КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОЙ АКТИВНОСТИ NK Российский патент 2010 года по МПК C07K16/28 C12N5/20 C12P21/08 A61K39/395 A61P37/04 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены специфические антитела, которые связываются по крайней мере с KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 рецептором человека, нейтрализуют опосредованное KIR ингибирование клеточной цитотоксичности NK клеток, в отношении Cw3+ или Cw4+ клеток-мишеней. Описаны: гибридная клетка на основе В-лимфоцита для получения антител, варианты способа получения антитела, а также способ выявления присутствия NK-клеток, способ очистки NK-клеток с использованием антитела и варианты фармацевтической композиции на основе антитела. Предложено использование антитела для приготовления лекарственного средства. Использование изобретения обеспечивает получение антитела, которое регулирует активность клеток NK разного типа, обеспечивает усиление их цитотоксичности, что может найти применение в терапии, для повышения у индивидуумов активности или цитотоксичности клеток NK. 14 н. и 49 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл.

1. Антитело, которое связывается, по крайней мере, с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2 рецептором человека и KIR2DL3 рецептором человека - продуктами гена рецептора человеческого ингибиторного киллерного Ig-подобного рецептора (KIR-рецептора), названное антитело способно нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование клеточной цитотоксичности NK клеток, в отношении Cw3+ или Cw4+ клеток-мишеней, экспрессирующих в NK клетках, по крайней мере, один из KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 рецепторов человека, при этом это антитело не является NKVSF1, где названное антитело получено отбором из библиотеки или набора моноклональных антител или их функциональных фрагментов или путем иммунизации млекопитающего иммуногеном, содержащим KIR2DL, с последующим отбором антитела, где каждый из указанных отборов антител осуществляют по оценке их способности восстанавливать лизис NK клетками Cw3+ или Cw4+ клеток мишеней, причем названное антитело необязательно конъюгировано или ковалентно связано с токсином, детектируемой меткой или твердой подложкой.

2. Антитело по п.1, где названное антитело связывается с KIR2DL1 рецептором человека и KIR2DL2/3 рецептором человека.

3. Антитело по п.1, где названное антитело ингибирует связывание молекулы HLA-C аллеля, имеющей остаток Lys в положении 80, с человеческим KIR2DL1 рецептором и связывание молекулы HLA-C аллеля, имеющей остаток Asn в положении 80, с человеческими KIR2DL2/3 рецепторами.

4. Антитело по п.3, которое конкурирует с DF200, продуцируемым клетками CNCM 1-3224, за связывание с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2/3 рецептором человека или с обоими KIR2DL1 и KIR2DL2/3.

5. Антитело, которое связывается, по крайней мере, с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2 рецептором человека и KIR2DL3 рецептором человека - продуктами гена рецептора человеческого ингибиторного киллерного Ig-подобного рецептора (KIR-рецептора), названное антитело способно нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование клеточной цитотоксичности NK клеток, в отношении Cw3+ или Cw4+ клеток мишеней, экспрессирующих в NK клетках, по крайней мере, один из KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 рецепторов человека, и названное антитело не является NKVSF1, где названное антитело получено отбором из библиотеки или набора моноклональных антител или их функциональных фрагментов или путем иммунизации млекопитающего иммуногеном, содержащим KIR2DL, с последующим отбором антитела, где каждый из указанных отборов антител осуществляют по оценке их способности восстанавливать лизис NK клетками Cw3+ или Cw4+ клеток мишеней, причем названное антитело конкурирует с DF200, продуцируемым клетками CNCM 1-3224, за связывание KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2/3 рецептором человека или с обоими KIR2DL1 и KIR2DL2/3 рецептором человека.

6. Антитело по п.4 или 5, которое содержит одну или более CDR тяжелой цепи вариабельной области DF200, продуцируемое клетками CNCM 1-3224, как показано в SEQ ID No. 10, 11 и 12.

7. Антитело по п.4 или 5, которое содержит тяжелую цепь вариабельной области DF200, продуцируемое клетками CNCM 1-3224, как показано в SEQ ID No 9.

8. Антитело по пп.1-7, которое является моноклональным антителом или функциональным фрагментом моноклонального антитела.

9. Антитело по п.8, которое является моноклональным антителом DF200, продуцируемым клетками CNCM 1-3224, или его фрагментом.

10. Антитело по п.1, которое является фрагментом антитела, выбранным из Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, диа-антителом, или одноцепочечным фрагментом антитела.

11. Антитело по п.8, которое является гуманизированным антителом.

12. Антитело по п.8, которое является человеческим антителом.

13. Антитело по п.8, которое является химерным антителом.

14. Клетка, включающая:
(а) В-клетку из хозяина млекопитающего, не являющегося человеком, который был иммунизирован рекомбинантным KIR2DL-белком, слитую с
(б) иммортализованной клеткой,
причем названная клетка производит моноклональное антитело, охарактеризованное в п.8, указанное антитело не является антителом, которое перекрестно реагирует только с KIRDL2, KIRDL3, но ни с какими другими ингибиторными KIR2DL-рецепторами.

15. Клетка по п.14, где названное антитело связывается с KIR2DL1 и KIR2DL2/3.

16. Клетка по п.14, которая производит антитело, которое ингибирует связывание молекулы HLA-c аллеля, имеющей остаток Lys в положении 80, с рецептором KIR2DL1 человека, и связывание молекулы HLA-C аллеля, имеющей остаток Asn в положении 80, с рецептором KIR2DL2/3 человека.

17. Клетка по п.15, которая производит антитело, конкурирующее с моноклональным антителом DF200, производимым гибридомой CNCM I-3224, за связывание с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2/3 рецептором человека или с обоими KIR2DL1 и KIR2DL2/3 рецепторами человека.

18. Клетка по п.14, которая является гибридомой DF200 CNCM I-3224.

19. Способ получения антитела, охарактеризованного в п.1, включающий стадии:
(а) иммунизация млекопитающего (не человека) иммуногеном, включающим ингибиторный KIR2DL полипептид;
(б) приготовление антител из названного иммунизированного животного, где названные антитела связываются с названным KIR2DL полипептидом,
(в) селекция антител (б), которые перекрестно реагируют, по крайней мере, с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2 рецептором человека и KIR2DL3 рецептором человека и
(г) селекция антител (в), которые способны нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование клеточной цитотоксичности NK в популяции NK клеток, экспрессирующих названные KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 рецепторы человека,
причем порядок стадий (в) и (г) при необходимости может быть обращен, а названное антитело не является антителом, которое перекрестно реагирует только с KIR2DL2, KIR2DL3, но ни с какими другими ингибиторными KIR-рецепторами.

20. Способ по п.19, в котором антитело, полученное на стадии (б), является моноклональным антителом.

21. Способ по п.19, в котором ингибиторный KIR полипептид, использованный для иммунизации, является KIR2DL полипептидом, и антитела, отобранные на стадии (в), перекрестно реагируют, по крайней мере, с KIR2DL1 и KIR2DL2/3.

22. Способ по п.21, в котором названное антитело, выбранное на стадии (в), ингибирует связывание молекулы HLA-c аллеля, имеющей остаток Lys в положении 80, с человеческим KIR2DL1 рецептором и связывание молекулы HLA-C аллеля, имеющей остаток Asn в положении 80, с человеческим KIR2DL2/3 рецепторами.

23. Способ по п.19, в котором названное антитело или фрагмент антитела, конкурирует с DF200, продуцируемым клетками CNCM 1-3224, за связывание с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2/3 рецептором человека или с обоими KIR2DL1 и KIR2DL2/3.

24. Способ по п.20, включающий дополнительную стадию приготовления фрагментов выбранных моноклональных антител.

25. Способ получения антитела, охарактеризованного в п.8, которое связывается, по крайней мере, с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2 рецептором человека и KIR2DL3 рецептором человека, где названное антитело способно нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование клеточной цитотоксичности NK в популяции NK клеток, экспрессирующих KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3, включающий стадии:
(а) селекция из библиотеки или набора моноклонального антитела или фрагмента антитела, которое перекрестно реагирует, по крайней мере, с KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 и
(б) селекция антитела (а), которое способно нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование клеточной цитотоксичности NK в популяции NK клеток, экспрессирующих названные, по крайней мере, KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3,
причем названное антитело не является антителом, которое перекрестно взаимодействует только с KIR2DL2, KIR2DL3, но ни с какими другими ингибиторными KIR-рецепторами.

26. Способ по п.25, в котором названное антитело, выбранное на стадии (б), ингибирует связывание молекулы HLA-c аллеля, имеющей остаток Lys в положении 80, с человеческим KIR2DL1 рецептором и связывание молекулы HLA-C аллеля, имеющей остаток Asn в положении 80, с человеческими KIR2DL2/3 рецепторами.

27. Способ по п.26, в котором названное антитело конкурирует с DF200, продуцируемым клетками CNCM 1-3224, за связывание с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2/3 рецептором человека или с обоими KIR2DL1 и с KIR2DL2/3.

28. Способ по п.25, включающий дополнительную стадию приготовления фрагментов выбранных моноклональных антител.

29. Способ получения антитела, охарактеризованного в п.8, включающий стадии:
(а) культивирование клетки по любому одному из пп.14-18, приводящее к экспрессии названного моноклонального антитела, и
(б) отделение названного моноклонального антитела из названной клетки.

30. Способ по п.29, включающий дополнительную стадию приготовления фрагментов названного моноклонального антитела.

31. Способ получения антитела, охарактеризованного в п.8, включающий стадии:
(а) выделение из клетки по любому из пп.14-18 ДНК, кодирующей названное моноклональное антитело;
(б) при необходимости модификация названной ДНК так, что она кодирует модифицированное или преобразованное антитело, выбранное из гуманизированного антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела или иммунореактивного фрагмента антитела;
(в) встраивание названной ДНК или модифицированной ДНК в экспрессионный вектор, приводящее к экспрессии названного антитела или фрагмента антитела, когда названный экспрессионный вектор представлен в хозяине;
(г) трансфекция клетки хозяина названным экспрессионным вектором, где названная клетка хозяина не производит иначе иммуноглобулиновый белок;
(д) культивирование названной трансфицированной клетки хозяина, приводящее к экспрессии названного антитела или фрагмента антитела; и
(е) выделение антитела или фрагмента антитела, производимого названной трансфицированной клеткой хозяина.

32. Антитело, полученное по любому из пп.19-31, которое не является NKVSF1 антителом и которое связывается, по крайней мере, с KIR2DL1 рецептором человека, KIR2DL2 рецептором человека и KIR2DL3 рецептором человека - продуктами гена рецептора человеческого ингибиторного киллерного Ig-подобного рецептора (KIR-рецептора), где названное антитело способно нейтрализовать опосредованное KIR ингибирование клеточной цитотоксичности NK клеток, в отношении Cw3+ или Cw4+ клеток мишеней, экспрессирующих в NK клетках, по крайней мере, один из KIR2DL1, KIR2DL2 и KIR2DL3 рецепторов человека.

33. Фармацевтическая композиция, усиливающая NK цитотоксичность, содержащая эффективное количество антител, охарактеризованных в п.1 или 5, для обнаружения усиления клеточной цитотоксичности NK у пациента или в биологическом образце, включающем NK клетки антител, и фармакологически приемлемый носитель или эксципиент, причем указанные антитела не являются антителами, которые перекрестно взаимодействуют только с KIRDL2 и KIRDL3, но ни с какими другими ингибиторами KIR-рецепторов.

34. Композиция по п.33, в которой названное антитело представляет собой антитело по любому из пп.1-13 или 32.

35. Фармацевтическая композиция, усиливающая NK-цитотоксичность, которая содержит антитела, охарактеризованные в п.1 или 5, причем названные антитела представлены в количестве, эффективном для обнаруживаемого усиления клеточной цитотоксичности NK у пациента или в биологическом образце, содержащем NK клетки; фармакологически приемлемый носитель или эксципиент; и дополнительный терапевтический агент, выбранный из иммуномодулирующего агента, гормонального агента, хемотерапевтического агента, анти-ангиогенного агента, апоптического агента, анти-апоптического агента, вторичного антитела, которое присоединяется и ингибирует ингибиторный KIR-рецептор, анти-инфекционного агента, агента против хозяина или адъювантного соединения.

36. Композиция по п.33, дополнительно включающая терапевтический агент, выбранный из иммуномодуляторного агента, гормонального агента, химиотерапевтического агента, анти-ангиогенного агента, апоптотического агента, анти-апоптического агента, вторичного антитела, которое связывается с и ингибирует ингибиторный KIR-рецептор, анти-инфекционного агента и агента против хозяина или адьювантного соединения.

37. Композиция по п.35 или 36, в которой названный иммуномодуляторный агент выбран из IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-α, TNF-β, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-α, IFN-β или IFN-γ.

38. Композиция по п.35 или 36, в которой названный химиотерапевтический агент выбран из алкилирующих агентов, антиметаболитов, цитотоксических антибиотиков, адриамицина, дактиномицина, митомицина, карминомицина, дауномицина, доксорубицина, тамоксифена, таксола, таксотера, винкристина, винбластина, винорелбина, этопозида (VP-16), 5-фторурацила (5FU), цитозин арабинозида, циклофосфамида, тиотепа, метотрексата, камптотецина, актиномицина D, митомицина С, цисплатина (CDDP), аминоптерина, комбретастатина(ов), других винка алкалоидов и их производных или пролекарств.

39. Композиция по п.35 или 36, в которой названный гормональный агент выбран из леупрорелина, гозерелина, трипторелина, бузерелина, тамоксифена, торемифена, флутамида, нилутамида, ципротерон бикалутамид анастрозола, экземестана, летрозола, фадрозола, медрокси, хлормадинона, мегестрола, других агонистов LHRH, других анти-эстрогенов, других анти-андрогенов, других ингибиторов ароматазы и других прогестагенов.

40. Композиция по п.35 или 36, в которой названный дополнительный агент выбран из фенотиазинов, замещенных бензамидов, антигистаминов, бутирофенонов, кортикостероидов, бензодиазепинов, каннабиноидов, золендроновой кислоты, памидроновой кислоты, эритропоэтина, G-CSF, филгастима, ленограстима, дарбепоэтина, других анти-эметиков, других антагонистов серотонина, других бифосфонатесоров, других гематопоэтических ростовых факторов.

41. Композиция по п.35 или 36, в которой названные анти-апоптотические агенты представляют собой антисмысловую нуклеотидную последовательность и-РНК, siPHK, или малую молекулу химического соединения, которая ингибирует экспрессию гена, выбранного из bcr-abl, bcl-2, Bck-xl, Mcl-1, Bak, A1 или А20.

42. Композиция по п.35 или 36, в которой названный анти-ангиогенный агент выбран из нейтрализующих антител, антисмысловой РНК, siPHK, и-РНК, РНК аптамеров или рибозимов, направленных против гена, кодирующего VEGF, гена, кодирующего VEGF рецептор, VEGF или VEGF рецептор; или варианты VEGF, обладающие антагонистическими свойствами против VEGF.

43. Композиция по п.35 или 36, где названное вторичное антитело, которое связывается с и ингибирует ингибиторный KIR-рецептор, является антителом или его производным, или фрагментом, которое связывается с эпитопом ингибиторного KIR-рецептора, отличающимся от эпитопа, связанного названным антителом, которое связывается с общей детерминантой, представленной, по крайней мере, на двух различных продуктах гена ингибиторного KIR-рецептора человека.

44. Применение композиции по любому из пп.33-43 для приготовления лекарственного средства для потенцирования активности клеток NK у пациента, нуждающегося в этом потенцировании.

45. Применение по п.44, при котором указанный пациент страдает от рака, других пролиферативных заболеваний, иммунного заболевания или инфекционного заболевания.

46. Применение по п.45, при котором указанный пациент страдает от скваматозной клеточной карциномы, лейкемии, острой лимфоцитной лейкемии, острой лимфобластной лейкемии, лимфомы В-клеток, лимфомы Т-клеток, лимфомы Ходжкина, не-Ходжкиновской лимфомы, опушенной клеточной лимфомы, лимфомы Буркетса, острой или хронической миелогенной лейкемии, промиелоцитной лейкемии, фибросаркомы, рабдомиосаркомы; меланомы, семиномы, тератокарцитомы, нейробластомы, глиомы, астроцитомы, шванном; фибросаркомы, рабдомиосаркомы, остеосаркомы, меланомы, ксеродерма пигментозум, кератоакантомы, семиномы, тироидного фолликулярного рака, тератокарциномы, других карцином мочевого пузыря, молочной железы, кишечника, почки, печени, легкого, яичника, простаты, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы или кожи, других гематопоэтических опухолей лимфоидных клонов, других гематопоэтических опухолей миелоидного происхождения, других опухолей мезенхимальной природы, других опухолей центральной или периферической нервной системы или других опухолей мезенхимальной природы.

47. Применение по п.45, при котором указанный пациент страдает от острой миелобластной лейкемии (AML).

48. Применение по п.45, при котором указанный пациент страдает от лимфомы не-Ходжкина.

49. Применение по п.45, при котором указанный пациент страдает от карциномы груди.

50. Применение по п.45, при котором пациент страдает от карциномы яичников.

51. Применение по п.45, при котором указанный пациент страдает от гематопоэтических опухолей лимфоидных клонов.

52. Применение по п.51, при котором указанная опухоль выбрана из Т-пролимфоцитной лейкемии (T-PLL), включая мелкоклеточный и мозговой клеточный тип; большую гранулярную лимфоцитную лейкемию (LGL) Т-клеточного типа, синдром Цезаря (SS); острую Т-клеточную лейкемийную лимфому (ATLL), a/d T-NHL гепатоселезеночную лимфому; периферическую пост-тимусную Т-клеточную лимфому плеоморфического или иммунобластического подтипа; ангио-иммунобластическую Т-клеточную лимфому; ангиоцентрическую (назальную) Т-клеточную лимфому; анапластическую (Ki 1+) крупноклеточную лимфому; интестинальную Т-клеточную лимфому; Т-лимфобластическую лейкемию; или лимфому/лейкемию (T-LbLy/T-ALL).

53. Применение по п.45, при котором названный пациент страдает от пролиферативного расстройства, выбранного из гиперплазии, фиброза, ангиогенеза, псориаза, атеросклероза, стеноза или рестеноза после ангиопластики и других заболеваний, характеризующихся пролиферацией в гладких мышцах кровеносных сосудов.

54. Применение по п.45, при котором названный пациент страдает от инфекционного заболевания, вызванного вирусом, выбранным из вируса гепатита типа А, вируса гепатита типа В, вируса гепатита типа С, гриппа, ветряной оспы, аденовируса, симплексного вируса герпеса типа I (HSV-1), симплексного вируса герпеса типа 2 (HSV-2), вируса чумы рогатого скота, риновируса, эховируса, ротавируса, респираторного синтициального вируса, вируса папилломы, цитомегаловируса, эхиновируса, арбовируса, хунтавируса, вируса кокксаки, вируса свинки, вируса кори, вируса краснухи, вируса полиомиелита или вируса иммунодефицита человека типа 1 или типа 2 (HIV-1, HIV-2).

55. Применение по п.45, при котором названный пациент страдает от инфекционного заболевания, вызванного бактерией, простейшим или паразитом, выбранным из Staphylococcus, S. pyogenes, Enterococcus, Bacillus anthracis, Lactobacillus, Listeria, Corynebacterium diphteria, G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponema; Camplyobacter; Raeruginosa; Legionella; N. meningitides; F. Meningosepticum; F. Adoratum; Brucella; B. pectussis; B. bronchiseptica; E.coli; Klebsiella; Enterobacter; S. Marcescens; S. liquefaciens; Edwardsiella; P. Mirabilis; P. Vulgaris; Streptobacillus; R. Fickettsfi; C. psittaci; C. trachomatis; M. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluitum; M. laprae, M. avium; M. bovis; M. afncanum; M. kansasii; M. intracellulare; M. lepraemurium; Nocardia; других Streptococcus, других Bacillus, других Gardnerella, других Pseudomonas, других Neisseria, других Flavobacteria, других Bordetella, других Escherichia, других Serratia, других Proteus, других Rickettsiaceae, других Chlamydia, других Micobacterium, лейшманий, кокцидий, трипаносом, хламидий или рикеттсий.

56. Применение по п.45, при котором лекарственное средство применяют в комбинации с приемлемым дополнительным терапевтическим агентом, выбранным из иммуномодуляторного агента, гормонального агента, химиотерапевтического агента, анти-ангиогенного агента, апоптотического агента, вторичного антитела, которое связывается с и ингибирует ингибиторный KIR-рецептор, анти-инфекционного агента, агента против хозяина или адъювантного соединения, где названный дополнительный терапевтический агент вводится названному пациенту как единичная дозированная форма с названным антителом, или как отдельная дозированная форма.

57. Применение по п.56, при котором указанный пациент страдает от гематопоэтических опухолей лимфоидных клонов, острой миелобластной лейкемии (AML) или от лимфомы не-Ходжкина.

58. Применение по п.56, при котором указанный пациент страдает от карциномы груди или яичников.

59. Антитело по п.1, которое конъюгировано или ковалентно связано с токсином, детектируемой меткой или твердой подложкой.

60. Способ выявления присутствия NK клеток, несущих на их клеточной поверхности ингибиторный KER2DL, в биологическом образце или живом организме, названный способ включает стадии:
а) контактирование названного биологического образца или живого организма с антителом по п.1, где названное антитело конъюгировано или ковалентно связано с детектируемой структурой, и
б) детектирование присутствия названного антитела в названном биологическом образце или живом организме, присутствие которого указывает на присутствие клеток NK.

61. Способ очистки из образца NK клеток, несущих ингибиторный KIR2DL на их клеточной поверхности, включающий стадии
а) контактирование названного образца с антителом по п.1 в условиях, которые позволяют названным NK клеткам, несущим ингибиторный KIR на их клеточной поверхности, связываться с названным антителом, где названное антитело конъюгировано или ковалентно связано с твердой подложкой, и
б) элюирование названных связанных NK клеток из названного антитела, конъюгированного или ковалентно связанного с твердой подложкой.

62. Композиция усиливающая NK-цитотоксичность, содержащая эффективное количество антител, охарактеризованных в п.1, в которой указанные антитела включены в липосомы.

63. Композиция по п.62, дополнительно содержащая агент, выбранный из молекулы нуклеиновой кислоты для доставки генов для генной терапии; молекулы нуклеиновой кислоты для доставки антисмысловой РНК, и-РНК или siPHK для подавления гена в NK клетке; или токсина или лекарственного средства для направленного уничтожения NK клеток, дополнительно включеннный в указанную липосому.
Приоритеты по пунктам:

01.07.2004 по пп.5-9, 11-18, 23-58;

02.07.2003 по пп.1, 8, 10-16, 19-22, 24-26, 28-63;

19.02.2004 по пп.1, 8, 10-16, 19-22, 24-26, 28-63.