ШТАММ BIFIDOBACTERIUM ANGULATUM OV-15, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A61K35/74 A23L1/29 A61K8/99 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и многих других причин [1, 4].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры, как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.

Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].

Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерии (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum.) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8].

Это дает основания считать, что при конструировании и назначении средств коррекции микрофлоры необходимо учитывать биоразнообразие видового состава бифидофлоры. Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру и повысит эффективность разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма Bifidobacterium angulatum OV-15 с высокой биологической активностью, устойчивостью к внешним воздействиям и средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.

Штамм В. angulatum OV-15 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №212.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. angulatum OV-15 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. angulatum OV-15, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Штамм В. angulatum OV-15 в ходе технологического процесса в короткие сроки на производственных средах накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, к кислой среде, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры.

Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства

Клетки штамма Bifidobacterium angulatum OV-15 представляют собой Грам+полиморфные, бесспоровые неподвижные палочки с утолщениями на обоих концах. Клетки образуют скопления в виде китайских иероглифов, поодиночке встречаются редко.

В полужидких питательных средах растет по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии культуры через 16-24 часа роста имеют форму капли длиной 3-5 мм.

Физиолого-биохимические свойства

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания- 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,8-4,1. Ферментирует лактозу, мальтозу, сахарозу, салицин, эскулин, галактозу, мелецитозу, раффинозу, целобиозу, салицин, избирательно - трегалозу, рамнозу, ксилозу, рамнозу, не ферментирует фруктозу, маннитол, маннозу, сорбитол. На уреазу, индол-реакция отрицательна.

Генотипирование штамма Bifidobacterium angulatum OV-15 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272012 и EU 272020

Культуральные свойства

Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Таблица 1 Показатели содержания бифидобактерий и органических кислот при культивировании штамма В. angulatum OV-15 на разных питательных средах Питательная среда КОЕ/мл °T Среда для культивирования 5,0×10⁹ 134 бифидобактерий (ЕС) МРС 3,0×l0⁹ 185 Гидролизатно-молочная среда 1,2×10⁹ 180 Печеночная среда 1,8×10⁹ 186 Молоко восстановленное обезжиренное 5,0×10⁸ 50

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. angulatum OV-15 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко не сквашивает; при культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 50°Т.

В таблице 2 представлены данные культивирования штамма В. angulatum OV-15 в течение 96 часов на обезжиренном молоке и бифидум-среде.

Таблица 2 Показатели культивирования штамма В. angulatum OV-15 в течение 96 часов Время выращивания после посева, ч Выращивание на молоке Выращивание на БС среде °T КОЕ/мл °T КОЕ/мл 0 18 5,0×10⁶ 44 2,1×10⁶ 24 46 4,5×10⁸ 120 5,0×10⁹ 36 48 4,0×10⁸ 124 5,0×10⁹ 48 49 5,0×10⁸ 128 4,5×10⁹ 72 50 5,0×10⁸ 134 4,0×10⁹ 96 50 5,0×10⁸ 136 4,0×10⁹

Данные, представленные в таблице 2, демонстрируют, что при длительном культивировании штамма В. angulatum OV-15 при нарастании содержания органических кислот в культуральной жидкости содержание жизнеспособных клеток бифидобактерий не снижается, что говорит о его высокой устойчивости к кислой среде.

Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В.angulatum OV-15 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерий и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями. Устойчив к кислой среде.

Антагонистическая активность штамма изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (таблица 3).

Таблица 3 Антагонистическая активность штамма B. angulatum OV-15 № Штамм тестируемого микроорганизма Зона задержки роста патогенных штаммов в присутствии В. angulatum OV-15, мм 1 Staphylococcus aureus ATCC 653 8-P 26±3 2 Shigella flexneri 337 30±2 3 Shigella sonnei 177 31±3 4 Proteus vulgaris 1274 32±3 5 Escherichia coli 157 26±4

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. angulatum OV-15, выращенную на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.

Чувствительность к антибиотикам штамма В. angulatum OV-15 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 Антибиотикочувствительность штамма В. angulatum OV-15 № Наименование антибиотика Интерпритация зон, мм Содержание активного вещества в диске, мкг Диаметр зоны ингибирования роста, мм Устойчив Промежуточно устойчив Чувствителен 1 Бензилпенициллин ≤19 20-27 ≥28 10 28±2 2 Оксациллин ≤10 11-13 ≥14 10 12±0 3 Ампициллин ≤10 11-14 ≥16 10 22±2 4 Карбенициллин ≤14 15-18 ≥19 25 26±1 5 Азлоциллин ≤13 14-16 ≥16 75 26±2 6 Цефалотин ≤14 15-18 ≥19 30 28±2 7 Цефалексин ≤14 15-18 ≥19 30 21±2 8 Цефазолин ≤14 15-18 ≥19 30 16±2 9 Цефтазидим ≤14 15-17 ≥18 30 20±2 10 Цефотаксим ≤14 15-20 ≥21 30 25±0 11 Имипенем ≤13 14-15 ≥16 10 23±1 12 Стрептомицин ≤16 17-19 ≥20 30 8±0 13 Неомицин ≤12 13-16 ≥17 30 0±0 14 Канамицин ≤14 15-18 ≥19 30 0±0 15 Гентамицин ≤12 13-14 ≥15 10 0±0 16 Амикацин ≤14 15-16 ≥17 30 0±0 17 Тетрациклин ≤16 17-21 ≥22 30 28±2 18 Доксициклин ≤15 16-19 ≥20 10 25±2 19 Эритромицин ≤17 18-21 ≥22 15 25±0 20 Азитромицин ≤13 14-17 ≥18 15 17±1 21 Кларитромицин ≤13 14-17 ≥18 15 27±2 22 Рокситромицин ≤13 15-18 ≥19 30 25±0 23 Линкомицин ≤19 20-23 ≥24 15 25±0 24 Клиндамицин ≤14 15-20 ≥21 2 28±0 25 Ванкомицин ≤14 15-16 ≥17 30 20±0 26 Хлорамфеникол (левомицитин) ≤15 16-18 ≥19 30 34±1 27 Рифампицин ≤12 13-15 ≥16 5 34±1 28 Полимиксин ≤11 12-14 ≥15 300ЕД 0±0 29 Налидиксовая кислота ≤12 13-17 ≥18 30 0±0 30 Ципрофлоксацин ≤15 16-20 ≥21 5 10±0 31 Пефлоксацин ≤14 15-21 ≥22 10 0±0 32 Ломефлоксацин ≤18 19-21 ≥22 10 10±0

Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к неомицину, канамицину, гентамицину, полимиксину, амикацину, пефлоксацину, налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину, ломефлоксацину, стрептомицину, промежуточно устойчив к оксациллину, цефазолину, азитромицину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, он чувствителен.

Безвредность

В опыте изучения острой токсичности штамма Bifidobacterium angulatum OV-15 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×10⁷ КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено.

Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. angulatum OV-15 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий не ниже 10⁹ КОЕ/мл, образует в процессе культивирования органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, и к повышенной кислотности сред культивирования. Безвреден при введении лабораторным животным.

Представленные данные изучения штамма В. angulatum OV-15 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, средств гигиенического и косметического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. angulatum OV-15 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. angulatum OV регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл, и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.

Пример 2. Использование штамма В. angulatum OV-15 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. angulatum OV-15 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл, и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 10^6-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.

Пример 3. Использование штамма В. angulatum OV-15 для получения бактерийного препарата.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. angulatum OV-15 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38 С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий.

К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10⁸ КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. Использование штамма В. angulatum OV-15 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.

Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10⁹ КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси, из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В 1 г БАД к пище содержится не менее 10 КОЕ жизнеспособных бифидобактерий.

Пример 5. Использование штамма В. angulatum OV-15 для получения гигиенических и косметических средств.

Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. angulatum OV-15 с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.

Литература

1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.

2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.

3. Гончарова Г.И., Вилыпанская Ф.Л. - Ж. микробиол., 1968, №7, с.55.

4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. -М.: Грант, 2002, с.295.

5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. /Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.

6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. /Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского, 1986, с.64-69.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к

антибактериальным препаратам. - МУК 4.2.1890-04, 2004., 52 с.

8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. /Бифидобактерий: традиционный взгляд и современные генетические исследования. - Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.

Штамм Bifidobacterium angulatum OV-15 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №212. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, кислой среде, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. angulatum OV-15 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, что обеспечивает пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширяет арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. 4 табл.

Штамм Bifidobacterium angulatum OV-15, коллекционный номер № 212, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.