СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ МЕЛИОИДОЗА Российский патент 1996 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфической профилактики инфекционных заболеваний и может быть использовано для предотвращения заболевания мелиоидозом чувствительных к Pseudomonas pseudomallei млекопитающих.

Аналоги неизвестны.

Задачей изобретения является создание у млекопитающих специфической устойчивости к заражению P. pseudomallei.

Решение задачи достигается иммунизацией млекопитающих белком, выполняющим порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя данного заболевания.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. Пориновый белок, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к мелиоидозу животным (в наших опытах золотистые хомячки и белые крысы) из расчета 880.7000 мкг антигена на кг массы животного. При необходимости иммунизацию повторяют. Определение протективного эффекта выполняют подкожным заражением животных клетками вирулентной культуры P. pseudonallei в количествах, достаточных для вызывания их гибели. В течение 30 сут ежедневно фиксируют число павших животных. Протективный эффект (индекс резистентности) определяют как отношение LD₅₀ вирулентного штамма для вакцинированных животных к LD₅₀ для интактных. Индекс резистентности зависит от дозы и кратности введения препарата. Схема иммунизации экспериментально подбирается для каждого вида животных. Способ обеспечивает выживание 100% белых крыс, зараженных подкожно 30 LD₅₀ агаровой культуры высоковирулентного штамма P. pseudomallei С-141.

Существенным признаком заявляемого изобретения является использование для иммунизации белка, выполняющего порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя мелиоидоза. Между существенным признаком заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, заключающаяся в том, что антитела, выработанные иммунной системой макроорганизма на пориновые белки, связываются с поринами, образующими на поверхности бактериальной клетки поры, и нарушают проницаемость бактериальной стенки для низкомолекулярных веществ. В результате происходит нарушение нормального метаболизма бактерий, что в конечном итоге и является причиной их гибели.

Другим возможным механизмом предотвращения инфекционного процесса может быть стимулирование специфического клеточного иммунитета.

Препараты поринового белка, выделенные из возбудителя мелиоидоза, не обладают токсическим действием в отношении золотистых хомяков и белых крыс в дозах 70 мг/кг массы животного (максимальная доза их использования). Способность поринового белка мелиоидозного микроба индуцировать специфический иммунитет у млекопитающих впервые обнаружена авторами данного способа.

Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Выделение поринового белка из культуры штамма P. pseudomallei C-141.

Для выделения поринового белка использовался способ, разработанный Новиковой О.Д. для псевдотуберкулезного микроба (Новикова О.Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. Химическая характеристика и биологическая активность. Дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1986). Способ заключается в следующем. К 6 г ацетонвысушенных клеток возбудители мелиоидоза добавляют 600 мл охлажденного физиологического раствора и в течение 2 час клетки суспендируют на магнитной мешалке при температуре (4±2^oC. Затем их осаждают центрифугированием в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют в 200 мл 0,03 М трис-HCl буфера (рН 7,2) (далее буфер А), содержащего 2% тритона Х-100, и экстрагируют цитоплазматические белки при температуре (4±2^oC в течение 2 час при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1 М раствора MgCl₂ и 10 мг ДНК-азы (Реахим НПО "Биохимреактив") и инкубируют 12 час.

Затем осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и инкубируют при температуре (60±1)^oC в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 час.

Осадок промывают водой, суспендируют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCl, выдерживают при температуре (37±0,5)^oC в течение 30 мин. Затем осадок отделяют центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин.

Пептидогликан отделяют центрифугированием при 150000 g в течение 1 час. Далее очистку порина (остается в супернатанте) ведут гельфильтрацией в сефакриле S-200 или другом носителе. Порин из P. pseudomallei представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 37.38 килодальтон. В реакции диффузионной преципитации с диагностическими сыворотками к возбудителю мелиоидоза образует одну четкую линию. Очищенный препарат используется для иммунизации животных.

Пример 2. Доказательство возможности получения протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе золотистых хомяков.

Выбор золотистых хомяков обусловлен их очень высокой чувствительностью к данному возбудителю. Условия опыта и полученные результаты приведены в табл. 1.

Результаты, представленные в табл. 1, доказывают принципиальную возможность получения по заявленному способу протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе золотистых хомяков.

Пример 3. Доказательство возможности получения протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе белых крыс (табл. 2).

Выбор белых крыс в качестве экспериментальной модели при мелиоидозе обусловлен их сравнительно низкой чувствительностью к возбудителю и сопоставим с таковыми у человека показателями клеточного и гуморального иммунитета по бактерицидным свойствам сыворотки крови и гиперчувствительности замедленного типа.

Результаты опытов, приведенные в табл. 2, доказывают принципиальную возможность получения протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе белых крыс после двукратной иммунизации. ТТТ1 ТТТ2

Использование: биотехнология, микробиология, профилактика мелиоидоза. Сущность изобретения: белок, выполняющий порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя мелиоидоза, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к мелиоидозу животным из расчета 880 - 7000 мкг на кг массы животных. Иммунизацию проводят по схеме, экспериментально подобранной для каждого вида животных. Определение протективного эффекта проводят подкожным заражением животных вирулентной культурой мелиоидозного микроба. Способ обеспечил выживание 100% белых крыс, зараженных подкожно в дозе LD₅₀ агаровой культуры высоковирулентного штамма Pseudomonas pseudomallei C-141. 2 табл.

Способ специфической профилактики мелиоидоза, включающий иммунизацию чувствительных к мелиоидозу животных антигеном из клеточной стенки возбудителя, отличающийся тем, что иммунизируют белком, выполняющим порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя данного заболевания.