КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ РЕГУЛИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ЕСТЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ Российский патент 2009 года по МПК C07K16/28 C07K19/00 C12P21/08 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителам, фрагментам антител и их производным, которые перекрестно реагируют с двумя или более ингибиторными рецепторами, имеющимися на поверхности естественных клеток-киллеров (клеток NK), и усиливают цитотоксичность клеток NK у индивидуумов-млекопитающих или в биологическом образце. Изобретение относится также к способам получения таких антител, фрагментов, вариантов и производных; к фармацевтическим композициям, их содержащим; и к применению таких молекул и композиций, в частности в терапии, для повышения активности или цитотоксичности клеток NK у индивидуумов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Клетки - естественные убийцы, киллеры (natural killer cells, NK cells) - это субпопуляция лимфоцитов, участвующих в нетрадиционном (ненаследуемом) иммунитете. Клетки NK могут быть получены различными известными в данной области способами - такими, как получение из проб крови, цитоферез, сборы и т.д.

Характеристики и биологические свойства клеток NK включают экспрессию поверхностных антигенов, в том числе CD16, CD56 и/или CD57; отсутствие на клеточной поверхности комплекса Т-клеточных рецепторов (TCR) альфа/бета или гамма/дельта; способность связываться с клетками, которые не экспрессируют «свои» антигены главного комплекса тканевой совместимости и антиген гистосовместимости (антигены MHC/HLA), и убивать эти клетки путем активации специфических цитолитических ферментов; способность убивать опухолевые клетки или другие больные клетки, экспрессирующие активирующий клетки NK рецептор-лиганд; способность высвобождать цитокины, стимулирующие или ингибирующие иммунную реакцию; и способность претерпевать множественные циклы клеточного деления и производить дочерние клетки с биологическими свойствами, одинаковыми со свойствами родительских клеток.

В контексте настоящего изобретения «активные» клетки NK означают биологически активные клетки NK, конкретнее клетки NK, способные лизировать клетки-мишени. Например, «активная» клетка NK способна убивать клетки, которые экспрессируют активирующий клетки NK рецептор-лиганд и не могут экспрессировать «свои» антигены MHC/HLA (KIR-несовместимые клетки).

На основе биологических свойств клеток NK в данной области были предложены разнообразные терапевтические и вакцинные стратегии, рассчитанные на модуляцию клеток NK. Однако активность клеток NK регулируется сложным механизмом, который включает как стимулирующие, так и ингибирующие сигналы. Поэтому для эффективной терапии, опосредованной клетками NK, могут потребоваться и стимуляция этих клеток, и нейтрализация ингибирующих сигналов.

Существует негативная регуляция клеток NK специфическими для 1 класса главного комплекса тканевой совместимости (major histocompatibility complex, MHC) ингибиторными рецепторами (Кärrе и др., 1986; Öhlén и др., 1989). Эти специфические рецепторы связываются с полиморфными детерминантами молекул I класса MHC или антигеном гистосовместимости (HLA), находящимися на других клетках, и ингибируют лизис клетками NK. У человека группы аллелей HLA I класса распознаются некоторыми представителями семейства рецепторов, называемых «киллерные lg-подобные рецепторы» (killer Ig-like receptors, KIR).

Рецепторы KIR - это большое семейство рецепторов, имеющихся на определенных подтипах лимфоцитов, в том числе на клетках NK. Номенклатура KIR основана на числе внеклеточных доменов (KIR2D или KIR3D) и на том, длинный ли (KIR2DL или KIR3DL) или короткий (KIR2DS или KIR3DS) цитоплазматический хвост. У людей наличие или отсутствие данного KIR меняется от одной клетки NK к другой в пределах популяции клеток NK, имеющихся у данного индивидуума. У человеческой популяции имеется также относительно высокий уровень полиморфизма молекул KIR, причем определенные молекулы KIR имеются у некоторых индивидуумов, но не у всех. Некоторые продукты гена KIR стимулируют активность лимфоцитов, связываясь с подходящим лигандом. Все KIR с подтвержденной стимулирующей активностью имеют короткий цитоплазматический хвост с заряженным трансмембранным участком, который ассоциирован с адапторной молекулой, имеющей иммуностимулирующий лейтмотив (immunostimulatory motif, ITAM). Другие продукты гена KIR по своей природе являются ингибирующими. Все KIR с подтвержденной ингибиторной активностью имеют длинный цитоплазматический хвост, и оказывается, что они взаимодействуют с различными подтипами антигенов HLA, в зависимости от подтипа KIR. Во внутрицитоплазматической части ингибиторных KIR проявляются один или несколько ингибиторных лейтмотивов, которые используют фосфатазы. Известные ингибиторные рецепторы KIR включают представителей подсемейств KIR2DL и KIR3DL. Рецепторы KIR, имеющие два домена Ig (KIR2D), идентифицируют аллотипы HLA-C: KIR2DL2 (первоначально его обозначали р58.2) или близко родственный продукт гена KIR2DL3 распознают эпитоп, общий в аллотипах группы 2 HLA-C (Сw1, 3, 7 и 8), тогда как KIR2DL1 (р58.1) распознает эпитоп, общий в аллотипах реципрокной группы 1 HLA-C (Cw2, 4, 5 и 6). Распознавание KIR2DL1 определяется наличием остатка Lys в положении 80 аллелей HLA-C. Распознавание KIR2DL2 и KIR2DL3 определяется наличием остатка Asn в положении 80. Важно то, что подавляющее большинство аллелей HLA-C имеет в положении 80 либо остаток Asn, либо остаток Lys. Один KIR с тремя доменами Ig - KIR3DL1 (р70) распознает эпитоп, общий в аллелях HLA-Bw4. Наконец, гомодимер молекул с тремя доменами Ig - KIR3DL2 (р140) распознает HLA-A3 и HLA-A11.

Хотя ингибиторные KIR и другие ингибиторные рецепторы I класса (Moretta и др., 1997; Valiante и др., 1997а; Lanier, 1998) могут совместно экспрессироваться клетками NK, в наборе клеток NK каждого данного индивидуума имеются клетки, экспрессирующие одиночный KIR, и поэтому соответствующие клетки NK блокируются только клетками, экспрессирующими специфическую группу аллелей I класса.

Было установлено, что популяция клеток NK или клоны, которые не соответствуют KIR, т.е. популяция клеток NK, которые экспрессируют KIR, не совместимые с молекулами HLA хозяина, являются наиболее возможными медиаторами анти-лейкемического действия трансплантата, наблюдаемого при аллогенной трансплантации (Ruggeri и др., 2002). Одним из путей воспроизведения этого эффекта у данного индивидуума могло бы быть использование реагентов, блокирующих взаимодействие KIR/HLA.

Было показано, что специфические к KIR2DL1 моноклональные антитела блокируют взаимодействие KIR2DL1 с аллелями Cw4 (или подобными им) (Moretta и др., 1993). Были также описаны моноклональные антитела к KIR2DL2/3, блокирующие взаимодействие KIR2DL2/3 с аллелями HLACw3 (или подобными им) (Moretta и др., 1993). Однако применение таких реагентов в клинических ситуациях потребовало бы разработки двух терапевтических моноклональных антител (monoclonal antibodies, mAb) для лечения всех пациентов, вне зависимости от того, экспрессировал ли данный пациент аллели HLA-C 1-го класса или 2-го класса. Более того, перед принятием решения о том, какой тип терапевтических антител использовать, необходимо было бы предварительно определить, какой тип HLA экспрессировал каждый пациент. Это привело бы к сильному удорожанию лечения.

Watzl и др. (// Tissue Antigens. 2000. Т.56. С.240) получили перекрестно реагирующие антитела, распознающие множественные изотипы KIR, но эти антитела не обладали усиливающим действием на активность клеток NK. Spaggiara G.M. и др. (// Blood. 2002. Т.100. С.4098-4107) выполнили опыты с использованием многочисленных моноклональных антител к различным KIR. Было показано, что один из этих типов антител, а именно NKVSF1, распознает общий эпитоп в CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) и р50.3 (KIR2DS4). Не было высказано предположение, что NKVSF1 может усиливать активность клеток NK, и не предполагалось, что эти антитела могут быть использованы как терапевтическое средство. Поэтому практические и эффективные подходы к модуляции активности клеток до сих пор не были доступны в данной области, и для этого все еще требуется специфическое по отношению к аллелям HLA воздействие с помощью специфических реагентов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение ныне предусматривает новые антитела, композиции и способы, которые преодолевают существующие в настоящее время трудности в активации клеток NK и обеспечивают выгодные особенности и преимущества. В одном приводимом в качестве примера аспекте изобретение предусматривает единичный тип антител, усиливающий активацию человеческих клеток NK фактически у всех людей. Более конкретно, изобретение предусматривает новые специфические антитела, перекрестно реагирующие с различными группами ингибиторных KIR и нейтрализующие их ингибиторные сигналы, что приводит к усилению цитотоксичности у тех клеток NK, которые экспрессируют такие ингибиторные рецепторы KIR. Эта способность к перекрестной реакции со многими продуктами генов KIR позволяет эффективно использовать антитела настоящего изобретения для повышения активности клеток NK у большинства человеческих индивидуумов, без затруднений и затрат, связанных с предварительным определением у индивидуума типа HLA.

В первом аспекте изобретение предусматривает антитела, фрагменты антител и производные любых из них, причем указанное антитело, фрагмент или производное перекрестно реагирует, по меньшей мере, с двумя ингибиторными рецепторами KIR на поверхности клеток NK, нейтрализует ингибиторные сигналы клеток NK и усиливает активность клеток NK. Более предпочтительно антитело связывается с общим детерминантом рецепторов KIR2DL человека. Еще конкретнее, антитела согласно настоящему изобретению связываются, по меньшей мере, с рецепторами KIR2DL1, KIR2DL2 и KKIR2DL3. Для целей настоящего изобретения термин «KIR2DL2/3» относится к любому из рецепторов KIR2DL2 и KIR2DL3 или к ним обоим. Эти два рецептора имеют очень высокую степень гомологии, являются, по-видимому, аллельными формами одного и того же гена и в данной области считаются взаимозаменяемыми. Поэтому для целей настоящего изобретения считается, что KIR2DL2/3 - это одиночная молекула ингибиторного KIR, и поэтому антитела, которые перекрестно реагируют только с KIR2DL2 и KIR2DL3 и не реагируют ни с каким из других ингибиторных рецепторов KIR, не входят в круг охвата настоящего изобретения.

Антитела согласно настоящему изобретению специфически ингибируют связывание молекул МНС или HLA, по меньшей мере, с двумя ингибиторными рецепторами KIR и способствуют активности клеток NK. Под термином «нейтрализуют ингибиторную активность KIR», как он использован здесь, подразумеваются оба вида активности. Способность антител согласно настоящему изобретению «способствовать активности клеток NK», «способствовать цитотоксичности клеток NK», «помогать клеткам NK», «усиливать активность клеток NK», «усиливать цитотоксичность клеток NK» или «придавать силу клеткам NK» в контексте настоящего изобретения означает, что антитела дают возможность клеткам NK экспрессировать на своей поверхности ингибиторный рецептор KIR, чтобы они были способны лизировать клетки, экспрессирующие на своей поверхности соответствующий лиганд для этого конкретного ингибиторного рецептора KIR (например, конкретный антиген HLA). В конкретном аспекте изобретение предусматривает антитела, которые специфически ингибируют связывание молекул HLA-C с рецепторами KIR2DL1 и KIR2DL2/3. В другом конкретном аспекте изобретение предусматривает антитела, которые способствуют активности клеток NK in vivo.

Вследствие того, что, по меньшей мере, примерно у 90% человеческой популяции имеется, по меньшей мере, один рецептор KIR2DL1 или KIR2DL2/3, наиболее предпочтительные антитела настоящего изобретения способны помогать активности клеток NK, направленной на большинство клеток, ассоциированных с аллотипами HLA-C, соответственно с аллотипами HLA-C группы 1 и аллотипами HLA-C группы 2. Так, композиции настоящего изобретения могут быть применены для активации или усиления клеток NK у большинства человеческих индивидуумов, обычно у приблизительно 90% человеческих индивидуумов или больше. Поэтому единственная композиция с антителами в соответствии с настоящим изобретением может быть применена для лечения большинства человеческих индивидуумов, и необходимость определять аллельные группы или применять коктейли антител возникает редко.

Изобретение впервые демонстрирует, что можно получить перекрестно-реактивные и нейтрализующие антитела к ингибиторным KIR и что такие антитела обеспечивают эффективную активацию клеток NK в широком диапазоне человеческих групп.

Поэтому конкретный объект настоящего изобретения составляют антитела, причем указанные антитела специфически связываются и с человеческим рецептором KIR2DL1, и с человеческим рецептором KID2DL2/3 и отменяют опосредованное этими KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела конкурируют с моноклональными антителами DF-200, продуцируемыми гибридомами DF-200. Указанные антитела, конкурирующие с антителами DF-200, сами могут не являться антителами DF-200.

В другом варианте осуществления антитела конкурируют с моноклональными антителами NKVSF1, причем антитела, конкурирующие с NKVSF1, могут (но не обязательно) не являться антителами NKVSF1.

В другом варианте осуществления антитела конкурируют с антителами 1-7F9.

Предпочтительно указанными антителами являются химерные антитела, «гуманизированные» антитела или человеческие антитела.

Термин «конкурирует с», когда он относится к конкретным моноклональным антителам (например, DF-200, NKVSF1, 1-7F9, ЕВ6, GL183), означает, что антитела конкурируют с моноклональными антителами (например, DF-200, NKVSF1, 1-7F9, ЕВ6, GL183) в анализе на связывание с использованием либо рекомбинантных молекул KIR, либо экспрессируемых на поверхности молекул KIR. Например, если антитела снижают связывание DF-200 с молекулой KIR в анализе на связывание, антитела «конкурируют» с DF-200. Антитела, которые «конкурируют» с DF-200, могут конкурировать с DF-200 за связывание с человеческим рецептором KIR2DL1, человеческим рецептором KIR2DL2/3 или с обоими человеческими рецепторами - и KIR2DL1, и KIR2DL2/3.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с человеческими рецепторами - и с KIR2DL1, и с KIR2DL2/3, отменяющие опосредованное этими KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK и конкурирующие с DF-200, 1-7F9 или NKVSF1 за связывание с человеческим рецептором KIR2DL1, человеческим рецептором KIR2DL2/3 или с обоими человеческими рецепторами - и KIR2DL1, и KIR2DL2/3. По усмотрению, этими антителами не являются NKVSF1. По усмотрению, указанными антителами являются химерные, человеческие или «гуманизированные» антитела.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с человеческими рецепторами - и с KIR2DL1, и с KIR2DL2/3, отменяющие опосредованную этими KIR цитотоксичность клеток NK и конкурирующие с ЕВ6 за связывание с человеческим рецептором KIR2DL1, конкурирующие с GL183 за связывание с человеческим рецептором KIR2DL2/3, или же конкурирующие и с ЕВ6 за связывание с человеческим рецептором KIR2DL1, и с GL183 за связывание с человеческим рецептором KIR2DL2/3. По усмотрению, указанными антителами не являются NKVSF1; по усмотрению, указанными антителами не являются DF-200. По усмотрению, указанными антителами являются химерные, человеческие или «гуманизированные» антитела.

В полезном аспекте изобретение предусматривает антитела, конкурирующие с DF-200 и различающие на молекуле KIR в значительной степени такие же или в основном такие же, или просто такие же, как на моноклональных антителах DF-200, эпитопы или «эпитопные центры», связывающиеся с ними или имеют к ним иммуноспецифичность. Предпочтительно указанной молекулой KIR может быть человеческий рецептор KIR2DL1 или человеческий рецептор KIR2DL2/3.

Конкретный объект изобретения составляют антитела, причем указанные антитела связываются с общим детерминантом, присутствующим в человеческих рецепторах и KIR2DL1, и KIR2DL2/3, и отменяют опосредованное этими KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK. Антитела более специфично связываются по существу с таким же эпитопом на KIR, как и на моноклональных антителах DF-200, продуцируемых гибридомами DF-200, или на антителах NKVSF1, продуцируемых гибридомами NKVSF1, причем антитела не являются NKVSF1.

В предпочтительной форме осуществления антителами согласно настоящему изобретению являются моноклональные антитела. Наиболее предпочтительными антителами согласно настоящему изобретению являются моноклональные антитела DF-200, продуцируемые гибридомами DF-200.

Продуцирующие антитела DF-200 гибридомы были депонированы в коллекции культур CNCM под идентификационным шифром "DF-200" (DF200), регистрационным номером CNCM I-3224, зарегистрированы 10 июня 2004 г., Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France. Антитела NKVSF1 производятся фирмой Serotec (Cergy Sainte-Christophe, France), № по каталогу МСА2243. Антитела NKVSF1 здесь носят также обозначение pan2D mAb.

Изобретение предусматривает также функциональные фрагменты и производные описанных здесь антител, имеющие по существу такую же антигенную специфичность и активность (т.е. те, которые могут перекрестно реагировать с родительскими антителами и которые усиливают цитотоксическую активность клеток NK, экспрессирующих ингибиторные рецепторы KIR), включающие (но не ограничивающиеся ими) фрагмент Fab, фрагмент Fab'2, иммуноадгезин, димерные антитела (diabody), CDR и ScFv. Кроме того, антитела согласно настоящему изобретению могут быть гуманизированными, человеческими или химерными.

Изобретение предусматривает также производные антител, представляющие собой антитела по настоящему изобретению, конъюгированные или ковалентно сшитые с токсином, радионуклидом, распознаваемой частью молекулы (например, с флуорофором) или с твердым носителем.

Изобретение предусматривает также фармацевтические композиции, содержащие антитела, как они раскрыты выше, их фрагменты или производные любых из них. Соответственно с этим изобретение относится также к применению антител, как они здесь раскрыты, в способе производства лекарственного средства. В предпочтительных вариантах осуществления указанные лекарственное средство или фармацевтическая композиция предназначены для лечения рака или другого пролиферативного расстройства, инфекции, или для применения в трансплантации.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает композицию, содержащую антитела, которые связываются с продуктами, по меньшей мере, двух различных генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, причем указанные антитела способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в клетках NK, экспрессирующих, по меньшей мере, один из указанных двух различных человеческих ингибиторных рецепторов KIR, при этом указанные антитела включены внутрь липосом. По усмотрению, указанная композиция может содержать дополнительное вещество, выбранное из молекулы нуклеиновой кислоты для доставки генов в целях генной терапии; молекулы нуклеиновой кислоты для доставки антисмысловой РНК, интерферирующей РНК (RNAi) или малой интерферирующей РНК (siRNA) для супрессирования гена в клетках NK; или токсина или лекарства для адресованного уничтожения клеток NK, дополнительно включенное в указанные липосомы.

Изобретение предусматривает также способы регулирования активности клеток NK человека in vitro, ex vivo или in vivo, состоящие в контактировании клеток NK человека с эффективным количеством антител настоящего изобретения, фрагментов таких антител, производных каждого из них или с фармацевтической композицией, содержащей, по меньшей мере, одно из упомянутого. Предпочтительные способы состоят во введении эффективного количества фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению и направлены на повышение цитотоксической активности клеток NK человека, наиболее предпочтительно ex vivo или in vivo, у индивидуума, имеющего рак, инфекционное заболевание или иммунное заболевание.

В дальнейших аспектах изобретение предусматривает гибридомы, которые содержат:

(a) В-клетки из хозяина-млекопитающего (обычно хозяин-млекопитающее, не является человеком), иммунизированные антигеном, содержащим эпитоп, имеющийся на полипептиде ингибиторного KIR, слитые с

(b) бессмертными клетками (например, клетками миеломы), причем указанные гибридомы продуцируют моноклональные антитела, связывающиеся, по меньшей мере, с двумя различными человеческими ингибиторными рецепторами KIR и способные, по меньшей мере, существенно нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующие указанные, по меньшей мере, два различных человеческих ингибиторных рецептора KIR.

По усмотрению, указанные гибридомы могут не продуцировать моноклональные антитела NKVSF1. Предпочтительно, чтобы указанные антитела связывались с рецепторами KIR2DL1 и KIR2DL2/3. Предпочтительно указанные антитела связываются с общим детерминантом, присутствующим на KIR2DL1 и KIR2DL2/3. Предпочтительно указанные гибридомы продуцируют антитела, которые ингибируют связывание молекулы аллели HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Lys, с человеческим рецептором KIR2DL1 и связывание молекулы аллели HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Asn, с человеческими рецепторами KIR2DL2/3. Предпочтительно, чтобы указанные гибридомы продуцировали антитела, связывающиеся по существу с таким же эпитопом, как и моноклональные антитела DF-200, продуцируемые гибридомами DF-200, либо на KIR2DL1, либо на KIR2DL2/3, либо и на KIR2DL1, и на KIR2DL2/3. Пример таких гибридом - DF-200.

Изобретение предусматривает также способы продуцирования антител, которые перекрестно реагируют с несколькими продуктами гена KIR2DL и которые нейтрализуют ингибиторную активность таких KIR, причем способ включает следующие этапы:

а) иммунизацию млекопитающего (не человека) иммуногеном, содержащим полипептид KIR2DL;

b) получение от иммунизированного млекопитающего антител, причем антитела связываются с полипептидом KIR2DL;

c) отбор среди антител этапа (b) тех, которые перекрестно реагируют, по меньшей мере, с двумя различными продуктами гена KIR2DL; и

d) отбор среди антител этапа (с) тех, которые усиливают активность клеток NK.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным млекопитающим (не человеком) является трансгенное животное, сконструированное так, чтобы экспрессировать набор человеческих антител (например, это млекопитающее (не человек), содержащее локусы человеческого иммуноглобулина и делеции в нативном гене иммуноглобулина, - такое, как Xenomouse™ (Abgenix - Fremont, CA, USA), или млекопитающее (не человек), содержащее минилокус из генов, кодирующих человеческий Ig, - такое как HuMab-mouse™ (Medarex - Princeton, NJ, USA)). По усмотрению, способ дополнительно включает отбор антител, которые связываются с клетками NK или полипептидом KIR примата, преимущественно обезьяны Cynomolgus. По усмотрению, изобретение может дополнительно включать способ оценки антител, где продуцированные согласно приведенному выше способу антитела вводят примату, предпочтительно обезьяне Cynomolgus, причем предпочтительно обезьяну наблюдают на предмет наличия или отсутствия признаков токсичности антител.

Изобретение также предусматривает способ получения антител, которые связываются, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, причем указанные антитела способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующих указанные, по меньшей мере, два различных продукта генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) иммунизацию млекопитающего (не человека) иммуногеном, содержащим полипептид ингибиторного KIR;

b) получение антител от иммунизированного животного, причем антитела связываются с полипептидом KIR;

c) отбор антител этапа (b), которые перекрестно реагируют, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, и

d) отбор антител этапа (с), способных нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующих указанные, по меньшей мере, два различных продукта генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, причем порядок этапов (с) и (d) может быть по усмотрению изменен, и по усмотрению может быть повторено один или более раз любое число этапов.

Предпочтительно, чтобы использованный для иммунизации полипептид ингибиторного KIR был полипептидом KIR2DL и отобранные в этапе (с) антитела перекрестно реагировали, по меньшей мере, с KIR2DL1 и KIR2DL2/3. Предпочтительно, чтобы указанные антитела распознавали общий детерминант, имеющийся, по меньшей мере, на двух различных продуктах генов рецепторов KIR; наиболее предпочтительно указанными KIR являются KIR2DL1 и KIR2DL2/3. По усмотрению, указанный способ дополнительно включает отбор антител, связывающихся с клетками NK или полипептидом KIR примата, предпочтительно обезьяны Cynomolgus. По усмотрению, изобретение дополнительно включает способ оценки антител, где продуцированные согласно приведенному выше способу антитела вводят примату, предпочтительно обезьяне Cynomolgus, причем предпочтительно обезьяну наблюдают на предмет наличия или отсутствия признаков токсичности антител.

По усмотрению, в описанных выше способах антитела, отобранные в этапах (с) или (d), не являются NKVSF1. Предпочтительно, чтобы антитела, полученные на этапе (b), в описанных выше способах представляли собой моноклональные антитела. Предпочтительно, чтобы антитела, отобранные в этапе (с) в описанных выше способах, ингибировали связывание аллельной молекулы HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Lys, с человеческим рецептором KIR2DL1 и связывание аллельной молекулы HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Asn, с человеческими рецепторами KIR2DL2/3. Предпочтительно, чтобы антитела, отобранные в этапе (d) в описанных выше способах, вызывали усиление цитотоксичности клеток NK - например, любое существенное усиление или, по меньшей мере, усиление цитотоксичности клеток NK, по меньшей мере, на 5%, 10%, 20%, 30% или более - например, усиление адресованной цитотоксичности клеток NK, по меньшей мере, приблизительно на 50%, (например, по меньшей мере, приблизительно на 60%, по меньшей мере, приблизительно на 70%, по меньшей мере, приблизительно на 80%, по меньшей мере, приблизительно на 85%, по меньшей мере, приблизительно на 90% или, по меньшей мере, на 95% (то есть усиление цитотоксичности клеток NK, например, на приблизительно от 65% до 100%)). Предпочтительно, чтобы антитела связывались по существу с тем же эпитопом, как и моноклональное антитело DF-200, на KIR2DL1 и/или KIR2DL2/3. По усмотрению, указанные способы также или альтернативно содержат дополнительный этап создания фрагментов отобранных моноклональных антител, создания производных отобранных моноклональных антител (например, путем конъюгации с радионуклидом, цитотоксическим агентом, репортерной молекулой или подобными им) или создания производных фрагментов антител - либо полученных из таких моноклональных антител, либо таких, которые содержат (аминокислотные) последовательности, соответствующие последовательностям таких моноклональных антител.

Изобретение далее предусматривает способ получения антител, связывающихся, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, причем указанные антитела способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующих указанные, по меньшей мере, два различных продукта генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, при этом способ включает следующие этапы:

а) отбор, из библиотеки или набора, моноклональных антител или фрагмента моноклональных антител, которые перекрестно реагируют, по меньшей мере, с двумя различными продуктами гена человеческого ингибиторного рецептора KIR2DL, и

b) отбор антител стадии (а), способных нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующих указанные, по меньшей мере, два различных продукта гена человеческого ингибиторного рецептора KIR2DL. Предпочтительно, чтобы антитела связывались с общим детерминантом, присутствующим в рецепторах KIR2DL1 и KIR2DL2/3. По усмотрению, антитела, отобранные на этапе (b), могут не являться NKVSF1. Предпочтительно антитела, отобранные в этапе (b), ингибируют связывание аллельной молекулы HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Lys, с человеческим рецептором KIR2DL1 и связывание аллельной молекулы HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Asn, с человеческими рецепторами KIR2DL2/3. Предпочтительно, чтобы антитела, отобранные в этапе (b), вызывали усиление цитотоксичности клеток NK - например, любое существенное усиление или, по меньшей мере, усиление цитотоксичности клеток NK, по меньшей мере, на 5%, 10%, 20%, 30% или более - например, усиление адресованной цитотоксичности клеток NK, по меньшей мере, приблизительно на 50% (например, усиление цитотоксичности клеток NK, по меньшей мере, приблизительно на 60%, по меньшей мере, приблизительно на 70%, по меньшей мере, приблизительно на 80%, по меньшей мере, приблизительно на 85%, по меньшей мере, приблизительно на 90% или, по меньшей мере, на 95% (то есть, например, приблизительно на 65-100%)). Предпочтительно, чтобы антитела связывались по существу с тем же эпитопом, как и моноклональное антитело DF-200, на KIR2DL1 и/или KIR2DL2/3. По усмотрению, способ содержит дополнительный этап создания фрагментов отобранных моноклональных антител, создания производных отобранных моноклональных антител или создания производных фрагментов отобранных моноклональных антител.

Кроме того, изобретение предусматривает способ получения антител, которые связываются, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, причем указанные антитела способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующих указанные, по меньшей мере, два различных продукта генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, при этом способ включает следующие этапы:

a) культивирование гибридом согласно настоящему изобретению в условиях, допускающих продуцирование моноклональных антител, и

b) отделение моноклональных антител от гибридом. По усмотрению, способ может содержать дополнительный этап создания фрагментов указанных моноклональных антител, создания производных моноклональных антител или создания производных таких фрагментов моноклональных антител. Предпочтительно, чтобы антитела связывались с общим детерминантом, присутствующим на KIR2DL1 и/или KIR2DL2/3.

Настоящим изобретением предусматривается также способ получения антител, которые связываются, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, причем указанные антитела способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующих указанные, по меньшей мере, два различных продукта генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) выделение из гибридом согласно настоящему изобретению нуклеиновой кислоты, кодирующей указанные моноклональные антитела;

b) по усмотрению, модификацию нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы получить модифицированную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, которая кодирует модифицированное или видоизмененное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, которая соответствует функциональной последовательности моноклонального антитела или по существу подобна ей (например, идентична такой последовательности, по меньшей мере, приблизительно на 65%, по меньшей мере, приблизительно на 75%, по меньшей мере, приблизительно на 85%, по меньшей мере, приблизительно на 90%, по меньшей мере, приблизительно на 95% (так, как приблизительно на 70-99%)), выбранное из «гуманизированного» антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела, иммунореактивного фрагмента антитела или из слитого белка, содержащего такой иммунореактивный фрагмент;

c) вставку нуклеиновой кислоты или модифицированной нуклеиновой кислоты (или родственной нуклеиновой кислоты, кодирующей такую же аминокислотную последовательность) в экспрессирующий вектор, причем кодируемое антитело или кодируемый фрагмент антитела способен экспрессироваться, когда экспрессирующий вектор присутствует в клетке-хозяине, выращенной в подходящих условиях;

d) трансфицирование клетки-хозяина экспрессирующим вектором, причем клетка-хозяин не продуцирует иным способом белок иммуноглобулина;

e) культивирование трансфицированной клетки-хозяина в условиях, которые вызывают экспрессию антитела или фрагмента антитела; и

f) выделение антитела или фрагмента антитела, продуцированного указанной клеткой-хозяином. Предпочтительно, чтобы антитело связывалось с общим детерминантом, присутствующим на KIR2DL1 и KIR2DL2/3.

Следует принять во внимание, что изобретение также предусматривает композицию, содержащую антитела, связывающиеся, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, причем указанные антитела способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в клетках NK, экспрессирующих хотя бы один из указанных двух различных человеческих ингибиторных рецепторов KIR, при этом антитела присутствуют в количестве, эффективном для заметного усиления цитотоксичности клеток NK у пациента или в биологическом образце, содержащем клетки NK; и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Предпочтительно, чтобы антитела связывались с общим детерминантом, имеющимся на KIR2DL1 и KIR2DL2/3. Композиция может по усмотрению дополнительно содержать второе терапевтическое средство, выбранное, например, из иммуномодулирующего средства, гормонального средства, химиотерапевтического средства, антиангиогенного средства, апоптозного средства, второго антитела, связывающегося с ингибиторным рецептором KIR и ингибирующего его действие, анти-инфекционного средства, адресующего средства или вспомогательного средства. Полезные иммуномодулирующие средства могут быть выбраны из IL-1 альфа, IL-1бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-бета, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-альфа, TNF-бета, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, ИФН-альфа, ИФН-бета или ИФН-гамма. Примеры указанных химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, антиметаболиты, цитотоксичные антибиотики, адриамицин, дактиномицин, митомицин, карминомицин, дауномицин, доксорубицин, тамоксифен, таксол, таксотер, винкристин, винбластин, винорелбин, этопозид (VP-16), 5-фторурацил (5FU), цитозин-арабинозид, циклофосфамид, тиотера, метотрексат, камптотецин, актиномицин-D, митомицин С, цисплатин (цис-DDP), аминоптерин, комбретастатин(ы), другие алкалоиды барвинка и их производные или предшественники. Примеры гормональных средств включают лейпрорелин, гозерелин, трипторелин, бузерелин, тамоксифен, торемифен, флутамид, нилутамид, кипротерон, бикалутамид, анастрозол, экземестан, летрозол, фадрозол медрокси, хлормадинон, мегестрол, другие агонисты Гонадотропин-высвобождающего гормона (LHRH, Luteinizing Hormone Releasing Hormone), другие анти-эстрогены, другие анти-андрогены, другие ингибиторы ароматазы и другие прогестагены. Предпочтительно, чтобы вторым антителом, связывающимся с ингибиторным рецептором KIR и ингибирующим его действие, было антитело или его фрагмент, которые связываются с таким эпитопом ингибиторного рецептора KIR, который отличается от эпитопа, связываемого указанным антителом, связывающимся с общим детерминантом, имеющимся, по меньшей мере, на двух различных продуктах гена человеческого ингибиторного рецептора KIR.

Далее изобретение предусматривает способ заметного усиления активности клеток NK у нуждающегося в этом пациента, включающий этап введения пациенту композиции в соответствии с настоящим изобретением. Пациентом, нуждающимся в усилении активности клеток NK, может быть любой пациент, имеющий заболевание или расстройство, при которых такое усиление может способствовать терапевтическому действию, усиливать и/или индуцировать терапевтическое действие (или способствует терапевтическому действию, усиливает и/или индуцирует терапевтическое действие, по меньшей мере, у значительной части пациентов с заболеванием или нарушением, или у лиц по существу с такими же характеристиками, как у пациентов, как может быть определено, например, клиническими испытаниями). Пациент, нуждающийся в таком лечении, может иметь, например, рак, иное пролиферативное расстройство, инфекционное заболевание или иммунное расстройство. Предпочтительно, чтобы способ включал дополнительный этап введения пациенту подходящего дополнительного терапевтического средства, выбранного из иммуномодулирующего средства, гормонального средства, химиотерапевтического средства, антиангиогенного средства, апоптозного средства, второго антитела, связывающегося с ингибиторным рецептором KIR и ингибирующего его действие, анти-инфекционного средства, адресующего средства или вспомогательного средства, причем дополнительное терапевтическое средство вводят пациенту в форме разовой дозы вместе с антителами или же в форме раздельных дозировок. Дозировка антител (или фрагментов/производных антител) и дозировка дополнительного терапевтического средства вместе достаточны для того, чтобы заметным образом индуцировать, способствовать и/или усиливать терапевтическое действие у пациента, который нуждается в усилении активности клеток NK. Если антитела, их фрагменты или производные и дополнительное терапевтическое средство вводят порознь, необходимо их введение в условиях (например, это касается временного режима, числа доз и т. д.), которые обеспечивают заметное комбинированное лечебное действие на пациента.

Далее настоящее изобретение предусматривает антитела, способные специфически связываться с клетками NK примата (не человека), предпочтительно обезьяны, и/или с обезьяньими рецепторами KIR. Изобретение предусматривает также способы оценки токсичности, дозировки и/или активности или эффективности антител согласно настоящему изобретению, которые являются кандидатами в лекарства. В одном из аспектов изобретение предусматривает способ определения дозы антитела, токсичного для животного или ткани-мишени, путем введения имеющему клетки NK реципиентному животному - примату (не человеку) антител согласно настоящему изобретению и оценки любого из токсического или опасного, или побочного действий средства на животное или предпочтительно на ткань-мишень. В другом аспекте изобретение предусматривает способ идентификации антитела, токсичного для животного или ткани-мишени, путем введения имеющему клетки NK реципиентному животному - примату (не человеку) антител согласно настоящему изобретению и оценки любого из токсического или опасного, или побочного действий средства на животное или предпочтительно на ткань-мишень. В ином аспекте изобретение предусматривает способ идентификации антитела, эффективного в лечении инфекции, заболевания или рака путем введения антитела согласно настоящему изобретению примату (не человеку), моделирующему инфекцию, заболевание или рак, или их симптом. Предпочтительно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению было антителом, которое (а) перекрестно реагирует, по меньшей мере, с двумя человеческими ингибиторными рецепторами KIR на поверхности человеческих клеток NK и (b) перекрестно реагирует с клетками NK или с рецептором KIR примата (не человека).

Далее настоящим изобретением предусматривается способ обнаружения в биологическом образце или в живом организме присутствия клеток NK, имеющих на своей клеточной поверхности ингибиторный KIR, причем способ включает следующие этапы:

(a) приведение биологического образца или живого организма в контакт с антителами согласно настоящему изобретению, причем антитела конъюгированы или ковалентно связаны с распознаваемым фрагментом; и

(b) обнаружение присутствия антител в биологическом образце или живом организме.

Изобретение предусматривает также способ очистки из биологического образца клеток NK, имеющих на своей клеточной поверхности ингибиторный KIR, включающий следующие этапы:

(a) приведение образца в контакт с антителами согласно настоящему изобретению в условиях, которые обеспечивают связывание клеток NK, имеющих на своей клеточной поверхности ингибиторный KIR, с антителами, причем антитела конъюгированы или ковалентно связаны с твердым носителем (например, гранулами, матриксом и т.д.); и

(b) элюирование связанных клеток NK с антител, конъюгированных или ковалентно связанных с твердым носителем.

В следующем аспекте изобретение предусматривает антитело, фрагмент антитела или производное любого из них, содержащие легкий вариабельный участок (вариабельный участок легкой цепи) или один или более CDR (complementarity determining regions - участки, определяющие комплементарность антитела к антигену) из легких вариабельных участков антитела DF-200 или антитела Pan2D, как показано на фиг.12. Еще в другом аспекте изобретение предусматривает антитело, фрагмент антитела или производное любого из них, содержащие последовательность, в высокой степени подобную всей или по существу всей последовательности легкого вариабельного участка DF-200 или Pan2D или одного или более из CDR легких вариабельных участков одного или обоих из этих антител.

В дальнейшем аспекте изобретение предусматривает антитело, фрагмент антитела или производное любого из них, содержащие тяжелый вариабельный участок (вариабельный участок тяжелой цепи) или один или более CDR тяжелых вариабельных участков антитела DF-200, как показано на фиг.13. Еще в другом аспекте изобретение предусматривает антитело, фрагмент антитела или производное любого из них, содержащие последовательность, в высокой степени подобную всей или по существу всей последовательности тяжелого вариабельного участка DF-200.

Эти и дополнительные преимущества и особенности настоящего изобретения могут быть далее описаны в других разделах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 показывает связывание моноклональных антител DF-200 с общим детерминантом различных человеческих рецепторов KIR2DL.

Фиг.2 показывает нейтрализацию моноклональными антителами DF-200 опосредованного KIR2DL ингибирования цитотоксического действия позитивных по KIR2DL1 клеток NK на позитивные по Cw4 клетки-мишени.

Фиг.3 показывает моноклональные антитела DF-200, Fab-фрагмент DF-200 и специфические обычные антитела к KIR2DL1 или KIR2DL2/3, нейтрализующие опосредованное KIR2DL ингибирование цитотоксического действия позитивных по KIR2DL1 клеток NK на позитивные по Cw4 клетки-мишени и опосредованное KIR2DL ингибирование цитотоксического действия позитивных по KIR2DL2/3 клеток NK на позитивные по Cw3 клетки-мишени.

Фиг.4 показывает восстановление клеточного лизиса позитивных по HLA Cw4 клеток-мишеней клонами NK в присутствии фрагментов F(ab')2 антител DF-200 и ЕВ6.

Фиг.5 и Фиг.6 показывают моноклональные антитела DF-200, NKVSF1 (pan2D), человеческие антитела 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 и 1-6F1, а также обычные антитела, специфичные к KIR2DL1 или KIR2DL2/3, нейтрализующие опосредованное KIR2DL ингибирование цитотоксического действия позитивных по KIR2DL1 клеток NK на позитивные по Cw4 клетки-мишени (трансфицированные Cw4 клетки на Фиг.5 и клетки EBV на Фиг.6).

Фиг.7 показывает карту эпитопов, отражающую результаты опытов по конкурентному связыванию, полученные анализом поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore®) с антителами к KIR (к KIR2DL1), где перекрывающиеся кружки обозначают перекрывание в связывании с KIR2DL1. Результаты показывают, что антитела 1-7F9 - конкурируют в связывании с KIR2DL1 для ЕВ6 и 1-4F1, но не для NKVSF1 и DF-200. В свою очередь, антитела 1-4 F1 конкурируют с ЕВ6, DF-200, NKVSF1 и 1-7 F9. Антитела NKVSF1 конкурируют за связывание с KIR2DL1 с DF-200, 1-4F1 и ЕВ6, но не с 1-7F9. DF-200 конкурируют за связывание с KIR2DL1 с NKVSF1, 1-4F1 и ЕВ6, но не с 1-7F9.

Фиг.8 показывает карту эпитопов, отражающую результаты опытов по конкурентному связыванию, полученные анализом BIAcore® с антителами к KIR (к KIR2DL3), где перекрывающиеся кружки обозначают перекрывание в связывании с KIR2DL3. Результаты показывают, что антитела 1-4F1 конкурируют за связывание с KIR2DL3 с NKVSF1, DF-200, gl183 и 1-7F9. Антитела 1-7F9 конкурируют за связывание с KIR2DL3 с DF-200, gl183 и 1-4F1, но не с NKVSF1. NKVSF1 конкурируют за связывание с KIR2DL3 с DF-200, 1-4F1 и GL183, но не с 1-7F9. DF-200 конкурируют за связывание с KIR2DL3 с NKVSF1, 1-4F1 и 1-7F9, но не с GL183.

Фиг.9 показывает карту эпитопов, отражающую результаты опытов по конкурентному связыванию, полученные анализом BIAcore® с антителами к KIR (к KIR2DS1), где перекрывающиеся кружки обозначают перекрывание в связывании с KIR2DS1. Результаты показывают, что антитела 1-4F1 конкурируют за связывание с KIR2DS1 с NKVSF1, DF-200 и 1-7F9. Антитела 1-7F9 конкурируют за связывание с KIR2DS1 с 1-4F1, но не конкурируют с DF-200 и NKVSF1. NKVSF1 конкурируют за связывание с KIR2DS1 с DF-200 и 1-4F1, но не с 1-7F9. DF-200 конкурируют за связывание с KIR2DS1 с NKVSF1 и 1-4F1, но не с 1-7F9.

Фиг.10 показывает титрование NKVSF1 (Pan2D) mAb, демонстрирующее связывание mAb с клетками NK обезьян Cynomolgus. Клетки NK обезьян Cynomolgus (общая масса клеток NK на 16-й день) инкубировали с различными количествами Pan2D mAb с последующей обработкой конъюгированными с РЕ фрагментами F(ab')2 козьих антител к мышиному IgG (H+L). Процентное содержание позитивных клеток определяли с изотипическим контролем (очищенный мышиный IgG1). Пробы при отборе дублировали. MFI - средняя интенсивность флуоресценции.

Фиг.12 показывает сравнительное параллельное выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных участков легкой цепи и CDR вариабельных участков легкой цепи антител DF-200 и Pan2D mAb.

Фиг.13 показывает вариабельный участок тяжелой цепи антител DF-200.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитела

Настоящее изобретение предусматривает новые антитела и их фрагменты или производные, которые связываются с общими детерминантами человеческих ингибиторных рецепторов KIR, предпочтительно с детерминантом, имеющимися, по меньшей мере, на двух различных продуктах гена KIR2DL, и вызывают стимуляцию клеток NK, экспрессирующих, по меньшей мере, один из этих рецепторов KIR. В изобретении, прежде всего, раскрывается, что такие перекрестно реагирующие и нейтрализующие антитела могут быть получены, что является неожиданным результатом и открывает путь к новым и эффективным способам лечения, основанным на клетках NK, в особенности для человеческих индивидуумов. В предпочтительных вариантах осуществления антитела не являются моноклональными антителами NKVSF1.

В контексте данного изобретения термин «общий детерминант» обозначает детерминант или эпитоп, имеющийся (распределенный) в нескольких продуктах генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR. Предпочтительно, чтобы общий детерминант имелся, по меньшей мере, у двух представителей группы рецепторов KIR2DL. Более предпочтительно, чтобы детерминант имелся, по меньшей мере, у KIR2DL1 и KIR2DL2/3. Некоторые антитела настоящего изобретения могут, кроме распознавания нескольких продуктов гена KIR2DL, распознавать также детерминанты, имеющиеся у других ингибиторных KIR (таких, как продукт гена из группы рецепторов KIR3DL). Детерминант или эпитоп может представлять собой пептидный фрагмент или конформационный эпитоп, имеющийся у указанных представителей. В более специфическом варианте осуществления антитела настоящего изобретения специфически связываются с по существу тем же самым эпитопом, который распознается моноклональными антителами DF-200. Этот детерминант имеется и у KIR2DL1, и у KIR2DL2/3.

В пределах контекста настоящего изобретения термин - антитело, которое «связывается» с общим детерминантом, обозначает антитело, которое связывается с указанным детерминантом на основании специфичности или сродства (аффинности).

Термин «антитело», как он использован здесь, относится к поликлональным и моноклональным антителам, а также к фрагментам и производным указанных поликлональных и моноклональных антител, если это не определено иным образом или не противоречит очевидным образом контексту. В зависимости от типа константного домена в тяжелых цепях, антитела полной длины обычно относят к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них еще подразделяют на подклассы или изотипы - такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и подобные им. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают соответственно «альфа (α)», «дельта (δ)», «эпсилон (ε)», «гамма (γ)» и «мю (µ)». Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Предпочтительными классами антител, применяемых в настоящем изобретении, являются IgG и/или IgM, так как это - наиболее распространенные антитела в физиологическом процессе и их легче всего приготовить в лабораторных условиях. Предпочтительно антителами согласно настоящему изобретению являются моноклональные антитела. Поскольку одна из задач изобретения состоит в том, чтобы блокировать взаимодействие in vivo ингибиторного рецептора KIR и соответствующего ему лиганда HLA без ущерба для клеток NK, обычно предпочитают соответствующие рецепторам Fc изотипы, которые направляют слабую функцию эффектора (такие как IgG4).

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены с помощью различных методик, известных в данной области. Обычно их получают иммунизацией животных (не человека), предпочтительно мышей, иммуногеном, содержащим полипептид ингибиторного KIR, предпочтительно полипептид KIR2DL, более предпочтительно - полипептид KIR2DL человека. Полипептид ингибиторного KIR может содержать последовательность полной длины полипептида человеческого ингибиторного KIR или его фрагмента или производного, обычно это иммуногенный фрагмент, то есть часть полипептида, содержащая эпитоп, экспонированный на поверхности клеток, экспрессирующих ингибиторный рецептор KIR. Такие фрагменты, как правило, содержат, по меньшей мере, приблизительно 7 последовательных аминокислот из последовательности зрелого полипептида и даже более предпочтительно - по меньшей мере, приблизительно 10 его последовательных аминокислот. Как правило, фрагменты происходят из внеклеточного домена рецептора. Еще более предпочтителен полипептид человеческого KIR2DL, включающий, по меньшей мере, один, а предпочтительнее оба из внеклеточных иммуноглобулиновых доменов полипептида KIRDL полной длины и способный имитировать, по крайней мере, один конформационный эпитоп, имеющийся в рецепторе KIR2DL. В других вариантах осуществления указанный полипептид содержит, по меньшей мере, 8 последовательных аминокислот из внеклеточного иммуноглобулинового домена с аминокислотами в положениях 1-224 полипептида KIR2DL1 polypeptide (аминокислоты пронумерованы в соответствии с ВЕБ-сайтом PROW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm, описывающим семейство генов KIR).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления иммуноген содержит полипептид человеческого KIR2DL дикого типа в липидной мембране, обычно на поверхности клетки. В специфическом варианте осуществления иммуноген содержит неповрежденные (интактные) клетки NK, в особенности интактные человеческие клетки NK, по усмотрению обработанные или лизированные.

Этап иммунизации антигеном млекопитающего (не человека) может быть осуществлен любым способом, хорошо известным в данной области для стимулирования продуцирования антител у мышей (см., например, Harlow E. and Lane D. "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988). Далее иммуноген суспендируют или растворяют в буфере, по усмотрению с адъювантом - таким как полный адъювант Фройнда. Способы определения количества иммуногена, типов буфера и количеств адъюванта хорошо известны специалистам в данной области и никоим образом не являются ограничивающими для данного изобретения. Для разных иммуногенов эти параметры могут различаться, но легко могут быть определены.

Подобным же образом, в данной области хорошо известны локализация и частота иммунизации, достаточная для стимулирования продуцирования антител. В типичном режиме иммунизации животным (не людям) вводят антиген внутрибрюшинной инъекцией в 1-й день и затем снова неделей позднее. За этим следуют «напоминающие» инъекции антигена около 20-го дня, по усмотрению вместе с адъювантом - таким как неполный адъювант Фройнда. Напоминающие инъекции проводят внутривенно, и их можно повторять в течение нескольких последующих дней. За этим следует бустерная инъекция на 40-й день, либо внутривенная, либо внутрибрюшинная, обычно без адъюванта. Этот режим приводит приблизительно через 40 дней к появлению В-клеток, продуцирующих антиген-специфические антитела. Могут быть также использованы другие режимы, если они приводят к продуцированию В-клеток, экспрессирующих антитела к антигену, примененному в иммунизации.

Для приготовления поликлональных антител из иммунизированного животного (не человека) получают сыворотку и выделяют присутствующие в ней антитела с помощью хорошо известных методов. Сыворотку можно очистить аффинными методами с помощью любых из указанных выше иммуногенов, присоединенных к нерастворимому носителю, таким образом, чтобы получить антитела, реагирующие с ингибиторными рецепторами KIR.

В альтернативном варианте осуществления из неиммунизированного животного (не человека) выделяют лимфоциты, выращивают их in vitro и затем приводят в контакт с иммуногеном в культуре клеток. Затем лимфоциты отбирают и проводят этап слияния, описанный далее.

Для получения моноклональных антител следующим этапом является выделение из иммунизированного животного (не человека) спленоцитов и последующее слияние этих спленоцитов с бессмертными клетками, чтобы получить продуцирующие антитела гибридомы. Выделение спленоцитов из животного (не человека) хорошо известно в данной области и, как правило, включает удаление у анестезированного животного (не человека) селезенки, разрезание ее на маленькие кусочки и продавливание спленоцитов из селезеночной капсулы через нейлоновую сетку клеточного сита в подходящий буфер с получением суспензии отдельных клеток. Клетки промывают, центрифугируют и ресуспендируют в буфере, который лизирует все красные кровяные клетки. Раствор вновь центрифугируют и лимфоциты из осадка окончательно ресуспендируют в свежем буфере.

Будучи выделенными и находящимися в состоянии суспензии одиночных клеток, лимфоциты могут быть слиты с линией бессмертных клеток. Это обычно линия клеток мышиной миеломы, хотя в данной области известны многие другие линии бессмертных клеток, пригодные для создания гибридом. Предпочтительные линии мышиных гибридом включают (но не ограничиваются ими) линии, полученные из мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11 и предоставляемые Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A., клетки Х63 Ag8653 и SP-2, предоставляемые American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A. Слияние осуществляют с помощью полиэтиленгликоля или подобных добавок. Затем полученные гибридомы выращивают в селективной среде, содержащей одно или более из веществ, которые подавляют рост или выживаемость неслитых, родительских клеток миеломы. Например, если в родительских клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанин фосфорибозил-трансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом, как правило, содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин - вещества, предотвращающие рост дефицитных по HGPRT клеток (среда HAT).

Гибридомы выращивают, как правило, на питательном слое макрофагов. Макрофаги предпочтительно получают из животных того же помета, что и использованное для выделения спленоцитов млекопитающее (не человек). Обычно за несколько дней до высева спленоцитов проводят «затравку» макрофагов неполным адъювантом Фройнда или чем-нибудь подобным. Методы слияния описаны в Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice". Academic Press, 1986. С.59-103. Эта работа включена в настоящее описание ссылкой.

Клеткам дают расти в селективной среде в течение времени, достаточного для образования колоний и продуцирования антител. Обычно это время составляет от приблизительно 7 дней до приблизительно 14 дней. Затем колонии гибридом анализируют на продуцирование антител, которые перекрестно реагируют со многими продуктами гена ингибиторного рецептора KIR. Обычно для анализа применяют метод твердофазного иммуноферментного анализа ELISA с колориметрическим определением, хотя могут быть применены многие методы анализа, приспособленные к анализу ячеек, в которых растут гибридомы. Другие способы анализа включают иммунопреципитацию и радиоиммунологический анализ. Ячейки, дающие положительную реакцию на продуцирование нужных антител, обследуют на предмет того, присутствуют ли в них одна или больше из различимых колоний. Если имеется более одной колонии, клетки могут быть повторно клонированы и выращены, чтобы убедиться, что только одиночная клетка дала появление колонии, продуцирующей нужные антитела. Позитивные ячейки с явно одиночной колонией обычно подвергают повторному клонированию и повторно анализируют, чтобы удостовериться, что только один тип моноклональных антител обнаруживается и продуцируется. Антитела можно также получать путем селекции комбинаторных библиотек иммуноглобулинов, как раскрыто, например, в работе Ward и др. // Nature. 1989. Т.341. С.544.

Антитела согласно настоящему изобретению способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK; в особенности - ингибирование, опосредованное рецепторами KIR2DL, и более конкретно - ингибирование, по меньшей мере, и KIR2DL1, и KIR2DL2/3. Эти антитела поэтому являются «нейтрализующими» или «ингибирующими» антителами, в том смысле, что они блокируют, по меньшей мере, частично и заметно, ингибиторный сигнальный путь, опосредованный рецепторами KIR, когда они взаимодействуют с молекулами I класса МНС. Более важно, что эта ингибирующая активность распространяется на несколько типов ингибиторных рецепторов KIR, предпочтительно на несколько продуктов гена рецептора KIR2DL и более предпочтительно - по меньшей мере, и на KIR2DL1, и на KIR2DL2/3, так что эти антитела можно использовать с высокой эффективностью у различных индивидуумов. Нейтрализацию опосредованного KIR ингибирования цитотоксичности клеток NK можно оценить с помощью различных анализов или тестов - таких как анализ связывания или клеточные анализы.

Как только антитела, перекрестно реагирующие с несколькими ингибиторными рецепторами KIR, идентифицированы, их можно испытать на способность нейтрализовать ингибирующее действие этих рецепторов KIR в интактных клетках NK. В специфическом варианте осуществления нейтрализующую активность можно представить, как способность указанных антител восстанавливать лизис позитивных по HLA-C мишеней позитивными по KIR2DL клонами NK. В другом специфическом варианте осуществления нейтрализующая активность антител определяется способностью антител ингибировать связывание молекул HLA-C с рецепторами KIR2DL1 и KIR2DL3 (или близко родственным KIR2DL2), еще предпочтительнее - как способность антител изменять:

- связывание молекулы HLA-C, выбранной из Cw1, Cw3, Cw7 и Cw8 (или молекулы HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Asn), с KIR2DL2/3; и

- связывание молекулы HLA-C, выбранной из Cw2, Cw4, Cw5 и Cw6 (или молекулы HLA-C, имеющей в положении 80 остаток Lys), с KIR2DL1.

В другом варианте ингибиторную активность антител настоящего изобретения можно оценить в клеточном тесте на цитотоксичность, как далее раскрыто в приведенных Примерах.

В ином варианте ингибиторную активность антител настоящего изобретения можно оценить в тесте с высвобождением цитокина, где клетки NK инкубируют с испытуемыми антителами и с линией клеток-мишеней, экспрессирующих одну аллель HLA-C, распознаваемую молекулой KIR популяции NK, чтобы стимулировать продуцирование цитокина клетками NK (например, продуцирование ИФН-γ и/или GM-CSF). В приводимом для примера протоколе продуцирование ИФН-γ клетками РВМС оценивают путем окрашивания клеточной поверхности и внутрицитоплазматических областей и анализа через 4 дня культивирования с помощью проточной цитометрии. Вкратце, Брефелдин A (Brefeldin A (Sigma Aldrich)) может быть добавлен при конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл, по меньшей мере, на 4 ч в ходе культивирования. Затем перед пермеабилизацией (IntraPrep™; Beckman Coulter) клетки можно инкубировать с антителами анти-СD3 и анти-СD56 mAb и окрасить специфическими индикаторами PE-anti-ИФН-γ или РЕ-IgG1 (Pharmingen). Продуцирование GM-CSF и ИФН-γ в активированных поликлональных клетках NK можно измерить в надосадочных жидкостях методом ELISA (для GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; для ИФН-γ: OptE1A set, Pharmingen).

Антитела согласно настоящему изобретению могут частично или полностью нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK. Термин «нейтрализация опосредованного KIR ингибирования цитотоксичности клеток NK», как он использован здесь, означает способность усиливать, по меньшей мере, приблизительно на 20%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 30%, по меньшей мере, приблизительно на 40%, по меньшей мере, приблизительно на 50% или больше (например, приблизительно от 25% до 100%) специфический лизис, получаемый при том же самом соотношении с клетками NK или с линиями клеток NK, которые не блокированы их KIR, измеряемый по классическому тесту на цитотоксичность по высвобождению хромата, в сравнении с уровнем специфического лизиса, получаемого без антител, когда популяцию клеток NK, экспрессирующих данный KIR, приводят в контакт с клетками-мишенями, экспрессирующими соответствующие молекулы I класса МНС (распознаваемые KIR, экспрессируемыми на клетках NK). Например, предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению способны индуцировать лизис подобранных или совместимых по HLA, или популяций аутологичных клеток-мишеней, то есть популяций клеток, которые не лизируются эффективно клетками NK в отсутствие указанных антител. Поэтому антитела согласно настоящему изобретению можно также определить как способствующие активности клеток NK in vivo.

Альтернативно термин «нейтрализует опосредованное KIR ингибирование» означает, что в тесте с хроматом с использованием клона клеток NK или трансфектанта, экспрессирующего один или несколько из ингибиторных KIR, и клеток-мишеней, экспрессирующих только одну аллель HLA, которая распознается одним из KIR на клетке NK, полученный в присутствии антител уровень цитотоксичности будет, по меньшей мере, примерно на 20%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 30%, по меньшей мере, примерно на 40%, по меньшей мере, примерно на 50% (например, примерно от 25% до 100%) или более превышать цитотоксичность, получаемую с известными антителами, блокирующими молекулы I класса МНС (такими как антитела W6/32 к молекулам I класса МНС).

В специфическом варианте осуществления антитела связываются по существу с тем же эпитопом, что и моноклональные антитела DF-200 (продуцируемые гибридомами DF-200). Такие антитела здесь названы «DF-200-подобные антитела». В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления антителами являются моноклональные антитела. Более предпочтительными «DF-200-подобными антителами» настоящего изобретения являются антитела, иные чем моноклональные антитела NKVSF1. Наиболее предпочтительными являются моноклональные антитела DF-200 (продуцируемые гибридомами DF-200).

Термин «связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, как и» по отношению к представляющему интерес антителу, означает, что антитело «конкурирует» с указанным представляющим интерес антителом. Термин «связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, как и» по отношению к моноклональному антителу DF-200, означает, что антитело «конкурирует» с DF-200. Как правило, антитело, которое «связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, как и» представляющее интерес моноклональное антитело (например, DF-200, NKVSF1, 17F9), означает, что антитело «конкурирует» с представляющим интерес моноклональным антителом за любую одну из большего числа молекул KIR, предпочтительно это молекула KIR, выбранная из группы, состоящей из KIR2DL1 и KIR2DL2/3. В других примерах антитело, которое связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом на молекуле KIR2DL1, как и представляющее интерес антитело, «конкурирует» с представляющим интерес антителом за связывание с KIR2DL1. Антитело, которое связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом на молекуле KIR2DL2/3, как и представляющее интерес антитело, «конкурирует» с представляющим интерес антителом за связывание с KIR2DL2/3.

Термин «связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, как и» представляющее интерес антитело, означает, что антитело «конкурирует» с указанным представляющим интерес антителом за любую молекулу и за все молекулы KIR, с которыми специфически связывается указанное представляющее интерес антитело. Термин «связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, как и» моноклональное антитело DF-200, означает, что антитело «конкурирует» с DF-200 за любую молекулу и за все молекулы KIR, с которыми специфически связывается DF-200. Например, антитело, которое связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, как и моноклональные антитела DF-200 или NKVSF1, «конкурирует» с указанными DF-200 или NKVSF1 соответственно за связывание с KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 и KIR2DS2.

Идентификация одного или более антител, которое связывается (которые связываются) по существу или в основном с тем же самым эпитопом, как и описанные здесь моноклональные антитела, может быть легко осуществлена с помощью одного или нескольких иммунологических методов скринингового анализа, в которых можно оценить конкуренцию антител. Большое число таких методов анализа широко применяется на практике и хорошо известно в данной области (см., например, патент США №5660827, опубликованный 26 августа 1997 г., который включен в настоящее описание ссылкой). Следует понимать, что реальное определение эпитопа, с которым связывается описанное здесь антитело, ни в коей степени не является необходимым, чтобы идентифицировать антитело, связывающееся с тем же самым или по существу с тем же самым эпитопом, как и описанное здесь моноклональное антитело.

Например, если подлежащие анализу испытуемые антитела получены от различных животных или даже имеют различный иммуноглобулиновый изотип, может быть применен простой конкурентный анализ, в котором смешивают (или предварительно адсорбируют) контроль (например, DF-200) и испытуемые антитела и добавляют их к пробе, содержащей и KIR2DL1, и KIR2DL2/3, каждый из которых, как известно, связывается с DF-200. Для использования в таких простых исследованиях конкуренции годятся протоколы, основанные на различных модификациях ELISA, радиоиммуноанализе, вестерн-блотировании, и может быть применен анализ BIACORE (как он описан, например, далее, в разделе «Примеры»).

В некоторых вариантах осуществления можно предварительно смешать контрольные антитела (например, DF-200) с различными количествами испытуемых антител (например, в соотношении приблизительно 1:10 или приблизительно 1:100) на время до внесения пробы с антигеном - ингибиторным KIR. В других вариантах осуществления контроль и различные количества испытуемых антител могут быть просто смешаны в ходе экспонирования с пробой антигена KIR. Пока можно отличить связанные антитела от свободных (например, используя технику разделения или отмывания для удаления несвязанных антител) и DF-200 - от испытуемых антител (например, используя видо-специфичные или изотип-специфичные вторичные антитела или специфически помечая DF-200 распознаваемой меткой), можно определить, снижают ли испытуемые антитела связывание DF-200 с двумя различными антигенами KIR2DL, что указывало бы на то, что испытуемые антитела распознают по существу тот же самый эпитоп, что и DF-200. Связывание (меченых) контрольных антител в присутствии полностью не имеющих отношения к делу антител может служить контролем верхнего порога. Нижний порог контроля может быть получен путем инкубации меченых (DF-200) антител с немечеными антителами точно того же типа (DF-200), где может иметь место конкуренция, снижающая связывание меченых антител. В тестовом анализе существенное снижение реактивности меченых антител в присутствии испытуемых антител указывает на наличие испытуемых антител, которые распознают по существу тот же самый эпитоп, то есть эпитоп, «перекрестно реагирующий» с мечеными (DF-200) антителами. Любые испытуемые антитела, снижающие связывание DF-200 с каждым из антигенов KIR2DL1 и KIR2DL2/3, по меньшей мере, приблизительно на 50% (например, по меньшей мере, приблизительно на 60%, или предпочтительнее - по меньшей мере, приблизительно на 70% (к примеру, приблизительно на 65-100%)), при любом соотношении ОР-200 : испытуемое антитело в интервале от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100, рассматриваются как антитела, связывающиеся по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, что и DF-200. Предпочтительно, чтобы такие испытуемые антитела снижали связывание DF-200 с каждым из антигенов KIR2DL, по меньшей мере, приблизительно на 90% (например, приблизительно на 95%).

Конкуренцию можно оценить, например, с помощью проточной цитометрии. В таком тесте клетки, несущие данный KIR, можно вначале проинкубировать, например, с DF-200, а затем с испытуемыми антителами, мечеными флуорохромом или биотином. Можно сказать, что антитело конкурирует с DF-200, если связывание, полученное при преинкубации с насыщающим количеством DF-200, составляет приблизительно 80%, предпочтительно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%) от связывания (измеренного по флуоресценции), полученного с антителами без преинкубации с DF-200. В качестве альтернативы, считается, что антитело конкурирует с DF-200, если полученное с меченым (флуорохромом или биотином) DF-200 связывание с клетками, предварительно инкубированными с насыщающим количеством испытуемых антител, составляет приблизительно 80%, предпочтительно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%) от связывания, полученного без преинкубации с антителами.

Можно также с пользой применить простой анализ конкуренции, в котором испытуемые антитела предварительно адсорбируют и наносят при насыщающей концентрации на поверхность, на которой иммобилизованы и KIR2DL1, и KIR2DL2/3. Предпочтительной поверхностью для простого анализа конкуренции является чип BIACORE (или другая среда, пригодная для анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса). Затем контрольные антитела (например, DF-200) приводят в контакт с поверхностью при насыщающей концентрации KIR2DL1 и KIR2DL2/3 и измеряют связывание контрольных антител с поверхностью, несущей KIR2DL1 и KIR2DL2/3. Это связывание контрольных антител сравнивают со связыванием контрольных антител с поверхностью, несущей KIR2DL1 и KIR2DL2/3, в отсутствие испытуемых антител. В испытательном анализе значительное снижение связывания контрольных антител с поверхностью, несущей KIR2DL1 и KIR2DL2/3, в присутствии испытуемых антител указывает на то, что испытуемые антитела распознают по существу тот же самый эпитоп, что и контрольные антитела, так что испытуемые антитела являются «перекрестно реагирующими» по отношению к контрольным антителам. Любые испытуемые антитела, которые снижают связывание контрольных (таких, как DF-200) антител к каждому из антигенов KIR2DL1 и KIR2DL2/3, по меньшей мере, приблизительно на 30% или предпочтительнее - приблизительно на 40%, могут считаться антителами, которые связываются по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, что и контрольные антитела (например, DF-200). Предпочтительно, чтобы указанные испытуемые антитела снижали связывание контрольных антител (например, DF-200) с каждым из антигенов KIR2DL, по меньшей мере, приблизительно на 50% (например, по меньшей мере, примерно на 60%, по меньшей мере, примерно на 70% или более). Следует признать, что порядок внесения контрольных и испытуемых антител может быть изменен: это значит, что контрольные антитела могут быть первыми связаны с поверхностью, а после этого испытуемые антитела приводят в контакт с поверхностью в анализе конкуренции. Предпочтительно, чтобы с поверхностью, содержащей KIR2DL1 и KIR2DL2/3, первыми были связаны антитела, имеющие большее сродство к антигенам KIR2DL1 и KIR2DL2/3, поскольку можно ожидать, что уменьшение связывания, обнаруживаемое для вторых антител (в предположении, что антитела являются перекрестно реагирующими), будет более значительным. Дополнительные примеры таких анализов приведены в разделе «Примеры» и, например, в работе Saunal and Regenmortel // J. Immunol. Methods. 1995. Т.183. С.33-41, сведения которой включены в настоящее описание ссылкой.

Хотя описанные в контексте настоящей заявки способы для DF-200 приведены в целях примера, следует признать, что описанные выше способы скринингового иммунологического анализа могут быть применены также для идентификации антител, которые конкурируют с NKVSF1, 1-7F9, ЕВ6, GL183, а также других антител, соответствующих настоящему изобретению.

После иммунизации и продуцирования антител у позвоночного животного или в клетке для выделения антител могут быть осуществлены особые стадии отбора, как указано в Формуле изобретения. Что касается этого, в конкретном варианте осуществления изобретение также относится к способам продуцирования таких антител, включающим:

(a) иммунизацию млекопитающего (не человека) иммуногеном, содержащим полипептид ингибиторного KIR;

(b) приготовление антител из иммунизированного животного, причем антитела связываются с полипептидом KIR;

(c) отбор антител из этапа (b), которые перекрестно реагируют, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов ингибиторных KIR; и

(d) отбор антител из этапа (с), которые способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в популяции клеток NK, экспрессирующих, по меньшей мере, два различных продукта генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR.

Отбор антитела, которое перекрестно реагирует, по меньшей мере, с двумя различными продуктами генов ингибиторных KIR, может быть достигнут скринингом антител против двух или более различных антигенов ингибиторных KIR - например, как описано выше.

В более предпочтительном варианте осуществления антитела, приготовленные в этапе (b), являются моноклональными антителами. Так, термин «приготовление антител из иммунизированного животного», как он использован здесь, включает получение из иммунизированного животного В-клеток и использование этих В-клеток для получения гибридом, экспрессирующих антитела, а также получение антител непосредственно из сыворотки иммунизированного животного. В другом предпочтительном варианте осуществления антитела, отобранные в этапе (с), - это те антитела, которые перекрестно реагируют, по меньшей мере, с KIR2DL1 и KIR2DL2/3.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления антитела, отобранные в этапе (d), вызывают у клеток-мишеней, экспрессирующих соответствующую молекулу I класса HLA, по меньшей мере, приблизительно 10%-ный специфический лизис, опосредованный действием клеток NK, обнаруживающих, по меньшей мере, один распознаваемый антителами KIR, и предпочтительно - по меньшей мере, приблизительно 40%-ный специфический лизис, по меньшей мере, приблизительно 50%-ный специфический лизис, или более предпочтительно - по меньшей мере, приблизительно 70%-ный специфический лизис (например, приблизительно 60-100%-ный специфический лизис), измеряемый в стандартном тесте высвобождения хромата, в сравнении с лизисом или цитотоксичностью, получаемыми при таком же соотношении эффектор/мишень с клетками NK, которые не блокированы их рецепторами KIR. В качестве альтернативы, если отобранные в этапе (d) антитела используются в тесте с хроматом с применением клона клеток NK, экспрессирующих один или несколько из ингибиторных KIR, и клеток-мишеней, экспрессирующих только одну аллель HLA, которая распознается одним из KIR на клоне NK, полученный с этими антителами уровень цитотоксичности должен быть, по меньшей мере, примерно 20%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 30% или более, от уровня цитотоксичности, полученного с блокирующими моноклональными антителами (mAb) к молекулам 1 класса МНС - с такими, как антитела W6/32 к молекулам 1 класса МНС.

Порядок этапов (с) и (d) в описанном выше способе может быть изменен. По усмотрению, способ может также или альтернативно дополнительно включать добавочные этапы получения фрагментов моноклональных антител или производных моноклональных антител или таких фрагментов (например, как описано в настоящем описании).

В предпочтительном варианте осуществления животным (не человеком), используемым для получения антител согласно пригодным для применения способам настоящего изобретения, является млекопитающее - такое, как грызун (например, мышь, крыса и т.д.), крупный рогатый скот, свинья, лошадь, кролик, коза, овца и т. д. Млекопитающее (не человек) может быть также генетически модифицировано или сконструировано, чтобы продуцировать «человеческие» антитела. Такими млекопитающими могут быть, например, Xenomouse™ (Abgenix) или HuMAb-Mouse™ (Medarex).

В другом варианте изобретение предусматривает способ получения антител, включающий:

(a) отбор, из библиотеки или набора, моноклонального антитела, фрагмента моноклонального антитела или производного любого из них, которое перекрестно реагирует с продуктами, по меньшей мере, двух различных генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR2DL, и

(b) отбор антитела, фрагмента или производного (а), способного нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK, экспрессирующих продукты, по меньшей мере, двух различных генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR2DL.

Набором может быть любой (рекомбинантный) набор антител или их фрагментов, по усмотрению (т.е. не обязательно) представленный любой подходящей структурой (например, фагом, бактерий, синтетическим комплексом и т.д.). Отбор ингибиторных антител может производиться, как уже было раскрыто выше и будет далее проиллюстрировано примерами.

Согласно другому варианту осуществления изобретение предусматривает гибридому, представляющую собой В-клетку из хозяина, не являющегося человеком, причем В-клетка продуцирует антитело, связывающееся с детерминантом, имеющимся на продуктах, по меньшей мере, двух различных генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, и антитело способно нейтрализовать ингибиторную активность рецепторов. Предпочтительнее, чтобы гибридома согласно этому аспекту изобретения не была гибридомой, продуцирующей моноклональное антитело NKVSF1. Гибридома согласно этому аспекту изобретения может быть создана, как описано выше, путем слияния спленоцитов из иммунизированного млекопитающего, не являющегося человеком, с линией бессмертных клеток. Полученные таким слиянием гибридомы могут быть отсортированы на наличие такого перекрестно реагирующего антитела, как описано в настоящем описании. Предпочтительно, чтобы гибридома продуцировала антитело, которое распознает детерминант, присутствующий на продуктах, по меньшей мере, двух различных генов KIR2DL и усиливает действие клеток NK, экспрессирующих, по меньшей мере, один из этих рецепторов KIR. Еще предпочтительнее, чтобы гибридома продуцировала антитело, которое связывается по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, что и DF-200, и усиливает активность клеток NK. Наиболее предпочтительно, чтобы гибридомой была гибридома DF-200, продуцирующая моноклональное антитело DF-200.

Гибридомы, для которых подтверждено продуцирование моноклональных антител настоящего изобретения, могут быть выращены в более значительных количествах в подходящей среде - такой как DMEM или RPMI-1640. В качестве альтернативы, клетки гибридом можно вырастить in vivo как асцитные опухоли в животном.

После того, как достигнут достаточный рост для продуцирования необходимых антител, содержащую моноклональные антитела ростовую среду (или асцитную жидкость) отделяют от клеток и очищают присутствующие в ней моноклональные антитела. Очистку обычно осуществляют с помощью электрофореза в геле, диализа, хроматографии на сефарозе с пришитым белком А или сефарозе с пришитым белком G, или же на иммуноглобулине к мышиным антителам, связанным с нерастворимым носителем - таким как гранулы агарозы или сефарозы (все эти методы описаны, например, в «Antibody Purification Handbook», Amersham Biosciences, публикация №18-1037-46, издание АС, чье содержание включено в настоящее описание посредством ссылки). Связанные антитела, как правило, элюируют с колонок с белком А или белком G буферами с низким рН (глициновый или ацетатный буферы с рН 3,0 или ниже). Содержащие антитела фракции немедленно нейтрализуют. Эти фракции объединяют, диализуют и концентрируют, как необходимо.

Согласно альтернативному варианту осуществления, ДНК, кодирующую антитело, которое связывается с детерминантом, имеющимся на продуктах, по меньшей мере, двух различных генов человеческих ингибиторных рецепторов KIR, выделяют из гибридом настоящего изобретения и помещают в подходящий экспрессирующий вектор для трансфекции подходящему хозяину. Затем хозяин используется для рекомбинантного продуцирования антител или их вариантов - таких как «гуманизированные» версии таких моноклональных антител, активные фрагменты антител или химерные антитела, содержащие распознающую антиген часть антитела. Предпочтительно, чтобы использованная в этом варианте осуществления ДНК кодировала антитело, которое распознает детерминант, имеющийся в продуктах, по меньшей мере, двух различных генов KIR2DL, и усиливает действие клеток NK, экспрессирующих, по меньшей мере, один из этих рецепторов KIR. Еще предпочтительнее, чтобы ДНК кодировала антитело, связывающееся по существу с тем же самым эпитопом или детерминантом, что и DF-200, и усиливающее активность клеток NK. Наиболее предпочтительно, чтобы ДНК кодировала моноклональное антитело DF-200.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела настоящего изобретения, можно легко выделить и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). После выделения ДНК можно поместить в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева - такие как клетки Е. coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы получить синтез моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная экспрессия в бактериях ДНК, кодирующей антитела, хорошо известна в данной области (см., например, Skerra и др. // Curr. Opinion in Immunol. 1993. Т.5. С.256; и Pluckthun // Immunol. Revs. 1992. Т.130. С.151.

Фрагменты и производные моноклональных антител

Фрагменты и производные антител настоящего изобретения (которые охватываются терминами «антитело» или «антитела», как они использованы в этой заявке, если не установлено иное или если это явно не противоречит контексту), предпочтительно DF-200-подобные антитела, могут быть получены с помощью приемов, известных в данной области. «Иммунореактивные фрагменты» содержат часть интактного антитела, обычно антиген-связывающий сайт или вариабельный участок. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ и Fv; диа-антитела (двойные антитела, diabodies); любой фрагмент антитела, являющийся полипептидом, имеющим первичную структуру, состоящую из одной неразорванной последовательности смежных аминокислотных остатков (которые здесь носят название «одноцепочечный фрагмент антитела» или «одноцепочечный полипептид»), включая (но не ограничиваясь ими) (1) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), (2) одноцепочечные полипептиды, содержащие только один вариабельный домен легкой цепи или его фрагменты, содержащие три CDR вариабельного домена легкой цепи, без присоединенной части тяжелой цепи, и (3) одноцепочечные полипептиды, содержащие только один вариабельный участок тяжелой цепи или его фрагмент, содержащий три CDR вариабельного участка тяжелой цепи, без присоединенной части легкой цепи; и полиспецифические антитела, образованные фрагментами антител. Например, фрагменты Fab или F(ab')2 могут быть получены протеазным расщеплением выделенных антител, согласно общепринятым методам. Следует признать, что иммунореактивные фрагменты могут быть модифицированы с помощью известных методов - например, для замедления выведения in vivo и получения более приемлемого фармакокинетического профиля фрагмент может быть модифицирован полиэтиленгликолем (ПЭГ). Способы связывания и сайт-специфического конъюгирования ПЭГ с фрагментом Fab' описаны, например, в работах Leong и др. // Cytokine. 2001. Т. 16, №3. С.106-119; и Delgado и др. // Brit. J. Cancer. 1996. Т.73. №2. С.175-182, содержание которых включено в настоящее описание ссылкой.

В частном аспекте, изобретение предусматривает антитела, фрагменты антител и производные антител, содержащие последовательность вариабельного участка легкой цепи DF-200, как показано далее на фиг.12. В другом частном аспекте изобретение предусматривает антитела, фрагменты антител и производные антител, содержащие последовательность вариабельного участка легкой цепи Pan2D, как показано далее на фиг.12. В другом аспекте изобретение предусматривает антитела, фрагменты антител и производные антител, содержащие один или более из CDR вариабельного участка легкой цепи DF-200, как показано далее на фиг.12. Еще в одном аспекте изобретение предусматривает антитела, фрагменты антител и производные антител, содержащие один или более из CDR вариабельного участка легкой цепи Pan2D, как показано далее на фиг.12. Функциональные варианты/аналоги таких последовательностей могут быть созданы путем подходящих замен, вставок и/или делеций в этих аминокислотных последовательностях, сделанных с помощью стандартных методов, которым может способствовать сопоставление последовательностей. Так, например, остатки CDR, которые являются консервативными в сравнении Pan2D и DF-200, могут быть пригодными мишенями для модификации, так как такие остатки могут не давать вклада в различные профили конкуренции этих антител с другими антителами, раскрытыми в настоящем изобретении (хотя Pan2D и DF-200 не являются конкурентами), и поэтому могут не давать вклада в специфичность этих антител по отношению к их конкретным соответственным эпитопам. В ином аспекте для делеций, замен и/или вставок могут быть пригодны положения, которые аминокислотный остаток занимает в последовательности одного из этих антител, но не других.

В отдельном аспекте изобретение предусматривает антитела, фрагменты антител и производные антител, содержащие последовательность вариабельного участка тяжелой цепи DF-200, как показано на фиг.13. В другом аспекте изобретение предусматривает антитела, фрагменты антител и их производные, содержащие один или более из CDR вариабельного участка тяжелой цепи DF-200, как показано на фиг.13. Функциональные варианты/аналоги таких последовательностей могут быть созданы путем подходящих замен, вставок и/или делеций в этих раскрытых аминокислотных последовательностях, сделанных с помощью стандартных методов, которым может способствовать сопоставление последовательностей. В ином аспекте для делеций, замен и/или вставок могут быть пригодны положения, которые аминокислотный остаток занимает в последовательности одного из этих антител, но не других.

В качестве альтернативы, ДНК гибридому, продуцирующую антитело согласно настоящему изобретению, предпочтительно DF-200-подобное антитело, можно модифицировать таким образом, чтобы она кодировала фрагмент антитела согласно настоящему изобретению. Модифицированную ДНК затем вставляют в экспрессирующий вектор и используют для трансформации или трансфекции подходящей клетки, которая после этого экспрессирует необходимый фрагмент.

В альтернативном осуществлении ДНК гибридому, продуцирующую антитело согласно настоящему изобретению, предпочтительно DF-200-подобное антитело, можно модифицировать до вставления в экспрессирующий вектор - например, путем замещения кодирующей последовательностью для человеческих константных доменов тяжелой и легкой цепей гомологичных не человеческим последовательностям (например, Morrison и др.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984. Т.81. С.6851), или путем присоединения к последовательности, кодирующей иммуноглобулин, всей или части кодирующей последовательности для неиммуноглобулинового полипептида. Таким образом, готовят «химерные» или «гибридные» антитела, имеющие специфичность связывания исходного антитела. Как правило, такие неиммуноглобулиновые полипептиды замещают константные домены антител согласно настоящему изобретению.

Итак, согласно другому варианту осуществления антитела, предпочтительно DF-200-подобные антитела, подвергаются «гуманизации». «Гуманизированные» (humanized) формы антител согласно настоящему изобретению представляют собой специфические химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антиген-связывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из мышиного иммуноглобулина. По большей части, гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (реципиентные антитела), в которых остатки из определяющих комплементарность участков (complementary-determining region, CDR) реципиента заменены остатками из CDR исходного антитела (донорного антитела), но которые сохраняют необходимые специфичность, сродство (аффинность) и емкость исходного антитела. В некоторых случаях аминокислотные остатки остова Fv человеческого иммуноглобулина могут быть заменены соответствующими не человеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которых нет ни в реципиентном антителе, ни во вставленных последовательностях CDR или остова. Эти модификации делают, чтобы усовершенствовать и оптимизировать качество антител. Как правило, гуманизированное антитело по существу содержит, по меньшей мере, один, а обычно два из вариабельных доменов, в которых все или по существу все из участков CDR соответствуют этим участкам исходного антитела, а все или по существу все из участков остова (framework, FR) - это участки консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела оптимально содержат также, по меньшей мере, часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно участка человеческого иммуноглобулина. Детально изложено в: Jones и др. // Nature. 1986. Т.321. С.522; Reichmann и др. // Nature. 1988. Т.332. С.323; и Presta // Curr. Op. Struct. Biol. 1992. Т.2. С.593.

Способы гуманизации антител согласно настоящему изобретению хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению имеет включенный один или более аминокислотных остатков из исходного антитела. Эти мышиные или иные не человеческие аминокислотные остатки часто называют «импортными» остатками, которые обычно взяты из «импортного» вариабельного домена. Гуманизация по существу может быть выполнена по методу Winter с соавторами (Jones и др. // Nature. 1986. Т.321. С.522; Riechmann и др. // Nature. 1988. Т.332. С.323; Verhoeyen и др. // Science. 1988. Т.239. С.1534). В соответствии с этим такими «гуманизированными» антителами являются химерные антитела (Cabilly и др. Патент США №4816567), где часть, существенно меньшая интактного человеческого вариабельного домена, была замещена соответствующей последовательностью из исходного антитела. На практике гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению - это обычно человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных сайтов в исходном антителе.

Для снижения антигенности очень важен выбор человеческих вариабельных доменов, и легких, и тяжелых, подлежащих использованию в создании гуманизированных антител. Согласно так называемому методу «наилучшего совпадения» («best fit»), проводится скрининг последовательности вариабельного домена антитела данного изобретения в сравнении с полной библиотекой известных последовательностей человеческого вариабельного домена. Человеческую последовательность, которая наиболее близка к таковой у мыши, затем принимают как человеческий остов (framework, FR) для гуманизированного антитела (Sims и др.// J. Immunol. 1993. Т.151. С.2296; Chothia and Lesk // J. Mol. Biol. 1987. Т.196. С.901. В другом способе использован особый остов из консенсусной последовательности всех человеческих антител отдельной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же остов можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. Т.89. С.4285; Presta др. // J. Immunol. 1993. Т.51).

Далее важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокого сродства ко многим ингибиторным рецепторам KIR и других полезных биологических свойств. Для достижения этой цели согласно предпочтительному способу гуманизированные антитела готовят в процессе анализа родительских последовательностей и различных умозрительных гуманизированных продуктов с помощью трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина широко доступны и известны специалистам в данной области. Имеются компьютерные программы, иллюстрирующие и конструирующие возможные трехмерные конформационные структуры отобранных перспективных последовательностей иммуноглобулина. Обследование этих конструкций позволяет проанализировать вероятную роль аминокислотных остатков в функционировании последовательности перспективного иммуноглобулина, то есть выявляются остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связывать свой антиген. Таким образом, остатки FR могут быть отобраны и составлены из консенсусной и импортной последовательностей, так что достигается требуемая характеристика необходимого антитела - такая как повышенное сродство к антигену-мишени (антигенам-мишеням). Как правило, остатки CDR прямым образом и наиболее существенно влияют на связывание антигена.

Другой способ получения «гуманизированных» моноклональных антител состоит в использовании в роли мышей для иммунизации трансгенного животного - XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA). XenoMouse - это мышь-хозяин согласно настоящему изобретению, у которого его гены иммуноглобулина заменены функциональными человеческими генами иммуноглобулина. Поэтому антитела, продуцируемые этой мышью или гибридомами, сделанными из В-клеток этой мыши, уже гуманизированы. XenoMouse описана в патенте США №6162963, который включен в настоящую заявку ссылкой в своей полноте. Аналогичный способ может быть осуществлен при использовании трансгенного животного - HuMAb-Mouse™ (Medarex).

Человеческие антитела можно также получить с помощью различных других методик - например, используя для иммунизации других трансгенных животных, сконструированных так, чтобы экспрессировать набор человеческих антител (Jakobovitz и др. // Nature. 1993. Т.362. С.255), или путем селекции набора антител с применением методов фагового конструирования. Такие методики известны опытным специалистам и могут быть осуществлены, начиная с моноклональных антител в качестве исходных, как раскрыто в данной заявке.

Антитела согласно настоящему изобретению, предпочтительно DF-200-подобные антитела, могут также быть модифицированы в «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична с соответствующими последовательностями в исходном антителе, тогда как остаток цепи (цепей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида, или принадлежащим другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, поскольку они проявляют требуемую биологическую активность (Cabilly и др., см. выше; Morrison и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984 Т.81. С.6851).

Другие производные в пределах охвата данного изобретения включают функционализованные антитела, то есть антитела, конъюгированные или ковалентно соединенные с токсином - таким как рицин, дифтерийный токсин, абрин и экзотоксин Pseudomonas; с распознаваемой частью молекулы - с такой как флуоресцентный зонд, радиоизотопная метка или визуализирующий агент; или с твердым носителем - таким как гранулы агарозы и т.п. Методы конъюгирования или ковалентного соединения других агентов с антителами хорошо известны в данной области.

Конъюгирование с токсином полезно для адресованного уничтожения клеток NK, проявляющих на своей клеточной поверхности один из перекрестно реагирующих рецепторов KIR. Когда антитело настоящего изобретения связывается с клеточной поверхностью такой клетки, оно интернализуется, и токсин высвобождается внутрь клетки, избирательно ее убивая. Такое применение представляет собой дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения.

Конъюгирование с распознаваемой частью молекулы полезно, когда антитела настоящего изобретения применяются в целях диагностики. Такие цели включают (но не ограничиваются ими) обследование биологических проб на наличие клеток NK, несущих на своей клеточной поверхности перекрестно реагирующий рецептор KIR, и обнаружение в живом организме наличия клеток NK, несущих перекрестно реагирующий KIR. Такие способы обследования и обнаружения также являются дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Конъюгирование антител согласно настоящему изобретению с твердым носителем полезно как средство аффинной очистки из источника - такого как биологическая жидкость, клеток NK, несущих на своей клеточной поверхности перекрестно реагирующий рецептор KIR. Этот способ очистки является еще одним дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения, поскольку он приводит к получению очищенной популяции клеток NK.

В дополнительном варианте осуществления антитела настоящего изобретения, в том числе NKVSF1, связывающиеся с общим детерминантом, имеющимся на продуктах генов, по меньшей мере, двух различных человеческих ингибиторных рецепторов KIR, где указанные антитела способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование цитотоксичности клеток NK в клетках NK, экспрессирующих, по меньшей мере, один из указанных двух различных человеческих ингибиторных рецепторов KIR, могут быть включены в липосомы («иммунолипосомы»), одни или вместе с другим веществом для адресованной доставки животному. Такие другие вещества включают нуклеиновые кислоты для доставки генов при генной терапии или для доставки антисмысловой РНК, интерферирующей РНК или малой интерферирующей РНК с целью супрессии генов в клетках NK, или токсины или яды для адресованного уничтожения клеток NK.

Компьютерное моделирование внеклеточных доменов KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 (KIR2DL1-3), основанное на их опубликованных кристаллических структурах (Maenaka и др. (1999), Fan и др. (2001), Boyington и др. (2000)), предсказало участие определенных участков KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 во взаимодействии между KIR2DL1 и перекрестно реагирующими с KIR2DL1-3 мышиными моноклональными антителами DF-200 и NKVSF1. Так, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела, которые связываются с KIR2DL1 только в пределах участка, определяемого аминокислотами (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192). В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с KIR2DL1 и KIR2DL2/3 без взаимодействия с аминокислотными остатками вне участка, определяемого аминокислотными остатками (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192).

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с KIR2DL1 и не связывающиеся с мутантным KIR2DL1, в котором R131 - это Аlа.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с KIR2DL1 и не связывающиеся с мутантным KIR2DL1, в котором R157 - это Аlа.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с KIR2DL1 и не связывающиеся с мутантным KIR2DL1, в котором R158 - это Аlа.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с аминокислотными остатками (131, 157, 158) KIR2DL1.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся с KIR2DS3(R131W), но не с диким типом KIR2DS3.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся и с KIR2DL1, и с KIR2DL2/3, а также с KIR2DS4.

В другом варианте осуществления изобретение предусматривает антитела, связывающиеся и с KIR2DL1, и с KIR2DL2/3, но не с KIR2DS4.

Определить, связывается ли антитело в пределах одного из участков эпитопа, определенных выше, можно методами, известными специалистам в данной области. Как один из примеров таких методов картирования/характеристики, участок эпитопа для антитела к KIR можно определить методом «расшифровки следов» (foot-printing) с помощью химической модификации экспонированных аминов/карбоксилов в белке KIR2DL1 или KIR2DL2/3. Один из конкретных примеров такой техники расшифровки следов состоит в использовании регистрируемого с помощью масс-спектрометрии обмена водород/дейтерий (hydrogen-deuterium exchange detected by mass spectrometry, HXMS), где происходят обмен водород/дейтерий в амидах белков рецептора и лиганда, связывание и обратный обмен, причем амидные группы скелета, участвующие в связывании белка, защищены от обратного обмена и остаются поэтому дейтерированными. На этой стадии имеющие отношение к делу участки могут быть идентифицированы с помощью пептидного протеолиза, быстрого разделения микропроб высокоэффективной жидкостной хроматографией и/или масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (см., например, работы: Ehring Н. // Analytical Biochemistry. 1999. Т.267. №2. С.252-259; и/или Engen J.R. and Smith D.L. //Anal. Chem. 2001. Т.73. С.256А-265А). Другим примером подходящей техники идентификации эпитопа является картирование эпитопа с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР), где обычно сопоставляют положения сигналов в спектрах двумерного ЯМР у свободного антигена и антигена в комплексе со связывающимся с антигеном пептидом - таким как антитело. Как правило, в антиген селективно вводят изотопную метку ¹⁵N, так что в спектре ЯМР видны только сигналы, соответствующие антигену, а сигналы от связывающегося с антигеном пептида не видны. Обычно положение сигналов антигена от аминокислот, вовлеченных во взаимодействие с антиген-связывающимся пептидом, смешено в спектрах комплекса по сравнению со спектрами свободного антигена, что позволяет таким образом идентифицировать аминокислоты, участвующие в связывании. Для примеров см. работы: // Ernst Schering Res. Found. Workshop. 2004. Т.44. С.149-167; Huang и др. // J. Molec. Biol. 1998. Т.281. №1. С.61-67; и Saito and Patterson // Methods. 1996. Т.9, №3. С.516-524. Картирование с получением характеристик эпитопов может быть также осуществлено с применением методов масс-спектрометрии (см., например, Downward // J. Mass Spectrom. 2000. Т.35. №4. С.493-503; и Kiselar and Downard // Anal Chem. 1999. Т.71, №9. С.1792-1801.

Техника протеазного расщепления также может быть полезна в контексте картирования и идентификации эпитопов. Связанные с антигенным детерминантом участки/последовательности могут быть определены с помощью протеазного расщепления - например, расщепления при 37°С и рН 7-8 с использованием трипсина в отношении приблизительно 1:50 к KIR2DL1 или KIR2DL2/3, с последующим масс-спектрометрическим (МС) анализом для идентификации пептидов. Пептиды, защищенные от расщепления трипсином, связанным антителом к KIR, могут быть затем идентифицированы путем сравнения образцов, подвергнутых расщеплению трипсином, и образцов, инкубированных с антителами и затем подвергнутых расщеплению, например, трипсином (таким путем обнаруживая «отпечаток следа» связанного компонента). В подобных простых методах получения характеристик эпитопов могут быть также или альтернативно использованы другие ферменты - такие как химотрипсин, пепсин и т. д. Кроме того, ферментативное расщепление может дать быстрый способ анализа того, находится ли последовательность потенциального антигенного детерминанта в пределах участка KIR2DL1, в том смысле, что полипептид анти-KIR, который не проявляется на поверхности, вследствие этого скорее всего не будет выявлен способами на основе иммуногенности/антигенности. Для обсуждения подобных методик см., например, работу Manca // Ann. Ist. Super Sanita. 1991. Т.27, №1. С.15-19.

Перекрестная реактивность в обезьянах Cynomolgus

Было установлено, что антитела NKVSF1 связываются также с клетками NK из обезьян Cynomolgus (см. пример 7). Поэтому изобретение предусматривает антитела, а также их фрагменты и производные, где антитела, фрагменты или производные перекрестно реагируют, по меньшей мере, с двумя человеческими ингибиторными рецепторами KIR на поверхности человеческих клеток NK и, в дополнение к этому, связываются с клетками NK из обезьян Cynomolgus. В одном из вариантов осуществлений антитела не являются антителами NKVSF1. Изобретение предусматривает также способ определения токсичности антител, а также их фрагментов и производных, где антитела, фрагменты или производные перекрестно реагируют, по меньшей мере, с двумя человеческими ингибиторными рецепторами KIR на поверхности человеческих клеток NK, причем способ включает испытание антител в обезьянах Cynomolgus.

Композиции и введение

Изобретение предусматривает также фармацевтические композиции, содержащие антитела, а также их фрагменты или производные, где указанные антитела, фрагменты или производные перекрестно реагируют, по меньшей мере, с двумя ингибиторными рецепторами KIR на поверхности клеток NK, нейтрализуют их ингибиторные сигналы и усиливают активность этих клеток, в подходящем носителе в количестве, эффективном для заметного повышения цитотоксичности клеток NK у пациента или в биологическом образце, содержащем клетки NK. Композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Такие композиции носят также название «композиции с антителами согласно настоящему изобретению». В одном из вариантов осуществлений композиции с антителами согласно настоящему изобретению содержат антитела, раскрытые в приведенных выше вариантах осуществления. Антитела NKVSF1 входят в круг антител, которые могут присутствовать в композициях с антителами согласно настоящему изобретению.

Термин «биологический образец», как он использован в настоящей заявке, включает (но не ограничивается ими) биологическую жидкость (например, сыворотку, лимфу, кровь), клеточный образец или образец ткани (например, костный мозг).

Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть использованы в этих композициях, включают (но не ограничиваются ими) ионообменники, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки (такие как человеческий сывороточный альбумин), буферные вещества - такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси частичных глицеридов с насыщенными растительными жирными кислотами, вода, соли или электролиты - такие как протаминсульфат, двузамещенный фосфат натрия, кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная двуокись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, полиакрилаты, парафины, блочные сополимеры полиэтилена с полиоксипропиленом, полиэтиленгликоль и ланолин.

Композиции настоящего изобретения могут быть применены в способе повышения активности клеток NK у пациента или в биологическом образце. Этот способ включает этап контактирования композиции с пациентом или биологическим образцом. Такой способ будет полезен как для диагностических, так и для терапевтических целей.

Для использования вместе с биологическим образцом композиция с антителами может быть введена простым смешиванием с образцом или внесением прямо в образец, в зависимости от природы образца (жидкость или твердое вещество). Биологический образец может быть приведен в контакт прямо с антителами в любом подходящем приспособлении (чашка, пакет, флакон и т.д.). Для использования у пациента композиция должна быть составлена для введения пациенту.

Композиции настоящего изобретения можно вводить перорально, парентерально, ингаляционным распылением, поверхностно, ректально, интраназально, защечно, интравагинально или через имплантированный резервуар. Термин «парентеральный», как он использован здесь, включает подкожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставной, внутригрудинный, внутриоболочечный, внутрипеченочный, внутрь пораженного места и внутричерепной способ инъекции или вливания. Предпочтительно пероральное, внутрибрюшинное или внутривенное введение композиций.

Стерильные пригодные для инъекции формы композиций настоящего изобретения могут быть водными или масляными суспензиями. Эти суспензии могут быть составлены согласно известным в данной области методикам с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильным пригодным к инъекции препаратом могут быть также стерильные пригодные к инъекции раствор или суспензия в нетоксичном подходящим для парентерального введения разбавителе или растворителе, как, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Пригодными к применению приемлемыми носителями и растворителями являются вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлористого натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно применяют стерильные нелетучие масла. Для этой цели может быть применено любое легкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Для приготовления инъецируемых препаратов пригодны жирные кислоты - такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, а также природные фармацевтически приемлемые масла - такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно их полиоксиэтилированные производные. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергатор - такой как карбоксиметилцеллюлоза или подобные диспергирующие агенты, которые обычно используют в составлении фармацевтически приемлемых дозировочных форм, включая эмульсии и суспензии. Для целей составления композиций могут также использоваться другие широко используемые поверхностно-активные вещества - такие как твины, спаны и другие эмульгирующие агенты или усилители биологической доступности, которые обычно применяют в производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких или иных дозировочных форм.

Композиции данного изобретения можно вводить перорально в любой пригодной для перорального введения дозировочной форме, включая (но не ограничиваясь ими) капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения обычно используемые носители включают лактозу и кукурузный крахмал. Обычно добавляют также смазывающие вещества - как, например, стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул пригодные разбавители включают лактозу и сухой кукурузный крахмал. Если для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент комбинируют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости, могут быть также добавлены некоторые подслащивающие, ароматизирующие или окрашивающие агенты.

В качестве альтернативы композиции данного изобретения можно вводить в форме свечей для ректального применения. Их можно приготовить, смешивая агент с подходящим не вызывающим раздражения наполнителем, твердым при комнатной температуре, но жидким при температуре прямой кишки. Поэтому он будет плавиться в прямой кишке, высвобождая лекарство. Такие материалы включают масло какао, пчелиный воск и полиэтиленгликоли.

Композиции данного изобретения можно вводить местно, особенно когда мишень лечения включает участки или органы, легко доступные для местного применения. К этим случаям относятся заболевания глаз, кожи или нижнего отдела кишечного тракта. Для каждого из этих участков или органов можно легко приготовить подходящие композиции для местного применения.

Местное введение в случае нижнего отдела кишечного тракта может быть осуществлено с помощью композиции в виде ректальных свечей (см. выше) или подходящих композиций для клизмы. Можно использовать также черезкожные тампоны.

Композиции для местного введения могут быть составлены в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспендированный или растворенный в одном или более носителях. Носители для местного введения соединений данного изобретения включают (но не ограничиваются ими) минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтиленовое или полиоксипропиленовое соединение, эмульгирующий воск и воду. В качестве альтернативы, композиции могут быть составлены в подходящих лосьоне или креме, содержащих активные компоненты, суспендированные или растворенные в одном или более из фармацевтически приемлемых носителей. Подходящие носители включают (но не ограничиваются ими) минеральное масло, сорбитан-моностеарат, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.

Композиции для офтальмологического применения могут быть составлены как микронизованные суспензии в изотоническом стерильном солевом растворе с установленным рН или, предпочтительно, как растворы в изотоническом стерильном солевом растворе с установленным рН, либо с консервантом - таким как бензалконий-хлорид, или без него. В качестве альтернативы, композиции для офтальмологического применения могут быть составлены в мази - такой как вазелин.

Композиции настоящего изобретения можно также вводить интраназальным распылением аэрозоля или ингаляцией. Такие композиции готовят по хорошо известным в фармацевтической рецептурной области методикам. Они могут быть приготовлены как растворы в физиологическом солевом растворе, с бензиловым спиртом или другими подходящими консервантами, усилителями абсорбции для повышения биологической доступности, фторуглеродами и/или другими общепринятыми солюбилизирующими или диспергирующими агентами.

Было установлено, что в клинических ситуациях эффективны некоторые моноклональные антитела - такие как Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) или Xolair (Omalizumab), и для антител настоящего изобретения могут быть использованы такие же режимы введения (то есть композиции и/или дозы, и/или графики введения). Режимы введения и дозировки для антител в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут быть определены известными для этих продуктов методами - например, с использованием инструкций производителя. Например, присутствующие в фармацевтической композиции настоящего изобретения антитела можно вводить при концентрации 10 мг/мл во флаконах разового использования с фасовкой 100 мг (10 мл) или 500 мг (50 мл). Композиции для внутривенного введения составляют в растворе 9,0 мг/мл хлористого натрия, 7,35 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 0,7 мг/мл полисорбата 80 в стерильной воде для инъекций. Доводят рН до 6,5. Для примера подходящий интервал дозировок для антител в фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть приблизительно от 10 мг/м² до 500 мг/м². Однако следует признать, что эти прописи приведены для примера и оптимальные пропись и режим введения можно выработать, принимая во внимание сродство и переносимость конкретных антител в фармацевтической композиции, что можно определить в клинических испытаниях. Количества и режим инъекции антител в фармацевтической композиции настоящего изобретения, которыми насыщаются клетки NK в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч или недели, следует определить, учитывая сродство антител и их фармакокинетические параметры.

Согласно другому варианту осуществления, композиции с антителами настоящего изобретения могут дополнительно содержать другое терапевтическое средство, в том числе средства, которые обычно используют для конкретной терапевтической цели, для которой вводят и антитела. Стандартно дополнительное терапевтическое средство присутствует в композиции в количествах, обычно применяемых для этого средства при монотерапии подлежащего лечению конкретного заболевания или болезненного состояния. Такие терапевтические средства включают (но не ограничиваются ими) применяемые для лечения рака терапевтические средства, применяемые для лечения инфекционных заболеваний терапевтические средства, применяемые в других видах иммунотерапии терапевтические средства, цитокины (такие как IL-2 или IL-15), другие антитела и фрагменты других антител.

Например, для лечения рака имеется большое число терапевтических средств. Композиции с антителами и способы настоящего изобретения могут быть объединены с любыми другими способами, обычно применяемыми для лечения конкретного заболевания, в особенности опухолевого, ракового заболевания или другого заболевания или расстройства, которым страдает пациент. До тех пор, пока нет данных о том, что конкретный терапевтический подход сам по себе является вредным для здоровья пациента, и он не противодействует активности антител в фармацевтической композиции настоящего изобретения, рассматривается его комбинация с настоящим изобретением.

В связи с лечением плотных (солидных) опухолей фармацевтические композиции настоящего изобретения могут использоваться в комбинации с классическими подходами - такими как хирургия, радиотерапия, химиотерапия и подобные им. Поэтому изобретение предусматривает комбинированные способы лечения, в которых фармацевтическая композиция настоящего изобретения используется одновременно с, до или после хирургической операции или облучения; или вводится пациентам одновременно с, до или после обычных химиотерапевтических, радиотерапевтических или анти-ангиогенных средств или адресованных иммунотоксинов или коагулирующих лигандов.

Если в терапевтической схеме в комбинации с содержащей антитела композицией настоящего изобретения применяются одно или более средств, отсутствует требование того, чтобы суммарные результаты были аддитивны по отношению к воздействиям, полученным тогда, когда каждое лечение применяется в отдельности. Хотя обычно желательны хотя бы аддитивные эффекты, было бы полезно любое повышение противоракового действия по сравнению с действием монотерапии. Точно также отсутствует конкретное требование, чтобы комбинированное лечение давало синергидный эффект, хотя это возможно и полезно.

Чтобы практиковать комбинированную противораковую терапию, можно просто вводить животному композицию с антителами настоящего изобретения в комбинации с другим противораковым средством способом, эффективным в получении у животного комбинированного противоракового действия. Поэтому средства должны быть предоставлены в таких количествах и на такой период времени, чтобы обеспечить их сочетанное присутствие внутри сосудистой сети опухоли и их комбинированные воздействия на окружение опухоли. Чтобы достигнуть этой цели, композицию с антителами настоящего изобретения и противораковые средства можно вводить животному одновременно - либо в виде одной объединенной композиции, либо как две различных композиции, вводимые различными путями.

В качестве альтернативы введение композиции с антителами настоящего изобретения может предшествовать введению противоракового средства или следовать за его введением с интервалами времени от минут до недель и месяцев. Следует обеспечить, чтобы противоопухолевое средство и антитела в композиции с антителами настоящего изобретения оказывали полезным образом комбинированное действие на раковый процесс.

Большинство противораковых средств в случае противоангиогенной терапии следует вводить до композиции с ингибиторными антителами к KIR настоящего изобретения. Однако если в композиции с антителами настоящего изобретения используются иммуноконъюгаты антител, различные противораковые средства можно вводить одновременно или последовательно.

В некоторых случаях может даже потребоваться существенно продлить длительность лечения, с интервалом между последовательным введением противоракового средства или противораковым лечением и введением композиции с антителами настоящего изобретения в несколько дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7), несколько недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) или даже несколько месяцев (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8). Это может быть полезно при таких обстоятельствах, когда цель противораковой процедуры (такой как хирургическая операция или химиотерапия) - значительно разрушить опухоль, а цель введения композиции с антителами настоящего изобретения - предотвратить микрометастазирование или повторный рост опухоли.

Предусматривается также, что нужно будет применить более одного введения либо композиции на основе антител к ингибиторным KIR настоящего изобретения, либо противоракового средства. Эти агенты могут вводиться поочередно, в чередующиеся дни или недели; или же проводится цикл лечения композицией с антителами к ингибиторным KIR настоящего изобретения, за которым следует цикл терапии противораковым средством. В любом случае, все, что требуется для достижения регрессии опухоли при комбинированной терапии, - это вводить оба агента в общем количестве, которое эффективно проявляет противоопухолевое действие, независимо от моментов введения.

В условиях хирургии любое хирургическое вмешательство может быть осуществлено в комбинации с настоящим изобретением. В соединении с радиотерапией, может быть рассмотрен любой механизм локального индуцирования разрывов ДНК внутри раковых клеток - такой как гамма-облучение, рентгеновские лучи, УФ-облучение, микроволновое излучение и даже электронные эмиссии и подобное этому. Рассматривается также направленная доставка радиоактивных изотопов в раковые клетки, и это может быть применено в соединении с нацеленными антителами или другими нацеленными средствами.

В других аспектах в комбинации с композициями с антителами или как часть композиции с антителами настоящего изобретения могут быть введены иммуномодулирующие соединения или режимы. Предпочтительные примеры иммуномодулирующих соединений включают цитокины. В таких комбинированных подходах могут участвовать различные цитокины. Примеры цитокинов, полезных в комбинациях, рассматриваемых настоящим изобретением, включают IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-α, TNF-β, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ. Используемые в комбинационном лечении или композициях настоящего изобретения цитокины вводят согласно стандартным режимам, согласующимся с клиническими показателями - такими как состояние пациента, и с относительной токсичностью цитокина.

В некоторых вариантах осуществления терапевтические композиции настоящего изобретения, содержащие перекрестно реагирующие антитела к ингибиторным KIR, могут вводиться в комбинации со средством химиотерапевтической или гормональной терапии, или же могут дополнительно содержать такое средство. В раскрываемых здесь способах комбинированного лечения могут применяться различные средства гормональной терапии и химиотерапии. Химиотерапевтические средства, рассматриваемые для примера, включают (но не ограничиваются ими) алкилирующие агенты, антиметаболиты, цитотоксические антибиотики, алкалоиды из барвинка - например адриамицин, дактиномицин, митомицин, карминомицин, дауномицин, доксорубицин, тамоксифен, таксол, таксотер, винкристин, винбластин, винорелбин, этопозид (VP-16), 5-фторурацил (5FU), цитозин-арабинозид, циклофосфамид, тиотера, метотрексат, камптотецин, актиномицин-D, митомицин С, цисплатин (цис-ДДП), аминоптерин, комбретастатин(ы) и их производные и предшественники лекарств.

Гормональные агенты включают (но не ограничиваются ими), например, агонисты гонадотропин-высвобождающего гормона (LHRH) - такие как лейпрорелин, гозерелин и бузерелин; анти-эстрогены - такие как тамоксифен и торемифен; анти-андрогены - такие как флутамид, нилутамид, кипротерон и бикалутамид; ингибиторы ароматазы - такие как анастрозол, экземестан, летрозол и фадрозол; и прогестагены - такие как медрокси, хлормадинон и мегестрол.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, подходящие дозы химиотерапевтических средств должны быть близки тем, которые уже применялись в клинических курсах терапии, когда химиотерапевтические средства вводились одни или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами. Только лишь для примера могут применяться такие агенты, как цисплатин и другие алкилирующие ДНК агенты. Цисплатин широко использовался для лечения рака, причем в клиническом применении использовались эффективные дозы 20 мг/м² в течение 5 дней каждые 3 недели, всего в 3 курсах. Цисплатин не усваивается при пероральном применении и поэтому должен вводиться путем инъекции внутривенно, подкожно, внутрь опухоли или внутрибрюшинно.

Другие полезные химиотерапевтические средства включают соединения, нарушающие репликацию ДНК, митоз и сегрегацию хромосом, и агенты, нарушающие синтез и правильность предшественников полинуклеотидов. Большое число приводимых для примера химиотерапевтических средств для комбинированной терапии приведено в таблице С Патента США №6524583, раскрытые в котором агенты и указания включены в настоящее описание ссылкой. Перечисление агентов в списке сделано для примера и не является ограничивающим. Опытный специалист должен обратиться к "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15-е издание, глава 33, особенно стр. 624-652. В зависимости от подлежащего лечению болезненного состояния могут производиться изменения в дозировках. Производящий лечение врач должен быть в состоянии определить для конкретного индивидуума подходящую дозировку.

Композиции настоящего изобретения с перекрестно реагирующими антителами к ингибиторным KIR могут применяться в комбинации с любым одним или более из других анти-ангиогенных лечебных препаратов или могут содержать дополнительно анти-ангиогенные агенты. Примеры таких агентов включают нейтрализующие антитела, антисмысловую РНК, малую интерферирующую РНК (siRNA), интерферирующую РНК (RNAi), аптамеры РНК и рибозимы, каждое из которых направлено против фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) или рецепторов фактора роста сосудистого эндотелия (Патент США №6 524 583, содержание которого включено в настоящее описание ссылкой). Могут также применяться варианты фактора роста сосудистого эндотелия с антагонистическими свойствами, как описано в патентном документе WO 98/16551, включенной в настоящее описание ссылкой. Дополнительные примеры анти-ангиогенных агентов, которые могут быть полезными в связи с комбинированной терапией, перечислены в таблице D Патента США №6524583, раскрытые в котором агенты и указания включены в настоящее описание ссылкой.

Композиции настоящего изобретения с антителами к ингибиторным KIR могут также с успехом использоваться в комбинации со способами индуцирования апоптоза или могут дополнительно содержать вызывающие апоптоз агенты. Например, было идентифицировано большое число онкогенов, которые ингибируют апоптоз, или запрограммированную гибель клеток. Приводимые для примера онкогены этой категории включают (но не ограничиваются ими) bcr-abl, bcl-2 (отличный от bcl-1), циклин D1 (номера доступа в GenBank: M14745, Х06487; Патенты США №5650491 и 5539094; каждый из которых включен в настоящее описание ссылкой) и представители семейства, включающего Всl-х1, Mcl-1, Bak, A1 и А20. Сверх-экспрессия bcl-2 была первоначально открыта в лимфомах Т-клеток. Функция онкогена bcl-2 состоит в связывании с белком Вах (белок пути апоптоза) и его инактивации. Ингибирование функции bcl-2 предотвращает инактивацию Вах и позволяет осуществиться пути апоптоза. Ингибирование этого класса онкогенов - например, с помощью антисмысловых нуклеотидных последовательностей, RNAi, siRNA или низкомолекулярных химических соединений рассматривается в плане использования в настоящем изобретении для усиления апоптоза (Патенты США №5650491, 5539094 и 5583034, каждый из которых включен в настоящее описание ссылкой).

Композиции настоящего изобретения с антителами к ингибиторным KIR могут также включать молекулы или применяться в комбинации с молекулами, которые содержат адресующую часть - например антитело, лиганд или их конъюгат, нацеленные на специфический маркер клетки-мишени («нацеливающий агент») - например клетки-мишени опухоли. Вообще говоря, нацеливающие агенты, предназначенные к использованию в этих дополнительных аспектах изобретения, должны предпочтительно распознавать доступные антигены опухоли, которые предпочтительно или специфически экспрессируются в месте развития опухоли. Нацеливающие агенты, как правило, связываются с экспрессируемым на поверхности, доступным на поверхности или локализованным на поверхности компонентом опухолевой клетки. Нацеливающие агенты будут также предпочтительно проявлять свойства высокого сродства и не будут вызывать значительных побочных эффектов in vivo no отношению к поддерживающим жизнь нормальным тканям - таким как одна или более тканей, выбранных из тканей сердца, почки, мозга, печени, костного мозга, толстой кишки, молочной железы, простаты, щитовидной железы, желчного пузыря, легкого, надпочечника, мышц, нервных волокон, поджелудочной железы, кожи или других поддерживающих жизнь органов или тканей человеческого тела. Термин «не вызывают значительных побочных эффектов», как он использован здесь, относится к тому факту, что нацеливающий агент, когда он введен in vivo, вызовет лишь ничтожные или клинически контролируемые побочные эффекты - такие как те, с которыми обычно встречаются при химиотерапии.

При лечении опухолей композиция с антителами настоящего изобретения может дополнительно содержать вспомогательные соединения или может применяться в комбинации со вспомогательными соединениями. Вспомогательные соединения могут включать в качестве примера противорвотные средства - такие как антагонисты серотонина, и лекарственные средства - такие как фенотиазины, замещенные бензамиды, антигистамины, бутирофеноны, кортикостероиды, бензодиазепины и каннабиноиды; бисфосфонаты - такие как золедроновая кислота и памидроновая кислота; и кроветворные ростовые факторы - такие как эритропоэтин и G-CSF (например, филграстим, ленограстим и дарбепоэтин).

В другом варианте осуществления два или более типов антител настоящего изобретения, имеющие различные перекрестные реакционные способности, в том числе NKVSF1, можно комбинировать в одной композиции так, чтобы нейтрализовать ингибиторные действия как можно большего числа продуктов генов ингибиторных KIR. Композиции, содержащие комбинации перекрестно реактивных антител к ингибиторным KIR настоящего изобретения или их фрагментов или производных, предусматривают даже более широкое применение, так как, скорее всего, существует очень малая часть человеческой популяции, у которой отсутствует каждый из продуктов генов ингибиторных KIR, распознаваемых одиночным типом перекрестно реагирующих антител. Подобным же образом, композиции с антителами настоящего изобретения могут дополнительно содержать один или более из типов антител, которые распознают одиночные подтипы ингибиторных KIR. Такие комбинации также будет обладать более широкой применимостью в терапевтических предписаниях.

Изобретение предусматривает также способ усиления активности клеток NK у нуждающегося в этом пациента, содержащий этап введения композиции согласно настоящему изобретению указанному пациенту. Более конкретно, способ направлен на повышение активности клеток NK у пациентов, имеющих заболевание, при котором полезно повышение активности клеток NK, в котором участвуют, на которое влияют или которое вызывается клетками, восприимчивыми к лизису клетками NK cells, или которое вызывается или характеризуется недостаточной активностью клеток NK. Это такие заболевания, как рак, иное пролиферативное заболевание, инфекционное заболевание или иммунное расстройство. Более конкретно, способы настоящего изобретения применяются для лечения различных типов рака и других пролиферативных заболеваний, включая (но не ограничиваясь ими) карциному (в том числе карциному мочевого пузыря, молочных желез, толстой кишки, почки, печени, легких, яичников, простаты, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи, включая карциному сквамозных клеток); опухоли кроветворных органов лимфоидного происхождения (в том числе лейкоз, острый лимфоцитный лейкоз, острый лимфолейкоз, лимфому В-клеток, лимфому Т-клеток, лимфому Ходжкина, лимфому не Ходжкина, лимфому ворсинчатых клеток и лимфому Беркитта); опухоли кроветворных органов миелоидного происхождения (включая острый и хронический миелогенный лейкоз и промиелоцитный лейкоз); опухоли мезенхимного происхождения, в том числе фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и невриномы; и другие опухоли, включая меланому, пигментозную ксеродермию, кератоакантому, семиному, тироидный фолликулярный рак и тератокарциному.

Предпочтительные заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают опухоли кроветворных органов лимфоидного происхождения - например опухоли Т-клеток и В-клеток, включающие (но не ограниченные ими) нарушения Т-клеток - такие как Т-пролимфоцитарный лейкоз (T-PLL), в том числе таковой в малых клетках и церебриформном типе клеток; лейкоз больших гранулярных лимфоцитов (LGL), преимущественно в Т-клетках; синдром Sezary (SS); лимфолейкоз взрослых Т-клеток (ATLL); печеночно-селезеночную лимфому T-NHL; периферическую/послетимусную лимфому Т-клеток (плеоморфный и иммунобластоидный подтипы); ангио-иммунобластоидную лимфому Т-клеток; ангиоцентрическую (носовую) лимфому Т-клеток; анапластическую (Ki 1+) лимфому крупных клеток; кишечную лимфому Т-клеток; лимфобластоз и лимфолейкоз Т-клеток (T-Lbly/T-ALL).

Согласно настоящему изобретению можно лечить также и другие пролиферативные расстройства, в том числе, например, гиперплазии, фиброз (в особенности легочный, но также и другие типы фиброза - такие как почечный фиброз), ангиогенез, псориаз, атеросклероз и разрастание гладких мышц в кровеносных сосудах - такое как стеноз или рестеноз после пластической операции на сосудах. Перекрестно реагирующие антитела к ингибиторным KIR настоящего изобретения могут применяться для лечения или предотвращения инфекционных заболеваний, включая преимущественно любую инфекцию, вызванную вирусами, бактериями, простейшими, плесневыми грибами или грибком. Такие вирусные инфекции включают (но не ограничиваются ими) гепатит А, гепатит В, гепатит С, грипп, ветряную оспу, аденовирус, простой герпес 1-го типа (HSV-1), простой герпес 2-го типа (HSV-2), чуму крупного рогатого скота, риновирус, эховирус, ротавирус, респираторный синцитиальный вирус, вирус папилломы, цитомегаловирус, эхиновирус, арбовирус, хантавирус, вирус паротита, вирус кори, вирус краснухи вирус полиомиелита и вирус иммунодефицита человека 1-го или 2-го типа (HIV-1, HIV-2).

Бактериальные инфекции, на которые можно воздействовать в соответствии с настоящим изобретением, включают (но не ограничиваются ими) инфекции, вызванные следующими микроорганизмами: Staphylococcus; Streptococcus, в том числе S. pyogenes; Enterococci; Bacillus, в том числе Bacillus anthracis и Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella, в том числе G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas, в том числе Р. aeruginosa; Legionella; Neisseria, в том числе N. gonorrhoeae и N. meningitides; Flavobacterium, в том числе F. meningosepticum и F. odoraturn; Brucella; Bordetella, в том числе В. pertussis и B. bronchiseptica; Escherichia, в том числе E. соli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia, в том числе S. marcescens и S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus, в том числе Р. mirabilis и Р. vulgaris; Streptobacillus; Rickettsiaceae, в том числе R fickettsfi; Chlamydia, в том числе С. psittaci и С. trachomatis; Mycobacterium, в том числе М. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluiturn, М. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. Intracellulare и M. lepraernurium; и Nocardia.

Протозойные инфекции, на которые можно воздействовать в соответствии с настоящим изобретением, включают (но не ограничиваются ими) инфекции, вызванные лейшманией, кокзидиоей и трипанозомой. Полный список инфекционных заболеваний, который включен в настоящее описание ссылкой, можно найти на вебсайте Национального центра National Center for Infectious Disease (NCID) в Центре контроля заболеваний Center for Disease Control (CDC) (http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/). Все из указанных заболеваний являются кандидатами для лечения с применением перекрестно реагирующих антител к ингибиторным KIR согласно настоящему изобретению.

В таких способах лечения различных инфекционных заболеваний может применяться композиция с антителами настоящего изобретения, либо одна, либо в комбинации с другими способами лечения и/или терапевтическими средствами, известными для лечения таких заболеваний, включая противовирусные средства, противогрибковые средства, противобактериальные средства, антибиотики, противопаразитные средства и противопротозойные средства. Если эти способы включают дополнительные способы лечения с добавочными терапевтическими средствами, эти средства могут вводиться вместе с антителами настоящего изобретения либо в форме одноразовой дозировки, либо в форме отдельных, многоразовых дозировок. Дополнительное средство, если оно вводится в форме отдельной дозировки, может вводиться до, одновременно или после введения антител настоящего изобретения.

Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут раскрыты в нижеследующем экспериментальном разделе, который должен рассматриваться как иллюстративный, но не ограничивающий объем настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Очистка лимфоцитов периферической крови (PBL) и создание поликлональных или клональных линий клеток NK

Лимфоциты PBL получали от здоровых доноров с помощью градиентов Ficoll Hypaque и удаления прилегающих пластичных клеток. Чтобы получить обогащенные клетки NK, PBL инкубировали (30 мин при 4°С) с моноклональными антителами mAb к CD3 (анти-СD3), к CD4 (анти-СD4) и к HLA-DR (анти-HLA-DR), затем с магнитными гранулами (Dynal) с козьими антителами к мышиному иммуноглобулину (30 мин при 4°С), с последующей иммуномагнитной селекцией с помощью известных в данной области методов (Pende и др. 1999). Клетки CD3^-, CD4^-, DR^- культивировали на облученных питательных клетках с 100 Ед/мл интерлейкина-2 (Proleukin, Chiron Corporation) и 1,5 нг/мл фитогемагглютинина A (Gibco BRL) для получения популяций поликлональных клеток NK. Клетки NK клонировали путем предельного разведения и определяли экспрессию рецепторов клеточной поверхности в клонах клеток NK с помощью проточной цитометрии.

Используемыми моноклональными антителами были JT3A (IgG2a, aHTH-CD3), ЕВ6 и GL183 (IgG1 к KIR2DL1 и KIR2DL3 соответственно), ХА-141 (IgM к KIR2DL1 с той же специфичностью, как и ЕВ6), aнти-CD4 (HP2.6) и анти-DR (D1.12, IgG2a). Вместо HP2.6 и R1.12, которые были получены заявителями, можно применять коммерчески доступные моноклональные антитела с теми же самыми специфичностями (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). ЕВ6 и GL183 являются коммерческими продуктами (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). ХА-141 не является коммерческим продуктом, но для контроля восстановления лизиса можно использовать ЕВ6, как описано у Moretta и др. (1993).

Клетки окрашивали подходящими антителами (30 мин при 4°С), затем добавляли конъюгированные с РЕ или FITC поликлональные антитела к мышиному иммуноглобулину (Southern Biotechnology Associates Inc). Образцы анализировали методом цитофлуорометрии на установке FACSAN apparatus (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

В данном исследовании были использованы следующее клоны. CP11, CN5 и CN505 - это позитивные по KIR2DL1 клоны, их окрашивали антителами ЕВ6 (IgG1 к KIR2DL1) или ХА-141 (IgM к KIR2DL1 с той же специфичностью, что и у антител ЕВ6). CN12 и СР502 - это позитивные по KIR2DL3 клоны, их окрашивали антителами GL183 (IgG1 к KIR2DL3).

Цитолитическую активность клонов NK оценивали стандартным методом по высвобождению ⁵¹Сr через 4 ч, в котором активность эффекторных клеток NK измеряли на позитивных по Cw3 или Cw4 линиях клеток, про которые известно, что они чувствительны к лизису клетками NK. Все клетки-мишени брали в количестве 5000 клеток на ячейку в микротитровальном планшете, отношение эффектор: мишень указано на фигурах (обычно 4 эффекторных клетки на одну клетку-мишень). Анализ цитотоксичности проводили в присутствии или без надосадочной жидкости с указанными моноклональными антителами с разбавлением ¹/₂. Процедура была в основном такой же, как описана Moretta и др. (1993).

Пример 2

Получение новых моноклональных антител

Моноклональные антитела (mAbs) получали иммунизацией 5-недельных мышей линии Balb С линиями активированных поликлональных или моноклональных клеток NK, как описано у Moretta и др. (1990). После слияния различных клеток, mAbs вначале отбирали по их способности к перекрестной реакции с позитивными по ЕВ6 и GL183 линями клеток и клонами NK. Затем проводили скрининг позитивных моноклональных антител по их способности восстанавливать лизис позитивных по Cw4 или Cw3 клеток-мишеней позитивными по ЕВ6 или GL183 клонами NK.

Окрашивание клеток производили следующим образом. Клетки окрашивали набором антител (1 мкг/мл или 50 мкл надосадочной жидкости, 30 мин при 4°С), после чего вносили конъюгированные с РЕ фрагменты F(ab')2 козьих антител к мышиному IgG (H+L) или конъюгированный с РЕ фрагмент F(ab')2 антител к человеческому IgG (Fc-гамма) (Beckman Coulter). Цитофлуорометрический анализ проводили на установке Epics XL.MCL (Beckman Coulter).

Было установлено, что одно из моноклональных антител, DF-200 тАb, реагирует с различными представителями семейства KIR, в том числе с KIR2DL1, KIR2DL2/3. Клетки NK и KIR2DL1+, и KIR2DL2/3+ ярко окрашивались DF-200 mАb (фиг.1).

Клоны NK, экспрессирующие один или другой (или даже оба) из этих специфических к I классу HLA ингибиторных рецепторов, были использованы как эффекторные клетки против клеток-мишеней, экпрессирующих одну или более из аллелей HLA-C. Анализ цитотоксичности проводили следующим образом. Цитолитическую активность линий клеток YTS-KIR2DL1 или YTS-Eco оценивали стандартным методом по высвобождению ⁵¹Сr через 4 ч. Эффекторные клетки испытывали на позитивных по HLA-Cw4 или негативных по EBV линиях клеток и на трансфицированных HLA-Cw4 клетках 721.221. Все клетки-мишени использовали в планшетах для микротитрования при 3000 клеток на ячейку. Отношение эффектор/мишень указано на чертежах. Анализ цитолитического действия проводили, как указано, с мышиными или человеческими моноклинальными антителами полной длины или их фрагментами F(ab')2, или же без них. Как и ожидалось, клоны NK KIR2DL1⁺ проявляли малую, если вообще проявляли, цитолитическую активность в отношении клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-Cw4, а клоны NK KIR2DL3⁺ проявляли малую, если вообще проявляли, цитолитическую активность в отношении клеток-мишеней, позитивных по Cw3. Однако в присутствии моноклональных антител DF-200mAb (использованных, чтобы замаскировать их рецепторы KIR2DL) клоны NK приобретали способность распознавать свои лиганды HLA-C и проявляли сильную цитолитическую активность в отношении клеток-мишеней с Cw3 или Cw4.

Например, линия клеток C1R (линия клеток CW4⁺, АТСС n°CRL 1993) не уничтожалась клонами NK KIR2DL1⁺ (CN5/CN505), но ингибирование могло быть эффективно изменено при использовании либо антител DF-200, или обычных моноклональных антител KIR2DL1. С другой стороны, клоны NK, экспрессирующие фенотип KIR2DL2/3⁺ KIR2DL1^- (CN12), эффективно уничтожали клетки C1R, и на это уничтожение не влияют DF-200mAb (фиг.2). Подобные результаты получены с клонами NK: KIR2DL2- или позитивными по KIR2DL3 на мишенях, позитивных по Cw3.

Подобным же образом клетки линии Cw4+ 221 EBV не уничтожались трансфицированными по KIR2DL1⁺ клетками NK, но ингибирование можно было эффективно изменить при использовании либо DF-200, либо фрагмента DF-200 Fab или же обычных моноклональных антител к KIR2DL1 - ЕВ6 или ХА141. Клетки линии Cw3+ 221 EBV также не уничтожались клетками NK KIR2DL2⁺, но это ингибирование можно было изменить использованием либо антител DF-200, либо их фрагментов DF-200 Fab. Наконец, клетки последней линии Cw3+ 221 EBV не уничтожались клетками NK KIR2DL3*, но это ингибирование можно было изменить использованием либо фрагмента DF-200 Fab, либо обычных моноклональных антител к KIR2DL3 - GL183 или Y249. Результаты приведены на фиг.3.

Фрагменты F(ab')2 испытывали также на их способность восстанавливать лизис позитивных по Cw4 клеток-мишеней. Фрагменты F(ab')2 антител DF-200 и ЕВ6 Abs оба были способны изменять ингибирование лизиса трансфицированной Cw4 линии клеток 221 и линии клеток Cw4+ TUBO EBV трансфицированными по KIR2DL1 клетками NK. Результаты представлены на фиг.4.

Пример 3

Получение новых человеческих моноклональных антител

Человеческие моноклональные антитела к KIR получали иммунизацией трансгенных мышей, сконструированных так, чтобы экспрессировать набор человеческих антител с рекомбинантным белком KIR. После слияния различных клеток сначала отбирали моноклональные антитела по их способности перекрестно реагировать с иммобилизованным белком KIR2DL1 и KIR2DL2. Было обнаружено, что некоторые моноклональные антитела, в том числе 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 и 1-6F1, реагируют с KIR2DL1 и KIR2DL2/3.

Затем был проведен дальнейший скрининг позитивных моноклональных антител по их способности восстанавливать лизис позитивных по Cw4 клеток-мишеней положительными по ЕВ6 трансфектантами NK, экспрессирующими KIR2DL1. Клетки NK, экспрессирующие ингибиторные рецепторы, специфические к I классу HLA, были использованы как эффекторные клетки против клеток-мишеней, экспрессирующих одну или более из аллелей HLA-C (фигуры 5 и 6). Анализ цитотоксичности проводили, как описано выше. Отношение эффектор/мишень указано на рисунках, антитела использовали при концентрации 10 мкг/мл или 30 мкг/мл.

Как и ожидалось, клетки NK KIR2DL1⁺ проявляли низкую, если вообще проявляли, цитолитическую активность по отношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим HLA-Cw4. Однако в присутствии моноклональных антител 1-7F9 mАb клетки NK теряли способность распознавать их лиганды HLA-C и проявляли сильную цитолитическую активность по отношению к мишеням Cw4. Например, две испытанные линии клеток (линии клеток HLA-Cw4, трансфицированная 721.221, и CW4⁺ EBV) не уничтожались клетками NK KIR2DL1⁺, однако ингибирование можно было эффективно изменить, используя либо моноклональные антитела mAb 1-7F9 или обычные антитела aнти-KIR2DL1 mAb EB6. Антитела DF-200 и panKIR (обозначаемые также NKVSF1) были сравнимы с 1-7F9. С другой стороны, антитела 1-4F1, 1-6F5 и 1-6F1 не были способны восстанавливать лизис клетками NK клеток-мишеней, позитивных по Cw4.

Пример 4

Анализ методом плазмонного поверхностного резонанса на установке BIAcore взаимодействий DF-200 mAb/KIR2DL1 и DF-200 mAb/KIR2DL3

Продуцирование и очистка рекомбинантных белков

Рекомбинантные белки KIR2DL1 и KIR2DL3 нарабатывали в E. соli. кДНК, кодирующие весь внеклеточный домен KIR2DL1 и KIR2DL3 амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) из векторов соответственно pCDM8 клон 47.11 (Biassoni и др., 1993) и RSVS(gpt)183 клон 6 (Wagtman и др., 1995) с использованием следующих праймеров:

смысловой: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3'

антисмысловой: 5'-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3'

Их клонировали в экспрессирующий вектор pML1 в одной рамке с последовательностью, кодирующей сигнал биотинилирования (Sauln и др., 2003).

Экспрессию белка осуществляли в бактериальном штамме BL21(DE3) (Invitrogen). Трансфицированные бактерии выращивали до оптической плотности OD₆₀₀=0,6 при 37°С в среде, дополненной ампициллином (100 мкг/мл), экспрессию индуцировали 1 мМ изопропил-тиогалактозидом (ИПТГ).

Белки выделяли из телец включения в денатурирующих условиях (8 М мочевина). Возвратное сворачивание рекомбинантных белков осуществляли при комнатной температуре в буфере с 20 мМ трис, рН 7,8 и 150 мМ NaCl, содержащем L-аргинин (400 мМ, Sigma) и β-меркаптоэтанол (1 мМ), понижением концентрации мочевины 6-ступенчатым диализом (4, 3, 2, 1, 0,5 и 0 М мочевина соответственно). В ходе этапов диализа против 0,5 М и 0 М мочевины добавляли восстановленный и окисленный глутатион (соответственно 5 мМ и 0,5 мМ, Sigma). Наконец, белки тщательно диализовали против буфера, содержащего 10 мМ трис, рН 7,5 и 150 мМ NaCl, Растворимые, заново свернутые белки концентрировали и затем очищали гель-проникающей хроматографией на колонке с Superdex 200 (Pharmacia; АКТА system).

Измерения поверхностного плазмонного резонанса проводили на установке Biacore apparatus (Biacore). Во всех экспериментах на Biacore рабочим буфером служил буфер HBS с добавкой 0,05% поверхностно-активного вещества Р20.

Иммобилизация белков

Продуцированные, как было описано выше, белки KIR2DL1 и KIR2DL3 иммобилизовали ковалентным связыванием с карбоксильными группами в слое декстрана на сенсорных чипах Sensor Chip CM5 (Biacore). Поверхность сенсорного чипа активировали EDC/NHS (N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбидиимид-гидрохлорид) и N-оксисукцинимид, Biacore). Белки вводили в буфере для связывания (10 мМ ацетат, рН 4,5). Оставшиеся активированные группы инактивировали с помощью 100 мМ этаноламина рН 8 (Biacore).

Измерения сродства (аффинности)

Для кинетических измерений на иммобилизованный образец наносили различные концентрации растворимых антител (от 1×10^-7 до 4×10^-10 М). Измерения проводили при постоянной скорости протока 20 мкл/мин. Для каждого цикла поверхность сенсорного чипа регенерировали инъекцией 5 мкл 10 мМ NaOH рН 11. Для анализа данных применяли программу BIAlogue Kinetics Evaluation program (BIAevaluation 3.1, Biacore). На слои декстрана, содержащие 500 или 540 единиц отражения (reflectance units, RU) и 1000 или 700 RU соответственно KIR2DL1 и KIR2DL3, вводили растворимый аналит (40 мкл с различной концентрацией) при скорости протока 20 мкл/мин. в буфере HBS. Данные представляют 6 независимых опытов. Результаты представлены ниже в таблице 1.

Таблица 1 Анализ методом BIAcore связывания DF-200 mАb с иммобилизованными KIR2DL1 и KIR2DL3 Белок К_D(10^-9 M) KIR2DL1 10,9±3,8 KIR2DL3 2,0±1,9 К_D: константа диссоциации.

Пример 5

Анализ методом BIAcore (плазмонный поверхностный резонанс) конкурентного связывания мышиных и человеческих антител к KIR

Анализ картирования эпитопов осуществляли на иммобилизованных KIR2DL1 (900 RU), KIR2DL3 (2000 RU) и KIR2DS1 (1000 RU) с мышиными антителами к KIR2D: DF-200, Pan2D, gl183 и ЕВ6, и человеческими антителами к KIR 2D: 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 и 1-7F9, как описано ранее (Gauthier и др., 1999, Saunal and van Regenmortel, 1995).

Все опыты были проведены при скорости протока 5 мкл/мин в буфере HBS с инъекцией в течение 2 мин различных антител при концентрации 15 мкг/мл. Для каждой пары антител анализ конкурентного связывания проводили в 2 стадии. В первой стадии на белок-мишень KIR2D вводили первые моноклональные антитела (mAb), затем вторые моноклональные антитела (не удаляя первых) и определяли величину RU для вторых антител (RU2). Во второй стадии первыми вводили вторые моноклональные антитела, прямо на оголенный белок, и определяли значение RU для моноклональных антител (RU1). Процент ингибирования связывания вторых mAb с белком KIR2D первыми mAb рассчитывали как 100x(1-RU2/RU1).

Результаты представлены в таблицах 2, 3 и 4, где антитела, обозначенные как «первые антитела», перечислены в вертикальной колонке, а «вторые антитела» приведены в горизонтальной строке. Для каждой испытанной комбинации антител в таблице приведены значения для уровня прямого связывания (RU) антител с чипом, где прямое связывание вторых антител с чипом KIR2D показано в верхней части ячейки, а значение для связывания вторых антител с чипом KIR2D, где уже присутствуют первые антитела, приведены в нижней части ячейки. В правой части каждой ячейки приведен процент ингибирования связывания вторых антител. Таблица 2 показывает связывание на чипе KIR2DL1, таблица 3 показывает связывание антител на чипе KIR2DL3, а таблица 4 показывает связывание антител на чипе KIR2DS1.

Оценивали конкурентное связывание с иммобилизованными KIR2DL1, KIR2DL2/3 и KIR2DS1 мышиных антител DF-200, NKVSF1 и ЕВ6 и человеческих антител 1-4F1, 1-7F9 и 1-6F1. Картирование эпитопов (фиг.7) в опытах со связыванием антител к KIR с KIR2DL1 показало, что

(a) антитела 1-7F9 конкурируют с ЕВ6 и 1-4F1, но не с NKVSF1 и DF-200;

(b) антитела 1-4 F1, в свою очередь, конкурируют с ЕВ6, DF-200, NKVSF1 и 1-7 F9;

(c) антитела NKVSF1 конкурируют с DF-200, 1-4F1 и ЕВ6, но не с 1-7F9; и

(d) антитела DF-200 конкурируют с NKVSF1, 1-4F1 и ЕВ6, но не с 1-7F9.

Картирование эпитопов (фиг.8) в опытах со связыванием антител к KIR с KIR2DL3 показало, что

(a) антитела 1-4F1 конкурируют с NKVSF1, DF-200, gl183 и 1-7F9;

(b) антитела 1-7F9 конкурируют с DF-200, gl183 и 1-4F1, но не с NKVSF1;

(c) антитела NKVSF1 конкурируют с DF-200, 1-4F1 и GL183, но не с 1-7F9; и

(d) антитела DF-200 конкурируют с NKVSF1, 1-4F1 и 1-7F9, но не с GL183.

Картирование эпитопов (фиг.9) в опытах со связыванием антител к KIR с KIR2DS1 показало, что

(a) антитела 1-4F1 конкурируют с NKVSF1, DF-200 и 1-7F9;

(b) антитела 1-7F9 конкурируют с 1-4F1, но не конкурируют с DF-200 и NKVSF1;

(c) антитела NKVSF1 конкурируют с DF-200 и 1-4F1, но не с 1-7F9; и

(d) антитела DF-200 конкурируют с NKVSF1 и 1-4F1, но не с 1-7F9.

Пример 6

Титрование антител (mAb) к KIR с клетками NK Cynomolgus

Антитела NKVSF1 к KIR испытывали на их способность связываться с клетками NK из обезьян Cynomolgus. Связывание антител с обезьяньими клетками NK представлено на фиг.10.

Очистка мышиных мононуклеаров периферической крови (РВМС) и получение массы поликлональных клеток NK

Мононуклеары периферической крови макак Cynomolgus получали из пробирок СРТ с цитратом натрия (Becton Dickinson). Очистку клеток NK проводили методом негативного истощения (набор Macaque NK cell enrichment kit, Stem Cell Technology). Для получения популяций поликлональных клеток NK культивировали клетки NK на облученных питающих человеческих клетках с 300 ед/мл интерлейкина 2 (Proleukin, Chiron Corporation) и 1 нг/мл фитогемагглютинина А (Invitrogen, Gibco).

Титрование Pan2D mAb с клетками NK Cynomolgus

Клетки NK Cynomolgus (масса клеток NK на 16-й день) инкубировали с различными количествами антител Pan2D mAb и затем с конъюгированными с РЕ фрагментами F(ab')2 козьих антител к мышиному IgG (H+L). Процентное содержание позитивных клеток определяли с изотипическим контролем (очищенный мышиный lgG1). Пробы отбирали и обрабатывали по 2 в параллель. MFI - средняя интенсивность флуоресценции (mean fluorescence intensity).

Пример 7

Картирование эпитопов связывания DF-200 и Pan2D с KIR2DL1

Компьютерное моделирование внеклеточных доменов KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 (KIR2DL1-3) на основе их опубликованных кристаллических структур (Maenaka и др. (1999), Fan и др. (2001), Boyington и др. (2000)) предсказало участие аминокислот R131¹ (¹Однобуквенное обозначение аминокислот) во взаимодействии между перекрестно реагирующими по отношению к KIR2DL1 и KIR2DL1-3 мышиными моноклональными антителами (mАb) DF-200 и pan2D. Чтобы это проверить, были приготовлены слитые белки, состоящие из полного внеклеточного домена KIR2DL1 (аминокислоты Н1-Н224), либо дикого типа, либо имеющего точечную мутацию (например, R131W²) (²Замена R на W в положении 131 (от N-конца) аминокислотной последовательности KIR2DL1)), слитого с человеческим Fc (hFc). Материалы и методы, примененные для продуцирования и оценки различных слитых белков KIR2DL1-hFc, были описаны ранее (Winter and Long (2000)). Вкратце, кодирующие KIR2DL1 (R131W)-hFc кДНК-векторы были получены методом ПЦР-мутагенеза (Quickchange II, Promega) вектора CL42-lg - опубликованного кДНК-вектора для получения KIR2DL1-hFc дикого типа (Wagtmann и др. (1995)). KIR2DL1-hFc и KIR2DL1 (R131W)-hFc получали в клетках COS7 и выделяли из культуральной среды, в основном как описано ранее (Wagtmann и др., 1995). Чтобы проверить правильность сворачивания, KIR2DL1-hFc и KIR2DL1(R131W)-hFc инкубировали с клетками LCL721.221, которые экспрессируют либо HLA-Cw3 (не являющийся лигандом для KIR2DL1), либо HLA-Cw4 (лиганд KIR2DL1), и анализировали взаимодействие между слитыми белками KIR-Fc и клетками методом FACS - стандартным методом исследования белковых взаимодействий на клеточной поверхности. Пример независимых опытов приведен на фиг.11, блок А. Как предполагалось на основании литературных данных, ни один из слитых белков KIR2DL1-hFc не связывался с клетками LCL721.221, экспрессирующими HLA-Cw3. Напротив, и KIR2DL1-hFc, и KIR2DL1 (R131W)-hFc связывались с клетками LCL721.221, экспрессирующими HLA-Cw4, что подтверждало их правильное сворачивание.

Связывание KIR2DL1 (R131W)-hFc и KIR2DL1-hFc со специфичными к KIR антителами mАb (DF-200, pan2D, ЕВ6 и GL183) изучали методом ELISA -стандартным методом изучения белковых взаимодействий. Вкратце, KIR2DL1 (R131W)-hFc и KIR2DL1-hFc пришивали к ячейкам планшета на 96 ячеек с помощью козьих антител к человеческому иммуноглобулину, после чего добавляли в разных концентрациях специфичные к KIR моноклональные антитела (0-1 мкг/мл в PBS). Взаимодействия между вариантами KIR2DL1-hFc и антителами mAb визуализировали с помощью спектрофотометрии (450 нм), применяя связанные с пероксидазой вторичные антитела, специфичные к мышиным антителам, для преобразования субстрата ТМВ. Примеры независимых опытов приведены на фиг.11, блок В. В то время как специфичные к KIR2DL2-3 антитела mAb GL183 не были способны связываться ни с одним из слитых белков KIR2DL1-hFc, специфичные к KIR2DL1 антитела mAb EB6, DF-200 и Pan2D связывались с вариантами KIR2DL1-hFc с дозовой зависимостью. Точечная мутация (R131W) влияла на связывание DF-200 и pan2D, снижая связывание до ~10% от связывания дикого типа при наивысших концентрациях антител mAb (1 мкг/мл). Это подтвердило, что R131 - это часть сайта связывания антител DF-200 и Pan2D во внеклеточном домене 2 KIR2DL1.

Все цитированные публикации, заявки на патенты и патенты, включены в настоящую работу посредством ссылки до той степени, как если бы было указано, что каждая ссылка индивидуально включена ссылкой и была приведена здесь во всей полноте.

Все заголовки и подзаголовки использованы в настоящем описании для удобства и не должны рассматриваться, как ограничивающие каким бы то ни было образом настоящее изобретение.

Любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных их вариантах охватывается настоящим изобретением, если не указано иное, или если это каким-либо иным образом не противоречит явно смыслу.

Очерчивание интервалов величин служит единственно тому, чтобы быть лаконичным средством для соотнесения индивидуально с каждой отдельной величиной, попадающей в данный интервал, если иное не указано, и каждая отдельная величина включена в описание так, как будто она указана в отдельности. Если не установлено иное, все представленные здесь точные значения представляют соответствующие приближенные значения (например, все точные приведенные для примера величины, представленные в связи с конкретным фактором или измерением, могут считаться представляющими также соответствующее приблизительное значение, и сопровождаются, где нужно, дополнением «приблизительно»).

Все описанные в настоящем описании способы могут осуществляться в любом подходящем порядке, если иное не указано и если это не вступает в явное противоречие с контекстом.

Предусмотренное применение любого из всех и всех примеров или характерные языковые обороты (например, «такой как») предназначены только для лучшего освещения изобретения и не претендует на ограничение объема изобретения, если иное не указано. Никакие выражения в описании не следует истолковывать как указывающие на то, что любой элемент является необходимым для практики применения изобретения, пока это точно не указано.

Цитирование и включение в настоящее описание патентных документов сделаны только для удобства и совершенно не отражают мнения о правильности, патентоспособности и/или навязывания таких патентных документов.

Приводимое описание любого аспекта или варианта осуществления изобретения, использующее такие термины, как «представляющий собой», «имеющий», «включающий» или «содержащий», по отношению к элементу или элементам, предназначен поддержать подобные аспект или вариант изобретения, которые «состоят из», «состоят по существу из» или «по существу содержат» эти конкретный элемент или конкретные элементы, если иное не установлено или если это не входит в явное противоречие с контекстом (например, композицию, описанную здесь как содержащую конкретный элемент, следует понимать как описывающую также композицию, состоящую из этого элемента, если не установлено иное или если это не противоречит явно контексту).

Настоящее изобретение в максимальной степени, допускаемой соответствующим законодательством, включает все модификации и эквиваленты предмета рассмотрения, изложенные в представленных здесь аспектах или пунктах формулы.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложен способ получения антитела для связывания с NK-клетками, которое перекрестно реагирует с продуктами гена KIR2DL1 и KIR2DL2/3 и нейтрализует ингибиторную активность таких KIR. Указанный способ включает отбор таких антител, которые перекрестно реагируют по меньшей мере с продуктами гена KIR2DL1 и KIR2DL2/3, способны восстанавливать лизис NK клетками Cw3+ или Cw4+ клеток-мишеней и связываются с клетками NK или полипептидом KIR примата. Описаны антитела, полученные таким способом, и их производные, где антитело сшито с токсином, радионуклеидом, распознаваемой группировкой, твердым носителем или ПЭГ. Использование изобретения обеспечивает получение единичного типа антител, который регулирует активность клеток NK разного типа, обеспечивает усиление их цитотоксичности, что может найти применение в терапии, для повышения у индивидуумов активности или цитотоксичности клеток NK без предварительного определения у индивидуума типа HLA. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл.

1. Способ получения антитела для связывания с NK-клетками, которое перекрестно реагирует с продуктами гена KIR2DL1 и KIR2DL2/3 и которое нейтрализует ингибиторную активность таких KIR, включающий следующие этапы:
(a) иммунизацию млекопитающего, не являющегося человеком, иммуногеном, содержащим полипептид KIR2DL;
(b) получение антител из указанного иммунизированного млекопитающего, причем эти антитела связываются с указанным полипептидом KIR2DL;
(c) отбор антител, полученных на этапе (b), которые перекрестно реагируют по меньшей мере с продуктами гена KIR2DL1 и KIR2DL2/3, и (а) отбор антител, полученных на этапе (с), которые способны восстанавливать лизис NK клетками Cw3+ или Cw4+ клеток-мишеней;
(е) отбор антител, которые связываются с клетками NK или полипептидом KIR примата.

2. Способ по п 1, где примат в этапе (е) - это обезьяна Cynomolgus.

3. Антитело для связывания с NK-клетками, полученное способом по п.1, которое связывается и с KIR2DL1, и с KIR2DL2/3, но не с KIR2DS4.

4. Антитело по п 3, представляющее собой моноклональное антитело.

5. Антитело по п 3, представляющее собой фрагмент антитела.

6. Антитело по п.5, представляющее собой Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диаантитело, одноцепочечный фрагмент антитела, полиспецифическое антитело, образованное фрагментами антител.

7. Производное антитела для связывания с NK-клетками, содержащее антитело по п.3, где это антитело конъюгировано или ковалентно сшито с токсином, радионуклидом, распознаваемой группировкой, с твердым носителем или ПЭГ.