ШТАММ BIFIDOBACTERIUM PSEUDOCATENULATUM OV-2, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A61K35/74 A23L1/29 A61K8/99 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.

Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].

Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum.) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8].

Это дает основание считать, что при конструировании и назначении средств коррекции микрофлоры необходимо учитывать биоразнообразие видового состава бифидофлоры. Включение новых производственных штаммов бифидобактерий расширит номенклатуру и повысит эффективность разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-2, обладающего антагонистической активностью, устойчивостью к средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.

Штамм В. pseudocatenulatum OV-2 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под №211.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. pseudocatenulatum OV-2 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-2, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм В. pseudocatenulatum OV-2 в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам и органическим кислотам, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры. Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства

Клетки штамма В. pseudocatenulatum OV-2 представляют собой Грам + полиморфные, бесспоровые неподвижные палочки с утолщением на одном конце, расположенные одиночно, попарно или в виде китайских иероглифов. В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза, образуя колонии в виде «комет» с плотным ядром около 2 мм в диаметре и длинным вуалевидным хвостом длиной 1,5-2,0 см.

Физиолого-биохимические свойства

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания составляет 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислоты без образования газа, закисляет среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует лактозу, арабинозу, эскулин, вариабельно - галактозу. Не ферментирует мальтозу, фруктозу, мелецитозу, сахарозу, салицин, трегалозу, маннитол, рамнозу, маннозу, раффинозу, целлобиозу, сорбитол, на уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна.

Генотипирование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272010 и EU 272016.

Культуральные свойства

Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Таблица 1 Показатели содержания бифидобактерий и органических кислот при культивировании штамма В. pseudocatenulatum OV-2 на разных средах выращивания Питательная среда КОЕ/мл °T Среда для культивирования бифидобактерий (БС) 5,0×10⁹ 178 МРС 5,6×l0⁹ 205 Гидролизатно-молочная среда 6,0×l0⁹ 210 Печеночная среда 5,8×10⁹ 210 Молоко восстановленное обезжиренное 2,0×10⁸ 38

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. pseudocatenulatum OV-2 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10 КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко не сквашивает; при культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 36-38°Т.

Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот в процессе культивирования представлены в таблице 2.

Таблица 2 Динамика культивирования штамма В. pseudocatenulatum OV-2 Время выращивания после посева, (час) Культивирование на обезжиренном восстановленном молоке Культивирование на БС °T КОЕ/мл °T КОЕ/мл 0 18 5,0×10⁶ 44 2,1×10⁶ 2 18 6,0×10⁶ 48 3,0×10⁶ 4 20 7,5×10⁶ 52 2,0×10⁷ 6 20 1,1×l0⁷ 60 1,1×10⁸ 8 20 1,2×10⁷ 60 1,5×10⁸ 10 24 1,1×10⁷ 96 1,5×10⁸ 14 26 5,0×l0⁷ 102 1,6×10⁸ 16 28 5,0×10⁷ 100 5,0×10⁸ 18 30 1,0×10⁸ 150 1,0×10⁹ 20 32 1,0×10⁸ 172 1,0×10⁹ 22 37 1,2×10⁸ 174 1,2×10⁹ 24 38 2,0×10⁸ 178 5,0×10⁹ 30 38 2,0×10⁸ 178 5,0×10⁹

Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.

Таким образом, штамм В. pseudocatenulatum OV-2 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерий и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями.

Антагонистическая активность штамма изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (таблица 3).

Таблица 3 Антагонистическая активность штамма В. pseudocatenulatum OV-2 № Штамм тестируемого микроорганизма Зона задержки роста в присутствии штамма В. pseudocatenulatum OV-2, мм 1. Staphylococcus aureus ATCC 6538-P 23±3 2. Shigella flexneri 337 28±5 3. Shigella sonnei 177 25±5 4. Proteus vulgaris 1274 27±0 5. Escherichia coli 157 18±5

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. pseudocatenulatum OV-2 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.

Чувствительность к антибиотикам штамма В. pseudocatenulatum OV-2 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 Антибиотикочувствительность штамма В.pseudocatenulatum OV-2 № Наименование антибиотика Интерпретация зон, мм Содержание препарата в диске, мкг Диаметр зоны ингибирования роста,
мм Устойчив Промежуточно устойчив Чувствителен 1 Бензилпенициллин ≤19 20-27 ≥28 10 38±2 2 Оксациллин ≤10 11-13 ≥14 10 23±1 3 Ампициллин ≤10 11-14 ≥16 10 35±2 4 Карбенициллин ≤14 15-18 ≥19 25 35±0 5 Азлоциллин ≤13 14-16 ≥16 75 40±3 6 Цефалотин ≤14 15-18 ≥19 30 40±2 7 Цефалексин ≤14 15-18 ≥19 30 32±2 8 Цефазолин ≤14 15-18 ≥19 30 32±2 9 Цефтазидим ≤14 15-17 ≥18 30 30±0 10 Цефотаксим ≤14 15-20 ≥21 30 35±2 11 Имипенем ≤13 14-15 ≥16 10 35±2 12 Стрептомицин ≤16 17-19 ≥20 30 8±0 13 Неомицин ≤12 13-16 ≥17 30 10±0 14 Канамицин ≤14 15-18 ≥19 30 0±0 15 Гентамицин ≤12 13-14 ≥15 10 10±0 16 Амикацин ≤14 15-16 ≥17 30 0±0 17 Тетрациклин ≤16 17-21 ≥22 30 30±2 18 Доксициклин ≤15 16-19 ≥20 10 30±2 19 Эритромицин ≤17 18-21 ≥22 15 32±2 20 Азитромицин ≤13 14-17 ≥18 15 28±2 21 Кларитромицин ≤13 14-17 ≥18 15 35±3 22 Рокситромицин ≤13 15-18 ≥19 30 35±2 23 Линкомицин ≤19 20-23 ≥24 15 35±2 24 Клиндамицин ≤14 15-20 ≥21 2 40±2 25 Ванкомицин ≤14 15-16 ≥17 30 25±0 26 Хлорамфеникол (левомицитин) ≤15 16-18 ≥19 30 35±2 27 Рифампицин ≤12 13-15 ≥16 5 35±0 28 Полимиксин ≤11 12-14 ≥15 300 ед 0±0 29 Налидиксовая кислота ≤12 13-17 ≥18 30 8±0 30 Ципрофлоксацин ≤15 16-20 ≥21 5 22±2 31 Пефлоксацин ≤14 15-21 ≥22 10 15±0 32 Ломефлоксацин ≤18 19-21 ≥22 10 18±0

Как видно из таблицы 4, штамм В. pseudocatenulatum OV-2 устойчив к полимиксину, амикацину, канамицину, промежуточно устойчив к стрептомицину, неомицину, налидиксовой кислоте, гентамицину, пефлоксацину, ломефлоксацину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.

Безвредность

В опыте изучения острой токсичности штамма В. pseudocatenulatum OV-2 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5х10⁷ КОЕ на животное гибели мышей не отмечено.

Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. pseudocatenulatum OV-2 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.

Представленные данные изучения штамма В. pseudocatenulatum OV-2 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.

Пример 2. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 10^6-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.

Пример 3. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения бактерийного препарата.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при - 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10⁸ КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.

Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10⁹ КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси, из расчета получившейся массы, добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В 1 г БАД к пище содержится не менее 10 КОЕ жизнеспособных бифидобактерий.

Пример 5. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения гигиенических и косметических средств.

Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. pseudocatenulatum OV-2 с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.

Литература

1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.

2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.

3. Гончарова Г.И., Вильшанская Ф.Л., ж. Микробиол., 1968, №7, с.55.

4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.

5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.

6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. /Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004, 52 с.

8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. /Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.

Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №211. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, образует органические кислоты, обладает антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. pseudocatenulatum OV-2 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, что обеспечивает пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширяет арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. 4 табл.

Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2, коллекционный номер № 211, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.