25 Ванкомицин ≤14 15-16 ≥17 30 38±3 26 Хлорамфеникол (левомицитин) ≤15 16-18 ≥19 30 21±2 27 Рифампицин ≤12 13-15 ≥16 5 35±2 28 Полимиксин ≤11 12-14 ≥15 300 ЕД 0±0 29 Налидиксовая кислота ≤12 13-17 ≥18 30 0±0 30 Ципрофлоксацин ≤15 16-20 ≥21 5 12±2 31 Пефлоксацин ≤14 15-21 ≥22 10 0±0 32 Ломефлоксацин ≤18 19-21 ≥22 10 25±2

Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к полимиксину, налидиксовой кислоте, амикацину, неомицину, канамицину, пефлоксацину, гентамицину, ципрофлоксацину, стрептомицину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.

Безвредность

В опыте изучения острой токсичности штамма В.breve OV-12 показана его полная безвредность: при введении белым мышам дозы per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×10⁷ КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено.

Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.

Представленные данные изучения штамма В. breve OV-12 позволяют сделать заключение о перспективности его использования как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. breve OV-12 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.

Пример 2. Использование штамма В. breve OV-12 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 10^6-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.

Пример 3. Использование штамма В. breve OV-12 для получения бактерийного препарата

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий.

К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. Использование штамма В. breve OV-12 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище

Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10⁹ КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В1 г БАД к пище содержится не менее 10⁸ KОЕ жизнеспособных бифидобактерий.

Пример 5. Использование штамма В. breve OV-12 для получения гигиенических и косметических средств

Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. breve OV-12 с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.

Пример 6. Использование штамма В. breve OV-12 для получения кисломолочного продукта

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде

до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 10⁸ КОЕ/мл бифидобактерий.

Литература

1. Бондаренко В.М., Мапулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.

2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.

3. Гончарова Г.И., Вилыпанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, №7, с.55.

4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.

5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.

6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. / Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника, - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2. 1890-04, 2004., 52 с.

8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. / Бифидобактерий: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.

Штамм Bifidobacterium breve OV-12 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №217. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. breve OV-12 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, обеспечивающих пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также обеспечивает расширение арсенала аналогичных средств. 4 табл.

Штамм Bifidobacterium breve OV-12, коллекционный номер №217, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.