СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНОВ B. pseudomallei ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МЕЛИОИДОЗЕ Российский патент 2013 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и иммунологии, и касается способа повышения иммуногенности антигенов возбудителя мелиоидоза - Burkholderia pseudomallei.

Мелиоидозная инфекция, эндемичная для стран Юго-Восточной Азии, представляет потенциальную опасность и для нашей страны вследствие бурного роста разнообразных туристических, экономических, культурных связей между разными регионами мира в современных условиях глобальной интеграции. Не следует также забывать о том, что мелиоидоз является, по данным международных экспертов, возможным оружием при биотеррористических атаках [1].

Как известно, специфическая профилактика мелиоидоза пока не разработана, что в значительной мере связано с низкой протективностью мелиоидозных антигенов. В связи с этим актуальной задачей является поиск средств и методов повышения иммуногенных и протективных свойств антигенов В.pseudomallei. Одним из современных подходов к решению этой задачи является использование препаратов рекомбинантных цитокинов. По данным ряда зарубежных исследователей цитокины играют существенную роль в патогенезе мелиоидоза и, прежде всего, Th1-цитокины, отвечающие за формирование преимущественно клеточного типа иммунного ответа [2, 3, 4, 5]. Клинически доказана высокая терапевтическая эффективность препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) при их совместном применении с антибиотиками в лечении острого мелиоидоза у людей [6]. В экспериментальных условиях получены убедительные данные по стимуляции с помощью ИЛ-1 резистентности мышей к псевдотуберкулезной инфекции [7]. Нами ранее показана возможность стимуляции поствакцинального иммунитета к мелиоидозным антигенам с помощью цитокинов ИФН-γ и ИЛ-2, вводимых совместно с антигенами при первичной (ИФН-γ) и вторичной (ИЛ-2) иммунизации [8]. Данная работа является наиболее близким аналогом предлагаемому способу стимуляции иммуногенности антигенов В. pseudomallei.

Целью изобретения является усиление иммуногенности мелиоидозных антигенов при экспериментальном мелиоидозе за счет инкапсулирования антигенов в липосомы и использования пептидного иммунорегулятора бестим.

Поставленная цель достигается тем, что при первичной и вторичной иммунизации липосомальными мелиоидозными антигенами вместе с цитокинами (ИФН-γ и ИЛ-2) дополнительно вводится препарат бестим, что обеспечивает более высокий уровень реагирования систем клеточного иммунитета и обеспечивает повышение иммуногенных и протективных свойств антигенов.

Для иммунизации мышей применяют поверхностный антигенный комплекс, в частности смесь антигена 6 и антигена d (АГ6+d), который предварительно инкапсулируют в липосомы таким образом, чтобы включение антигенного материала составляло не менее 80%. Антигенный липосомальный комплекс вводят мышам подкожно в дозе 40 мкг по белку двукратно с интервалом 10 сут. Препараты рекомбинантных цитокинов вводят животным подкожно одновременно с иммунизацией мелиоидозными антигенами и в последующие 2 сут, при первичной иммунизации используют ИФН-γ (ингарон) в дозе 20 ME, при вторичной - ИЛ-2 (ронколейкин) в дозе 1 мкг. Иммуномодулятор бестим вводят подкожно вместе с цитокинами в дозе 0,07 мкг. О влиянии данной схемы стимуляции на иммуногенные свойства антигенов судят по реакциям клеточного иммунитета (уровень ГЗТ) и макрофагальной системы (фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов-ПМ) в динамике иммунного ответа на 8 и 18 сут после первичной иммунизации. Для оценки протективности антигенов животных заражают спустя 21 сут после первичной иммунизации вирулентной культурой В. pseudomallei 100. За животными наблюдают 30 сут, затем рассчитывают показатели летальности: процент погибших и среднюю продолжительность жизни (СПЖ), по которым судят о протективности мелиоидозных антигенов.

Пример 1

Схема профилактики экспериментального мелиоидоза, разработанная нами ранее, включает использование в процессе иммунизации вместе со специфическими антигенами препаратов рекомбинантных цитокинов [8].

Дальнейшее усовершенствование этой схемы шло по пути увеличения как иммуногенности самих антигенов путем использования их в более иммуногенной липосомальной форме, так и по пути усиления ответной реакции иммунной системы животных на введение антигенов за счет использования новых современных иммуномодуляторов (ИМ).

По данным ряда авторов включение антигенов в липосомы способствует усилению их иммуногенных и протективных свойств, что было показано и в отношении антигенов возбудителей особо опасных инфекций [9], в том числе и антигенов возбудителя мелиоидоза [10]. В качестве ИМ нами были испытаны препараты бестим и имунофан. Бестим - дипептид, состоящий из глутамина и триптофана, соединенных между собой γ-связью (γ-Д-глутамил-L-триптофан), обладает способностью вызывать дифференцировку Th1-лимфоцитов и стимулировать продукцию ИЛ-2 и ИФН-γ [11]. Препарат имунофан-синтетический гексапептид по механизму действия близок к бестиму [12].

В наших экспериментах в сравнительном плане большую иммунологическую эффективность показал иммуномодулятор бестим. При включении его в схему иммунизации (однократное введение при первичной и вторичной иммунизации) отмечена положительная динамика изменения показателей клеточного иммунитета и фагоцитарной активности макрофагов мышей на 8 и 18 сут наблюдения после первичной иммунизации. Результаты экспериментов приведены в таблицах 1, 2. Как видно из данных таблицы 1, мелиоидозный комплекс АГ6+d как в исходной, так и в липосомальной форме и в различных сочетаниях (с бестимом, с цитокинами) уже на 8 сут после иммунизации формирует у мышей отчетливую ГЗТ (р<0,05). При этом уровни ГЗТ во всех группах достоверно не различаются между собой за исключением мышей, получавших цитокины совместно с бестимом: степень ГЗТ у мышей данной группы была достоверно выше, чем у привитых только липосомальными антигенами (р<0,05). Высокий уровень ГЗТ у мышей, стимулированных цитокинами и бестимом, сохранялся и на 18 сут наблюдения (р<0,05). Аналогичная динамика зарегистрирована и при изучении фагоцитарных показателей иммунизированных животных (табл.2). Включение АГ6+d в липосомы, а также дополнительное воздействие бестимом и цитокинами существенно увеличивало фагоцитарную активность ПМ по отношению к изолированной иммунизации только липосомальными антигенами уже на 8 сут наблюдения (р<0,05), причем эти различия сохранялись и на 18 сут наблюдения. Следует обратить особое внимание на то, что включение бестима в схему иммунизации приводило уже на ранних этапах иммуногенеза (на 8 сут) к существенному росту уровня ГЗТ и фагоцитарной активности ПМ, в то время как использование ранее разработанной нами схемы стимуляции с цитокинами [8] способствовало достоверному повышению показателей клеточного иммунитета только к концу периода иммуногенеза (на 18 сут наблюдения) (табл.1, 2). Раннее формирование защитных клеточных реакций, обусловленное ранним цитокиновым провоспалительным ответом, по данным ряда авторов, имеет определяющее значение в резистентности к мелиоидозной инфекции и защите макроорганизма от развития неблагоприятной острой формы болезни [13, 14, 15].

Изучение протективности мелиоидозных антигенов, введенных с использованием разных схем стимуляции, показало, что АГ6+d в дозе 40 мкг обладал низкой протективностью, превышающей таковую в контрольной группе интактных мышей на 11,3% (табл.3). Выживаемость мышей возрастала на 18,7% при использовании антигенов в липосомальной форме. Более существенное увеличение выживаемости отмечено при стимуляции иммунизированных животных цитокинами совместно с бестимом, при этом выживаемость превышала контрольные показатели у интактных мышей на 50,6% (р<0,05). Показатель СПЖ в группе мышей, получавших цитокины и бестим, также был достоверно выше, чем в контроле (р<0,05), причем сохранялся на повышенном уровне и при заражении более высокой дозой возбудителя мелиоидоза (20 ЛД₅₀).

Таким образом, использование мелиоидозных антигенов в липосомальной форме в сочетании с дополнительным введением в схему иммунизации бестима способствовало существенному росту иммунологических показателей иммунизированных животных уже на ранних этапах иммуногенеза и повышению протективности антигенов.

Учитывая, что в защите от мелиоидоза первостепенное значение имеют клеточные механизмы иммунитета, становится понятным стимулирующее действие бестима при включении его в схему иммунизации мелиоидозными антигенами. Являясь синтетическим аналогом одного из активных центров гормона тимуса тимопоэтина, бестим индуцирует дифференцировку предшественников Т-лимфоцитов. Кроме того, за счет способности бестима повышать продукцию ИФН-γ и ИЛ-2 в организме животных происходит дополнительная эндогенная стимуляция этими важнейшими цитокинами как ранних клеточных реакций за счет ИФН-γ, так и процессов накопления специфических Т-эффекторов за счет ИЛ-2. Использование мелиоидозных антигенов в более иммуногенной липосомальной форме в сочетании с иммуностимуляцией цитокинами и бестимом способствует существенному повышению иммуногенности и протективности мелиоидозных антигенов.

Пример 2

В экспериментах на белых мышах нами было установлено, что включение бестима в схему иммунизации мелиоидозными антигенами приводило к стимуляции иммуногенных и протективных свойств антигенов, причем бестим в данной схеме применялся однократно при первичной и однократно при вторичной иммунизации. Нами была проведена серия экспериментов по изучению влияния кратности введения бестима на иммуногенность мелиоидозных антигенов. В этих опытах в качестве препарата сравнения был использован иммуномодулятор имунофан. Животных иммунизировали дважды с интервалом 10 сут инкапсулированными мелиоидозными антигенами совместно с цитокинами, а иммуномодулирующие пептиды бестим и имунофан вводили однократно (при первичной и при вторичной иммунизации), двукратно или трехкратно. При однократной стимуляции разовая доза бестима (она же курсовая) составляла 0,2 мкг/мышь, при двукратной - 0,1 мкг, при трехкратной - 0,07 мкг. Разовая доза имунофана при 1-2-3-кратном применении составляла 0,02 мкг/мышь. Показатели иммунитета определялись у животных на 18 сут после первичной иммунизации. Полученные результаты отражены в таблицах 4, 5. Согласно данным таблицы 4 более высокие показатели, характеризующие клеточный иммунитет, зарегистрированы при использовании бестима по сравнению с имунофаном. При этом трехкратное введение бестима мышам обеспечивало явные преимущества по сравнению с одно- или двукратной стимуляцией (р<0,05). Определение уровня хемилюминесцентного ответа ПМ мышей на зимозан подтвердило большую эффективность трехкратного введения бестима в обеспечении эффективной стимуляции процесса фагоцитоза, при этом фагоцитарная активность ПМ мышей достоверно превосходила таковую при одно- и двукратном введении препарата (табл.5).

При изучении протективности антигенов, стимулированных по данным схемам, было показано, что при 1-3-кратной стимуляции иммуногенеза бестимом и при 1-2 кратной стимуляции имунофаном выживаемость животных от 10 ЛД₅₀ В. pseudomallei превышала таковую у контрольных животных и составляла 43-61,5% при использовании бестима и 41,7-50% - при введении имунофана. Самый низкий показатель летальности (38,5%) отмечен в группе животных с трехкратной стимуляцией бестимом.

Таким образом, бестим проявил более выраженные иммуностимулирующие свойства по отношению к мелиоидозным антигенам, чем имунофан. В данных опытах определена оптимальная схема применения бестима - трехкратное введение при первичной и при вторичной иммунизации вместе с цитокинами, позволяющая существенно повысить иммуногенные и протективные свойства мелиоидозных антигенов.

Приведенные примеры показывают, что предлагаемый способ стимуляции иммуногенности антигенов В. pseudomallei позволяет уже на ранних этапах иммуногенеза значительно повысить иммунологические показатели, характеризующие состояние Т-клеточного иммунитета, что способствует увеличению выживаемости животных при заражении высоковирулентной культурой возбудителя мелиоидоза. Предлагаемый способ может использоваться в учреждениях, занимающихся разработкой средств специфической профилактики особо опасных инфекций.

ЛИТЕРАТУРА

1. Организация ликвидации медико-санитарных последствий биологических, химических и радиационных террористических актов. Практическое руководство. // Москва, ФГУ «ВЦМК «Защита». - 2005. - 328 с.

2. Elevated plasma concentrations of interferon (IFN)-gamma and IFN-gamma-inducing cytokines interleukin (IL)-18, IL-12 and IL-15 in severe melioidosis / Lauw F.N., Simpson A.J., Prins J.M. et al. // J. Infect. Dis. - 1999. - V.180, N.6. - P.1878-1885.

3. Prognostic value of cytokine concentrations (tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6 and interleukin-10 and clinical parameters in severe melioidosis / Simpson A.J., Smith M.D., Weverling G.J. et al. // J. Infect. Dis. - 2000. - V.181, N.2. -P.621-625.

4. Ulett G.C., Ketheesan N., Hirst R.G. Proinflammatory cytokine mRNA responses in experimental Burkholderia pseudomallei infection in mice // Acta Trop. - 2000. - V.74, N.2-3. - P.229-234.

5. Koo G.C., Gan Y.H. The innate interferon gamma response of BALB/c and C57B 1/6 mice in vitro Burkholderia pseudomallei infection // BMC Immunology. - 2006. - N.7. - P.19.

6. Cheng A.C., Stephens D.P., Anstey N.M., Currie B.Y. / Adjunctive granulocyte colonystimulating factor for treatment of septic shock due to melioidosis // Clin.Infect.Dis. - 2004. - №38(1). P.32-37.

7. Зезюлин П.Н., Минаева Е.Н., Синкевич И.Е., Симбирцев A.C. Изучение противоинфекционного защитного действия рекомбинантного интерлейкина-1 бета на модели летальной бактериальной инфекции. // Мед. иммунол. - 2005. - Т.7, №2-3, С.299.

8. Жукова С.И., Демьянова О.Б., Авророва И.В., Алексеев В.В., Храпова Н.П., Ломова Л.В. Способ повышения протективности мелиоидозных антигенов цитокинами. // Патент на изобретение №2376031. Зарегистр.в Госреестре изобретений РФ 20.12.2009 г

9. Куликов В.Н., Кашкин К.П., Драновская Е.А. Включение протективного антигена Br. abortus в липосомы и иммуногенные свойства антигенсодержащих липосом. // Ж. Микробиол. - 1985. - №12. - С.69-72.

10. Повышение протективности мелиоидозных антигенов за счет их включения в липосомы / Жукова С.И., Рыбкин B.C., Пивень Н.Н., Авророва И.В., Ротов К.А., Прошина О.Б. // Медицинская микробиология-XXI век, Саратов, 2004. Материалы Всероссийской науч.-практич. конф. (28-20 сентября 2004 г.). Саратов, С.96

11. Изучение иммуномодулирующей активности нового пептидного соединения бестима. / Н.В.Пигарева, A.C.Симбирцев, А.А.Колобов // Иммунология, 2000, №1, С.33-35.

12. Лебедев В.В. Имунофан - синтетический пептидный препарат нового поколения: иммунологические и патогенетические аспекты клинического применения. // Иммунология. - 1999. - №1. - С.25-30.

13. Demonstration of a cell-mediated immune response in melioidosis / Ketheesan N., Bames J.L., Ulett G.C. et al. // J. Infect. Dis. - 2002. - V.186, N.2. - P.286-289.

14. Adaptive immunity in melioidosis: a possible role for Т cells in determining outcome of infection with Burkholderia pseudomallei / Bames J.L., Wamer J., Melrose W. et al. // Clin. Immunol. - 2004. - V.113, N.1. - P.22-28.

15. Role of Т cells in innate and adaptive immunity against murine Burkholderia pseudomallei infection / Haque A., Easton A., Smith D. et al. // J. Infect. Dis. - 2006. - V.193, N.3. - P.370-379.

Таблица 1 Уровень реакции ГЗТ мышей, иммунизированных мелиоидозными антигенами в сочетании с бестимом и цитокинами № п/п Препараты для иммунизации Индекс реакции ГЗТ, % 8 сут 18 сут 1 АГ 16,02±1,64 20,31±1,74 2 АГл 19,6±1,93 25,73±1,92 3 АГл+ бестим 20,4±1,58 31,29±2,61 4 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2 22,9±2,04 37,53±1,76* 5 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2+ бестим 25,02±1,48* 35,67±2,08* 6 Контроль (интактные) 5,4±0,9 6,2±1,01 * - различия достоверны по отношению к группе мышей, иммунизированных АГл (р<0,05). ** - здесь и далее АГл - липосомальная форма АГ.

Таблица 2 Фагоцитарная активность ПМ мышей после введения липосомальных мелиоидозных антигенов совместно с бестимом и цитокинами № п/п Препараты для иммунизации Уровень хемилюминесценции ПМ (mV) 8 сут 18 сут 1 АГ 8,36±1,82 13,2±1,83 2 АГл 13,16±1,96 15,7±1,72 3 АГл+бестим 16,87±2,01 18,4±2,1 4 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2 18,92±1,65 36,82±2,08* 5 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2+бестим 28,4±3,51* 34,5±1,68* 6 Контроль (интактные) 5,73±1,26 7,2±1,94 * - различия достоверны по отношению к группе мышей, иммунизированных АГл (р<0,05)

Таблица 3 Протективность мелиоидозных антигенов при использовании их с цитокинами и бестимом     Летальность при заражении B.pseudomallei 100 № п/п Препараты для иммунизации 2 ЛД₅₀ 20 ЛД₅₀ пало/взято % павш. СПЖ пало/взято % павш. СПЖ 1 АГ 11/16 68,7 7,1 16/16 100 7,8 2 АГл 9/18 50,0 7,9 16/17 94,1 7,7 3 АГл+бестим 6/16 37,5 6,7 15/16 93,7 6,0 4 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2 5/16 31,2* 10,4 16/16 100 8,9 5 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2+бестим 5/17 29,4* 12,6* 15/16 93,7 10,5* 6 Контроль (интактные) 8/10 80 8,5 10/10 100 6,3 * - различия достоверны по отношению к группе интактных мышей (р<0,05).

Таблица 4 Влияние кратности применения иммуномодулирующих пептидов на клеточный иммунитет мышей, иммунизированных липосомальными мелиоидозными антигенами № п/п Препараты для иммунизации Уровень ГЗТ на 18 сут (ИР, %) Кратность введения ИМ 1 2 3 1 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2+бестим 22,76±1,85 19,58±1,65 33,37±2,01* 2 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2+имунофан 18,6±1,56 21,52±1,93 26,14±2,03** 3 Контроль (интактные) 4,18±0,85 - - * - различия достоверны по отношению к 1-2 кратному введению. * - различия достоверны по отношению к 1-кратному введению.

Таблица 5 Фагоцитарная активность ПМ в зависимости от кратности введения ИМ в иммунном ответе мышей на липосомальные мелиоидозные антигены № п/п Препараты для иммунизации Уровень хемилюминесценции ПМ, mV Кратность введения ИМ 1 2 3 1 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2+ бестим 11,41±1,72 10,84±1,34 19,42±1,65* 2 АГл+ИФН-γ+ИЛ-2+ имунофан 10,95±1,35 12,53±1,83 14,4±1,54 3 Контроль (интактные) 2,66±0,68 - - *- различия достоверны по отношению к 1-2 кратному введению (р<0,05).

Способ предусматривает иммунизацию животных с использованием поверхностных мелиоидозных антигенов в липосомальной форме, а для дополнительной стимуляции механизмов клеточного иммунитета вместе с цитокинами вводят иммуномодулятор бестим. Оценку стимулирующего воздействия препаратов на иммунную систему осуществляют в динамике иммунного ответа по уровню ГЗТ и степени хемилюминесцентного ответа на зимозан перитонеальных макрофагов иммунизированных мышей. О протективности антигенов судят по показателям летальности (проценту выживших животных и средней продолжительности жизни) после контрольного заражения вирулентной культурой В. pseudomallei. Иммуногенные и протективные свойства антигенов существенно возрастают за счет использования антигенов в липосомальной форме и включения в схему иммунизации активатора клеточного иммунитета бестима. Использование способа позволит усилить иммуногенность мелиоидозных антигенов при разработке средств специфической профилактики мелиоидозной инфекции. 6 табл., 2 пр.

Способ повышения иммуногенности антигенов В. pseudomallei при экспериментальном мелиоидозе, включающий введение антигенов и цитокинов, отличающийся тем, что для повышения иммуногенных свойств поверхностный антигенный комплекс из антигена 6 и антигена d (АГ6+d) вводят мышам в липосомальной форме, содержащей не менее 80% антигенного материала, в дозе 40 мкг по белку, двукратно с интервалом 10 сут, а вместе с цитокинами вводят иммуномодулятор бестим в дозе 0,07 мкг трехкратно, ежедневно, одновременно с иммунизацией и в последующие 2 сут, причем при первичной иммунизации применяют рекомбинантный ИФН-γ (ингарон) в дозе 20 ME, а при вторичной - рекомбинантный ИЛ-2 (ронколейкин) в дозе 1 мкг, и оценивают иммуногенные свойства антигенов на 8 и 18 сут после первичной иммунизации по показателям уровня ГЗТ и фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей, а протективные свойства - по показателям летальности животных, зараженных 2-10 ЛД₅₀ штамма 100 возбудителя мелиоидоза на 21 сут после первичной иммунизации.