СПОСОБ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МЕЛИОИДОЗА ИНКАПСУЛИРОВАННЫМИ АНТИГЕНАМИ Burkholderia pseudomallei Российский патент 2009 года по МПК A61K39/07 A61K9/127 A61K31/685 A61P31/04 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и иммунологии, и касается иммунопрофилактики мелиоидоза.

Мелиоидоз - потенциально смертельное инфекционное заболевание, вызываемое возбудителем Burkholderia pseudomallei, относящимся к группе особо опасных микроорганизмов. Несмотря на многолетние исследования отечественных и зарубежных ученых до настоящего времени вакцина против мелиоидоза не разработана. Поиски компонентов будущей вакцины среди различных антигенных комплексов клеточной стенки, цитоплазмы или экстрацеллюлярных метаболитов возбудителя мелиоидоза не привели к обнаружению высокопротективного антигена, способного стать основой вакцинного препарата. Выделенные разными методами антигенные мелиоидозные препараты, как правило, формировали низкий уровень защиты животных от экспериментальной инфекции (1).

В настоящее время в качестве основных иммуногенов потенциальной мелиоидозной вакцины наибольшее внимание привлекают поверхностные биополимеры возбудителя, принимающие участие в реализации вирулентных и патогенных свойств, однако и они не обладают высокой протективностью для экспериментальных животных. Таким образом, повышение протективности мелиоидозных антигенов составляет одну из актуальных проблем иммунологии мелиоидоза, успешное решение которой несомненно будет предшествовать созданию эффективной химической вакцины. Одним из современных подходов к повышению иммуногенных свойств антигенов является метод инкапсулирования антигенов в липосомы. Рядом авторов показана принципиальная возможность усиления иммуногенности и протективности антигенов различных возбудителей (бруцеллеза, синегнойной инфекции и др.) при включении их в липосомы (2, 3). Липосомы формируются из природных фосфолипидов, поэтому не оказывают раздражающего или токсического воздействия на организм. Мембрана липосом предохраняет инкапсулированное вещество от инактивации и быстрого разрушения во внутренней среде организма, что создает условия для пролонгированного воздействия включенного в липосомы антигена на иммунокомпетентные клетки и, следовательно, более выраженной стимуляции иммунного ответа.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа иммунопрофилактики экспериментального мелиоидоза является работа Пивня Н.Н. с соавт. (4), в которой при иммунизации мышей 9 из 10 выделенных хроматографических фракций водно-солевого экстракта (ВСЭ) возбудителя мелиоидоза, введенных в смеси с адъювантом Фрейнда, летальность животных после контрольного заражения 3-30

ЛД₅₀ вирулентной культуры составляла 70-100%.

Целью изобретения является разработка способа специфической профилактики экспериментального мелиоидоза, позволяющего повысить протективность мелиоидозных антигенов.

Поставленная цель достигается тем, что животных иммунизируют инкапсулированными в липосомы поверхностными мелиоидозными комплексами, а для усиления их иммуногенного действия применяют актопротектор бромантан.

Для включения в липосомы используют поверхностные антигенные мелиоидозные фракции Д, С, F, J, Н, полученные из ВСЭ возбудителя мелиоидоза. Липосомы готовят из хроматографически чистых фосфатидилхолина и холестерина в соотношении 7:3. Смесь липидов (40 мг) суспендируют в 2,0 мл 2% раствора дезоксихолата натрия в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, после чего добавляют 1,5 мл раствора антигена в 0,01М фосфатном буфере в концентрации 2 мг/мл. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком мощностью 200 Вт, частотой 20 кГц, в течение 3 мин, затем диализуют 4 раза по 2 ч против 200 мл 0,01М фосфатного буфера на магнитной мешалке для удаления дезоксихолата натрия. Образовавшиеся липосомы отделяют от невключившегося антигенного материала центрифугированием при 20000 об/мин в течение 1 ч. Осадок липосом с включенным антигеном ресуспендируют в 5 мл 0,01М фосфатного буфера. Данная методика обеспечивает 50% включение мелиоидозных антигенов в липосомы.

Для определения протективных свойств инкапсулированных мелиоидозных антигенов используют беспородных белых мышей массой 18-22 г. Животных иммунизируют смесью двух липосомальных антигенов в дозе по 30 мкг по белку каждый, подкожно, двукратно, с интервалом 10 дней. Одновременно с первичной и повторной иммунизацией мышам вводят внутрибрюшинно иммуномодулятор бромантан в дозе 1 мг. Спустя 14 сут после второй иммунизации мышей заражают подкожно суточной агаровой культурой вирулентного штамма возбудителя мелиоидоза в дозах 3 и 30 ЛД₅₀. Через 30 сут после заражения определяют показатели летальности мышей: процент павших и среднюю продолжительность жизни (СПЖ). Показатели летальности в опытной группе сравнивают с таковыми в контрольной группе интактных животных и делают вывод об уровне протективности инкапсулированных антигенов.

Пример 1

В процессе работы по получению иммуногенных мелиоидозных антигенов было проведено фракционирование ВСЭ возбудителя мелиоидоза штамма 111 методами гель-хроматографии и ионообменной хроматографии, в результате которого получены 10 антигенных фракций: А, В, С, C₁, Д, Е, F, G, H, J. Полученные фракции представляют собой гетерогенные макромолекулярные комплексы, состоящие из белков, гликопротеинов и фрагментов полисахарида. При испытании иммуногенных свойств мелиоидозных фракций на белых мышах было показано, что их протективная активность при изолированном применении в смеси 1:1 с адъювантом Фрейнда была невысокой: только 4 из 10 препаратов обладали способностью повышать выживаемость белых мышей от инфекции. Из них фракции В, С, C₁ повышали выживаемость животных от 3-30 ЛД₅₀ вирулентного мелиоидозного штамма С-141 на 25-38%, фракция Н - на 60% от небольшой заражающей дозы - 3 ЛД₅₀. Остальные фракции в той или иной степени повышали показатель СПЖ либо от двух заражающих доз - фракции В, G, J, либо от одной заражающей дозы - фракции А, Д, Е, F, Н (табл.1).

Мелиоидозные фракции, обнаружившие протективные свойства в опытах на мышах, испытывались нами в повторных опытах. Суммарные данные при использовании разных заражающих доз возбудителя мелиоидоза представлены в табл.2. Как видно из данных табл.2, испытанные фракции С, Д, C₁ и H, введенные животным в смеси с адъювантом Фрейнда, не обеспечивали достоверно значимого увеличения выживаемости животных, фракции Д, C₁ и Н способствовали лишь увеличению сроков СПЖ.

В связи с низкой протективностью антигенных фракций при их изолированном применении в последующих исследованиях были испытаны сочетания мелиоидозных фракций, обнаруживших ту или иную степень защиты. Сочетания антигенных фракций (каждая в дозе 30 мкг по белку) вводились подопытным белым мышам по 0,2 мл подкожно как в традиционной форме (в смеси 1:1 с адъювантом Фрейнда), так и в липосомальной по схеме двукратной иммунизацией (с интервалом 10 сут). Заражение иммунизированных животных проводили через 14 сут после повторной иммунизации суточной агаровой культурой вирулентного штамма С-141 возбудителя мелиоидоза. Через 30 сут после заражения определяли показатели летальности: процент погибших и СПЖ. Результаты опытов приведены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, липосомальные формы композиций мелиоидозных антигенов (Д+J, Д+F, J+F) по сравнению с их адъювантными формами обладали более высокими показателями протективности для белых мышей. Разница в показателях летальности при заражении 3 ЛД₅₀ вирулентного штамма С-141 составляла 20-30%, при заражении 30 ЛД₅₀ - 13-22%.

Пример 2

Для дополнительной стимуляции иммунного ответа на липосомальные антигены использовали иммуномодулятор бромантан в дозе 1 мг, который вводили животным одновременно с иммунизацией (как первичной, так и повторной) внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Бромантан относится к актопротекторам адамантанового ряда. Известно, что актопротекторы - препараты, вызывающие адаптацию человека к неблагоприятным воздействиям физических факторов, оказывают также иммуномодулирующий эффект. К ним относятся, в частности, адамантан- и имидазолсодержащие соединения. Данные препараты обладают широким спектром фармакологической активности (противоопухолевой, противовирусной, нейротропной, кардиотропной и др.), многие из них являются регуляторами гуморальных и клеточных процессов иммуногенеза (5, 6).

В табл.4. отражены результаты изучения влияния актопротектора бромантана на иммуногенность композиций инкапсулированных в липосомы мелиоидозных антигенов при заражении животных вирулентным штаммом 56830. Как следует из данных табл.4, иммунизация мышей композициями мелиоидозных антигенов в липосомальной форме (Д+С, J+H) повышала их резистентность к заражению 3-30 ЛД₅₀ возбудителя мелиоидоза штамма 56830 на 25-43% по сравнению с контрольной группой интактных животных. Использование для дополнительной стимуляции иммунного ответа бромантана приводило к увеличению выживаемости иммунизированных мышей на 25-30%. Иммунизация композициями липосомальных антигенов увеличивала показатели СПЖ животных, что было более выражено при использовании для стимуляции иммунного ответа бромантана.

Резюмируя полученные результаты, следует отметить, что протективность композиций мелиоидозных антигенов возрастает при их использовании для введения животным в липосомальной форме по сравнению с традиционной адъювантной формой на 20-30%. Включение в схему иммунизации липосомальными антигенами бромантана способствует увеличению выживаемости животных еще на 20-30%.

Предлагаемый способ может использоваться в учреждениях, занимающихся разработкой средств специфической профилактики особо опасных инфекций, для повышения протективности антигенных препаратов, перспективных для конструирования химической мелиоидозной вакцины.

ЛИТЕРАТУРА

1. Иммунология мелиоидоза / Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C., Жукова С.И., Авророва И.В. // Мелиоидоз: Сб. науч. тр. Волгоград. н.-и. противочум. ин-та. - Волгоград: Нижне-Волжское книжное изд-во, 1995. - С.119-141.

2. Минухин Б.В., Бродинова Н.С., Цыганенке А.Я. с соавт. Иммуногенные свойства липосомальной формы анатоксина синегнойной палочки // Вестник АМН СССР. - 1990. - №8. - С.44-47.

3. Куликов В.Н., Кашкин К.П., Драновская Е.А. Включение протективного антигена Br.abortus в липосомы и иммуногенные свойства антигенсодержащих липосом // Ж. микробиол. - 1985. - №12. - С.69-72.

4. Пивень Н.Н., Рыбкин B.C., Плеханова Н.Г. с соавт. Иммунотропность и иммуногенность поверхностных и мембранных антигенов Burkholderia pseudomallei // Ж. микробиол. - 2001. - №1. - С.29-33.

5. Исследование иммуномодулирующей активности имидазолсодержащих полиэлектролитов / Манько В.М., Руднева Т.Б., Гаджиев Р.И. и др. // Иммунология. - 1990. - №5. - С.63-66.

6. Экспериментальное изучение иммунотропной активности нового лекарственного препарата кемантана / Арцимович Н.Т., Фадеева Т.А., Галушина Т.С. и др. // Иммунология. - 1990. - №6. - С.21-23.

Таблица 1 Протективная активность поверхностных антигенных комплексов возбудителя мелиоидоза для белых мышей №№ п/п Антигенные фракции Летальность при заражении B.pseudomallei С-141: 3 ЛД₅₀ 30 ЛД₅₀ пало/взято % павших СПЖ пало/взято % павших СПЖ 1 А 8/9 88 14,5* 9/9 100 8,0 2 В 6/8 75 14,6* 5/5 100 14,4* 3 С 7/10 70 14,0 7/7 100 12,8 4 C₁ 6/8 75 12,0 5/8 62 10,0 5 Д 6/7 85 15,6* 8/9 88 10,3 6 Е 10/10 100 12,6 8/8 100 14,0* 7 F 10/11 90 8,9 8/9 88 13,5* 8 G 10/10 100 14,4* 6/7 85 13,5* 9 Н 4/10 40* 10,2 9/10 90 14,1* 10 J 8/8 100 14,2* 9/10 90 14,1* 11 Контроль (интактные) 8/8 100 10,1 8/8 100 9,3 * - здесь и далее различия с контролем статистически достоверны (≤0,05)

Таблица 2 Протективная активность некоторых поверхностных мелиоидозных комплексов для белых мышей Антигенные комплексы Летальность при заражении B.pseudomallei С-141: 7 ЛД₅₀ 70 ЛД₅₀ пало/взято % павших СПЖ пало/взято % павших СПЖ С 5/6 83,3 8,6 6/6 100 9,7 Д 5/6 83,3 14,8* 5/5 100 9,6 Контроль (интактные) 6/6 100 8,5 6/6 100 13,0   20ЛД₅₀ 200ЛД₅₀ С₁ 9/9 100 22,9* 8/8 100 15,5* Н 8/9 88,9 18,0 8/8 100 18,1* Контроль (интактные) 6/6 100 18,3 6/6 100 11,3

Таблица 3 Протективная активность адъювантной и липосомальной форм композиций мелиоидозных антигенов для белых мышей №№ п/п Препараты для иммунизации Летальность при заражении B.pseudomallei С-141: 3 ЛД₅₀ 30 ЛД₅₀ пало/взято % павших СПЖ пало/взято % павших СПЖ 1 Д+J 6/10 60 12,7 4/9 44 9,8 2 (Д+J)л 3/10 30 16,4* 2/9 22 13,4* 3 Д+F 4/10 40 13,1 5/10 50 11,6 4 (Д+F)л 2/10 20 17,2* 4/11 36 14,3* 5 J+F 5/9 55 15,2 4/10 40 13,8* 6 (J+F)л 3/9 33 17,1* 3/11 27 17,6* 7 Контроль (интактные) 10/10 100 9,3 10/10 100 8,4 л - липосомальная форма антигенов

Таблица 4 Влияние актопротектора бромантана на иммуногенность инкапсулированных мелиоидозных антигенов для белых мышей №№ п/п Препараты для иммунизации Летальность при заражении B.pseudomallei 56830: 3 ЛД₅₀ 30 ЛД₅₀ пало/взято % павших СПЖ пало/взято % павших СПЖ 1 (Д+С)л 3/8 37 15,6 4/8 50 12,8 2 (Д+С)л+ бромантан 1/8 12 18,2* 2/8 25 15,6* 3 (J+Н)л 5/9 55 16,2 6/10 60 13,8 4 (J+H)л+ бромантан 2/8 25 19,1* 3/9 33 17,1* 5 Контроль (интактные) 8/10 80 13,1 10/10 100 9,3

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для иммунопрофилактики мелиоидоза. Способ включает предварительное введение антигенов мышам с последующим заражением и оценкой уровня протективности. В качестве антигенов Burkholderia pseudomallei используют антигены, выбранные из поверхностных антигенных фракций: D, C, F, J, H, при этом 1,5 мл раствора антигена смешивают с 40 мг фосфатидилхолина и холестерина в соотношении 7:3 для получения липосом. Использование изобретения позволяет повысить выживаемость лабораторных животных при заражении мелиоидозом за счет увеличения протективности мелиоидозных антигенов, инкапсулированных в липосомы. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ иммунопрофилактики экспериментального мелиоидоза инкапсулированными антигенами Burkholderia pseudomallei, включающий предварительное введение антигенов мышам с последующим заражением и оценкой уровня протективности, отличающийся тем, что в качестве антигенов Burkholderia pseudomallei используют антигены, выбранные из поверхностных антигенных фракций: D, C, F, J, H, при этом 1,5 мл раствора антигена смешивают с 40 мг фосфатидилхолина и холестерина в соотношении 7:3.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что мышам вводят смесь из двух инкапсулированных антигенов, дважды, с интервалом 10 суток, подкожно, каждый в дозе 30 мкг по белку и одновременно вводят актопротектор бромантан внутрибрюшинно в дозе 1 мг, при этом заражение мышей вирулентным штаммом возбудителя мелиоидоза в дозе 3-30 ЛД₅₀ проводят через 14 суток после второй иммунизации и через 30 суток после заражения оценивают уровень протективности антигенов по показателям летальности.