СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/104 A61P37/06 

Изобретение относится к медицине и касается капсульного антигена возбудителя мелиоидоза гликопротеиновой природы с молекулярной массой 200 kDa, продуцируемого только вирулентными инкапсулированными штаммами этого микроорганизма, и обладающего высокой антифагоцитарной активностью, что может использоваться при дифференциации типичных вирулентных (инкапсулированных) и атипичных авирулентных (бескапсульных) штаммов возбудителя мелиоидоза, разработке специфических средств идентификации B.pseudomallei и изучении иммунного ответа макроорганизма при мелиоидозе.

Известны поверхностные антигенные комплексы возбудителя мелиоидоза, связанные с вирулентностью, иммунологической активностью и внутривидовой дифференциацией штаммов возбудителя мелиоидоза.

Так, описан способ получения мелиоидозного аллергена, представляющий собой комплекс из поверхностных антигенов 2, 3, 6, d, g, j (Замарин А.Е., Пивень Н.Н. Способ получения мелиоидозного аллергена //Авторское свидетельство №1621229. - 1990). Химический состав данных антигенов не изучен. Аллерген характеризуется высокой иммунологической активностью при выявлении реакции гиперчувствительности замедленного типа макрорганизма. Однако иммуносупрессивным действием данный антигенный комплекс не обладает, не является протективным антигеном и маркером для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза по уровню вирулентности.

Известен способ выделения поверхностного антигена 6 (Аг6) Burkholderia pseudomallei, синтез которого резко снижается при пассировании культур на чувствительных к мелиоидозу животных, Аг6 рассматривается как эпидемиологический маркер, по наличию или отсутствию которого можно дифференцировать штаммы азиатского и австралийского сероваров (Храпова Н.П. и др. Способ выделения антигена 6 возбудителя мелиоидоза //Патент на изобретение №2004250. - 1994). Однако механизм участия Аг6 в проявлении патогенных свойств возбудителя мелиоидоза не установлен и, следовательно, невозможна дифференцировка штаммов по их вирулентности, Аг6 не обладает иммуносупрессивной активностью, а его химический состав не известен.

Наиболее близкого аналога нами не установлено. В связи с этим необходима эффективная технология получения капсульного антигена, обладающего антифагоцитарной функцией с установлением его природы и основных физико-химических свойств. Необходимость получения данного биополимера продиктована возможностью дифференциации типичных вирулентных штаммов Burkholderia pseudomallei, относящегося ко II группе патогенности микроорганизмов, от авирулентных, а также изучения патогенетических аспектов развития мелиоидозной инфекции. Кроме того, он может быть апробирован при моделировании специфического вакцинального процесса как в качестве иммуносупрессора, так и в качестве модифицированного иммуномодулятора.

Целью изобретения является выделение и характеристика капсульного антигена возбудителя мелиоидоза, обладающего антифагоцитарным действием и присущего типичным вирулентным культурам Burkholderia pseudomallei.

Цель достигается тем, что из микробных клеток вирулентного штамма возбудителя мелиоидоза путем водно-солевой экстракции и последующей гель- и ионообменной хроматографии приготавливают препарат капсульного гликопротеина, обладающего антифагоцитарным действием со следующими физико-химическими характеристиками:

Углеводы - 90%

Белок - 10%

Азот - 2.17%

Углерод - 46.40%

Водород - 8.09%.

Молекулярная масса (м.м.) - 200 kDa

Пример 1. Получение и характеристика капсульного антигена. Вирулентный штамм В.pseudomallei 111 культивируют в течение 48 ч при 37°С на поверхности питательного агара рН 7.2. Выросшие микробные клетки суспендируют в 0.15 М растворе NaCl и инактивируют охлажденным (-30°С) ацетоном с последующим полным высушиванием клеток. Из сухих клеток готовят водно-солевой экстракт, после чего его подвергают гель-хроматографии на колонке со смесью носителей TSK-65F(66%) и TSK-75F(33%) и элюцией раствором, включающим в себя 0.3 М NaCl, 0.05 М фосфатного буфера, 0.02% азида натрия. Содержимое первого пика концентрируют на фильтре РМ-10. Полученный материал фракционируют ионообменной хроматографией на колонке с DEAE-Sephadex А-50 в Cl-форме, уравновешенной 0.05 М Трис-НСl буфера рН 7.7, применяя для десорбции ступенчатый градиент NaCl в исходной буферной системе - 0.1-0.2 - 0.3-1.0 М. Элюент второго пика (0.2 М) концентрируют и хроматографируют при помощи DEAE-Sephadex А-50 в OН-форме с элюцией линейным градиентом NaOH от 0.0 до 0.05 М в дистиллированной воде. Искомый биополимер элюируется при 0.02 М концентрации NaOH отдельным пиком и представляет собой гликопротеин с соотношением углеводов и белка 9:1 и молекулярной массой 200 kDa. Гликопротеин активен в иммунологических реакциях, в ДСН-ПААГ электрофорезе и иммуноблотинге представлен одной полосой в верхней части геля.

Пример 2. Сравнительное изучение вирулентности инкапсулированных клеток (200 kDa+) и бескапсульных клеток (200 kDa-) В. pseudomallei.

С этой целью используют односуточные культуры типичного вирулентного штамма В.pseudomallei 111 и его бескапсулъного варианта 111-12-2, полученного методом селекции и находящегося в коллекции культур патогенных микроорганизмов Волгоградского НИПЧИ; регистрационный №3. Культуры выращивают на питательном агаре рН 7.2, после чего в физиологическом растворе эмульгируют агаровую культуру и суспензию клеток вводят белым мышам в дозах 1×10¹, 1×10³, 1×10⁵, 1×10⁷ м.к. внутрибрюшинно. Заражают по 10 животных на дозу и наблюдают их в течение месяца, после чего производят учет павших и выживших. При этом устанавливают, что LD₅₀ для инкапсулированных штаммов составляет 1×10² м.к., тогда как для бескапсульных вариантов даже в дозе 1×10⁷ м.к. гибель животных не наблюдается.

Пример 3. Выявление капсульного антигена на клетке возбудителя мелиоидоза.

Локализацию капсульного антигена устанавливают при помощи электронно-иммуноцитохимического метода. С этой целью клетки отмывают ФБР рН 7.2 и фиксируют 2.5% глютаровым альдегидом на 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2, после чего добавляют поликлональные иммуноглобулины (Иг) к антигену 200 kDa (Aг 200 kDa), в концентрации 2.5 мг/мл, маркированные пероксидазой. После инкубации при 37°С в течение 1 ч клетки отмывают. В качестве субстрата используют 3,3 диаминобензидин ("Serva"). Препараты дополнительно фиксируют раствором 1% четырехокиси осьмия и заключают в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы окрашивают последовательно уранилацетатом, цитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе.

На ультратонких срезах бактериальных клеток возбудителя мелиоидоза выявляется четкое диффузное капсулоподобное образование на клетках, обусловленное специфическим пероксидазным маркером. В срезах неинкапсулированных авирулентных клеток капсульный Аг 200 kDa не обнаруживается (фиг.1).

Пример 4. Антифагоцитарная активность капсульного антигена.

Функциональную активность фагоцитов изучают при помощи хемилюминесцентного метода. С этой целью в полиэтиленовые пробирки в трех повторностях вносят по 350 мкл раствора люминола в ФБР рН 7.2 в концентрации 10^-4-10^-5 М, 50 мкл бактериальной взвеси с концентрацией 2×10⁹ мк/мл и 90 мкл 2.5-5×10⁶ фагоцитов/мл. Изучению подвергают инкапсулированный вирулентный штамм B.pseudomallei 111 и его бескапсульный вариант B.pseudomallei 111-12-2. Параллельно исследуют фагоцитабельность с добавлением к клеткам последнего Aг 200 kDa до концентрации 10 мкг/мл. Пробирки инкубируют при 37°С. Измерение хемилюминесценции проводят на люминометре LKB 1250 ("LКВ", Швеция) в затемненном помещении каждые 10 мин. Результаты хемилюминесценции показывают (фиг.2), что уровень фагоцитабельности клеток авирулентного штамма находится на высоком уровне в сравнении с инкапсулированными клетками. Вместе с тем, добавление в реакционную смесь Аг 200 kDa (10 мкг) резко снижает фагоцитабельность клеток безкапсульного варианта, приводя ее к уровню фагоцитабельности вирулентного штамма, что свидетельствует о выраженном иммуносупрессивном действии капсульного антигена возбудителя мелиоидоза.

Пример 5. Дифференциация инкапсулированных (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) вариантов B.pseudomallei.

Производят посев исследуемых микроорганизмов в пробирки со скошенным питательным агаром рН 7.2, культивируют при 37°С в течение 24 ч, после чего производят смыв биомассы 1.0 мл физиологического раствора и полученные суспензии клеток переносят в термостойкие пробирки. Последние подвергают тепловой обработке на водяной бане при 100°С в течение 15 мин с целью инактивации микроорганизмов (капсульный антиген является термостабильным). Предварительно в чашке Петри формируют 3 мм слой 1% агара или агарозы на физиологическом растворе, пробивают лунки диаметром 2.5 мм с расстоянием между лунками 3 мм. В периферические лунки вносят до краев прогретые суспензии исследуемых штаммов возбудителя мелиоидоза, а в центральную лунку - поликлональные Иг к Аг 200 kDa или Иг к цельным клеткам. Результаты оценивают через 24 ч по формированию или отсутствию зон преципитата. В случае использования Иг к Аг 200 kDa формирование преципитата означает наличие капсульного антигена в исследуемой суспензии; в случае применения Иг к цельным клеткам обнаружение преципитата у лунки с антигеном также указывает на присутствие Аг 200 kDa, т.е. клетки относятся к инкапсулированному варианту возбудителя мелиоидоза. Отсутствие специфического преципитата свидетельствует о том, что исследуемый штамм является бескапсульным.

Таким образом, полученный капсульный антиген представляет собой очищенный гликопротеин с соотношением углевод/белок 9:1 и молекулярной массой 200 кDа, входящий в капсулу и ассоциированный с вирулентностью за счет антифагоцитарной активности и пригодный для дифференциации инкапсулированных (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) вариантов возбудителя мелиоидоза, изучения патогенеза мелиоидоза и разработки идентификационных средств для оценки состояния иммунной системы макроорганизма при мелиоидозе.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения капсульного антигена возбудителя мелиоидоза, обладающего антифагоцитарной активностью. Сущность изобретения заключается в выращивании культуры В. pseudomallei, инактивировании, выделении гликопротеина методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии при получении гликопротеина с м.м. 200 кДа, состоящего из 90% углеводов, 10% белка, 2,17% азота, 46,4% углерода, 8,09% водорода. Преимущество изобретения заключается в получении очищенного гликопротеина, обладающего антифагоцитарной активностью. 2 ил.

Способ получения капсульного антигена возбудителя мелиондоза, обладающего антифагоцитарной активностью, включающий выращивание культуры В. pseudomallei на агаризованной питательной среде, приготовление водно-солевого экстракта из инактивированной 48-часовой агаровой культуры и выделение гликопротеина его гель-фильтрацией на колонке со смесью носителей TSK-65F(66%) и TSK-75F(33%), элюцией 0.3 М NaCl в 0.05 М фосфатном буфере, содержащем 0.02% азида натрия, ионообменной хроматографии на DEAE-сефадексе А-50 в Cl-форме, уравновешенном 0.05 М трис-НСl буфером, рН 7.7 с концентрацией NaCl 0.2 М, последующей ионообменной хроматографией на DEAE-сефадексе А-50 в ОН-форме с элюцией 0.02 М NaOH в дистиллированной воде с получением гликопротеина с молекулярной массой 200 кДа, состоящей из 90% углеводов, 10% белка, 2.17% азота, 46.4% углерода и 8.09% водорода.