СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛИОИДОЗНОЙ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/395 C07K16/12 G01N33/531 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и иммунологии, и может найти применение в иммунодиагностике для обнаружения возбудителя мелиоидоза для целей профилактики, диагностики и лечения этого заболевания.

Мелиоидоз, особо опасное инфекционное заболевание, широко распространенное в эндемичных районах. Зарегистрирован как в ряде географически отдаленных странах, так и в Европе. Возбудитель мелиоидоза Burkholderia pseudomallei вызывает инфекционное заболевание как у людей, так и у животных. Летальная доза может составлять несколько десятков клеток. Решающую роль в диагностике мелиоидоза продолжают играть серологические (основанные на использовании сыворотки) методы исследований, такие как иммуноферментный (ИФА), метод флюоресцирующих антител (МФА), радиоизотопный анализ (РИА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция иммунодиффузии в геле (РИД) и др. Все эти методы требуют наличия высококачественных активных (гипериммунных) сывороток для получения из них специфических мелиоидозных иммуноглобулинов. Поэтому проблема получения активных гипериммунных сывороток к этому возбудителю для целей диагностики, профилактики и лечения мелиоидоза остается актуальной.

Известен способ получения мелиоидозных агглютинирующих сывороток (см. Регламент производства иммуноглобулинов диагностических мелиоидозных адсорбированных видоспецифических люминесцирующих сухих N 313-83, авторы Кулаков М.Я., Рыбкин B.C., Локтионов А.М. и др. ВолгНИПЧИ. Утвержден Начальником Главного Управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Министерства здравоохраненя СССР 11.01.1984 г.).

Активность и специфичность полученных сывороток зависит от штамма и его антигенного состава, который используется при иммунизации животных-продуцентов в процессе получения иммунной сыворотки. Согласно указанному регламенту используют штамм Burkholderia pseudomallei-59361.

Штамм 59361 выделен из гноя тестикул свиньи во Вьетнаме. Получен из ГИСК им. Л.А.Тарасовича. Типичен для возбудителя мелиоидоза по всем основным свойствам. Микроскопически - это нежная палочка с закругленными концами размером 2-6 мкм в длину и 0,5-1 мкм толщиной, полиморфная, грамотрицательная. Капсулы не имеет, спор не образует, подвижна. Температурный оптимум роста 37°С. Наиболее благоприятной реакцией среды является рН 6,8-7,0. Недостатком этого штамма является недостаточно высокая активность получаемой сыворотки.

Известно также использование для этих целей штаммов мелиоидоза - 57576, 56830, 60263, 100, а также штамма VPA ( AC 712999, Штамм Pseudomonas pseudomallei VPA для получения диагностической мелиоидозной агглютинирующей сыворотки. Авторы: Ряпис Л.А., Илюхин В.И., Сычева Н.М. Волгоградский НИПЧИ - прототип). Недостатком перечисленных штаммов является невысокая иммунная активность получаемых сывороток.

Известен также штамм мелиоидоза 100-16-1 с измененным фенотипом для моделирования легочного мелиоидоза (Патент RU 2157538 С1). Использование его для иммунизации животных с целью производства гипериммунных мелиоидозных сывороток ранее не описано.

Цель изобретения - повышение специфической активности получаемой мелиоидозной иммунной сыворотки.

Цель достигается использованием атипичного штамма мелиоидоза Burkholderia pseudomallei-111-6-1 с измененным фенотипом, утратившим способность синтезировать биологический комплекс, условно обозначенный как антиген 8 (Аг8), с которым связывают антифагоцитарную активность микроба, который также снижает протективную защиту макроорганизма, обладая выраженным иммунодепрессивным действием.

Штамм получен нами методом селекции на питательных средах с антисывороткой к Аг8 и находится в рабочей коллекции культур патогенных микроорганизмов лаборатории иммунохимии; зарегистрирован в коллекционном центре Волгоградского НИПЧИ под N 3 журнала учета ПБА, форма N518/V.

Пример 1. Иммунизацию животных прводили по методике 1 цикла согласно Регламента производства N 313-83.

Иммунизация включала 4 инъекции животным-продуцентам с интервалом в 7 дней возрастающими дозами антигена (1,2·10⁹; 2,5·10⁹; 5·10⁹; 1·10¹⁰ м.т.). Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Активность сыворотки после иммунизации животных (1 цикл) в реакции иммунодиффузии в геле (РИД)Опыт №12345СреднееАктивностьШтамм 59361444484,8Штамм 100484444,8Штамм 1118416161612,0Штамм 100-16-1484485,6Штамм 111-6-1326464643251,5

Пример 2. После месячного перерыва иммунизацию тех же животных проводили по методике 2 цикла согласно Регламенту производства N 313-83.

Иммунизация включала 4 инъекции животным-продуцентам с интервалом в 7 дней убывающими дозами антигена (1·10¹⁰; 5·10⁹; 2,5·10⁹; 1,2·10⁹ м.т.). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Активность сыворотки после иммунизации животных (2 цикл) в реакции иммунодиффузии в геле (РИД)Опыт №12345СреднееАктивностьШтамм 59361326432326444,8Штамм 1006446483234,8Штамм 111643232323238,4Штамм 100-16-1646464646464Штамм 111-6-1128128128128128128

Из приведенных примеров следует, что применение предложенного штамма повышает активность иммунной сыворотки на обоих циклах иммунизации по сравнению с известными способами получения в 3,3-4,3 раза и позволяет получить иммунную сыворотку с титрами в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) 1:128.

Изобретение относится к микробиологии и иммунологии и может найти применение в иммунодиагностике. Для осуществления способа в качестве антигена для иммунизации животных используют атипичный штамм мелиоидоза Burkholderia pseudomallei-111-6-1 с измененным фенотипом, дефектным по синтезу 8 антигена, вызывающий иммунодепрессивное действие. Иммунную сыворотку получают после 2 циклов иммунизации животных-продуцентов с титром в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) не менее 1:128. Способ позволяет увеличивать специфическую активность получаемой иммунной сыворотки. 2 табл.

Способ получения мелиоидозной иммунной сыворотки путем многократной иммунизации животных-продуцентов антигеном с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве антигена иммунизации используют штамм возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei 111-6-1, несинтезирующий поверхностный гетерополимер белково-углеводной природы (800 kDa), вызывающий иммунодепрессивное действие, иммунизацию проводят в 2 цикла и отделяют целевой продукт с титром в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) не менее 1:128.