СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ АУТОШТАММОВ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/02 

Предварительное перед врачебной манипуляцией получение аутоштаммов нормальной микрофлоры с целью их последующего введения необходимо во многих тех случаях, когда нормальная микрофлора гибнет. Это бывает в случае интенсивной химиотерапии, особенно злокачественных опухолей, при назначении радиотерапии и т.д. Своя микрофлора, полученная в юности и пересаженная в старости, оказывает оздоравливающий эффект.

Дело в том, что у каждого имеется своя собственная микрофлора. Она приживается лучше и оказывает больший терапевтический и даже омолаживающий эффект.

Между тем их идентификация как представителей резидентной микрофлоры представляет значительные трудности, так как может присутствовать и неотличимая от них транзиторная микрофлора.

Между тем известно, что количество транзиторных микроорганизмов, попавших на кожу, постепенно уменьшается, вплоть до полного их исчезновения, о чем говорят все авторы. Разумеется, это касается не всех микробов, а в первую очередь непатогенных или условнопатогенных, которые могут фигурировать в качестве представителей нормальной микрофлоры и только из которых и готовятся аутопробиотики.

А патогенные могут вести себя по-другому, например, палочка чумы, нанесенная на кожу в экспериментах на животных, не только не погибает, но проникает внутрь и вызывает заболевание.

«Чистая кожа здорового человека губительно действует на ряд микробов (гемолитический стрептококк, сальмонеллы брюшного тифа и паратифов, кишечная палочка и др.). Кислая среда пота связана с наличием в нем уксусной, молочной и жирных кислот, оказывающих бактерицидное действие на многие микроорганизмы». (Пяткин К.Д., Кривошеий Ю.С. Микробиология, издание четвертое, 1980, с.164).

«Транзиторная (непостоянная) микрофлора не способна к длительному существованию в организме, тогда как резидентная (постоянная) облигатная микрофлора постоянно присутствует в организме». (Воробьев А.А., Быков А.С. с соавт. Микробиология, Москва, «Медицина», 1998, стр.67).

«С чешуйками, секретом сальных и потовых желез удаляются не только различные вредные химические вещества, попадающие извне, но и микроорганизмы. Продукты типа лизоцима, низшие жирные кислоты (напр., олеиновая), кислая реакция кератина, секрета сальных и потовых желез создают так называемую кислую мантию кожи, неблагоприятную для размножения микробов, и оказывающую бактерицидное действие. Благодаря таким механизмам стерилизации кишечная палочка, например, нанесенная на кожу, погибает через 15-30 минут». (БМЭ, том 2, издание 3, 1979, с.23, столбец 50).

На этом основан способ определения иммунитета, предложенный Клемпарской Н.Н., Шальновым Г.А. (1966).

Клемпарская Н.Н., Шальнов Г.А. выделили наиболее доступные для обследования участки организма, прежде всего кожу, чтобы судить о состоянии антиинфекционной резистентности организма.

Методика чрезвычайно проста и наглядна. На коже передней поверхности предплечья равномерно распределяют тампоном взвесь разведенной суточной бульонной культуры кишечной палочки штамма М-17.

Сразу, а также через 15 минут делаются посевы с поверхности кожи (из разных участков) на питательный агар методом отпечатков и после инкубации в термостате в течение суток вычисляют индекс бактерицидности кожи - процент гибели жизнеспособных кишечных палочек через 15 минут после нанесения микробной взвеси на кожу.

Индекс бактерицидности для кожи здоровых людей через 15 минут составляет 90-100%.

Эта методика может считаться аналогом.

В качестве другого аналога выбран способ доказательства бактерицидности кожи, когда на кожу наносили культуру «чудесной палочки» и она через 30 минут полностью исчезала (БМЭ, том 13, 1959, стр.279).

Таким образом, о гибели чужеродных микроорганизмов, нанесенных на кожу, говорят все исследователи, уменьшение количества высеваемых микробов уже через 30 минут всегда становится выраженным или они погибают полностью.

Резидентные же микроорганизмы, как это было установлено нами, сохраняются значительно дольше.

Суть предлагаемого изобретения заключается в новом обнаруженном нами явлении - организм проявляет толерантность к собственной микрофлоре, помещенной на кожу.

Аутоштаммы микроорганизмов, нанесенные на кожу обследуемого, сохраняются значительно дольше по сравнению с аналогичными штаммами, имеющими другое происхождение. Полностью различные их виды погибают только через 3-8 часов, что было проверено в специально поставленном эксперименте.

За прототип взят способ селекции аутоштаммов при помощи сыворотки пациента (патент №2139070, 1999), который является трудозатратным и сопряжен со взятием крови из вены. Для больного взятие крови является неприятной процедурой.

Идентификация аутоштаммов нормальной микрофлоры начинается с того, что из материала обследуемого выделяется чистая культура микробов.

Выделение и идентификация микроорганизмов из материала обследуемого проводились обычным классическим методом.

Материал обследуемого (испражнения, отделяемое влагалища, зева, полости носа) засевали на диффернциально-диагнстические питательные среды и культивировали при температуре 37°С в течение 18-24 часов. На второй день изучали выросшие колонии, из характерных для выделяемого вида колоний готовили микропрепараты и микроскопировали для определения родовой принадлежности выделенных микроорганизмов. Затем делали посев в пробирку со скошенной средой или среду Блаурока при выделении бифидумбактерий с целью накопления чистой культуры и снова помещали в термостат.

На третий день проводили дополнительно определение родовой, а также и видовой принадлежности выделенных микроорганизмов, для чего проводили их биохимическую и серологическую идентификацию. Засеянные среды для биохимической идентификации помещали в термостат, и на четвертый день учитывали результаты и делали заключение.

Методика идентификации аутоштаммов.

На тыльную поверхность кисти руки стерильным тампоном равномерно распределяют взвесь суточной бульонной культуры испытуемого микроорганизма, выделенного от исследуемого, разведенной в 10 раз, а на кисть другой руки - контрольный штамм культуры того же вида, но имеющий другое происхождение.

Подробная методика высева.

Стерильным тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия, снимают микробов с участка кожи, на который нанесены испытуемые культуры микробов, и делают посев на половину чашки Петри с дифференциально-диагностической средой. Точно также делают высев с другой руки и сеют на половину другой чашки.

Через 30 минут другим тампоном снимают микробов с участка кожи, несколько отступив от того места, где материал уже снимали, сначала одной руки, и делают посев на другую половину первой чашки, а затем с другой руки и сеют на половину второй чашки. Через сутки инкубирования в термостате при 37°С сравнивают интенсивность роста на обеих половинках чашек Петри или отмечают вообще отсутствие их роста в контроле.

Второй посев делается через 30 минут, что еще не обременительно для обследуемого, а разница в количестве высеваемых жизнеспособных колоний между первым и вторым высевом становится более выраженной, вплоть до полного отсутствия роста чужеродного штамма при повторном посеве. Аутоштаммы же через 30 минут высеваются всегда, что было установлено в многочисленных опытах.

Таким образом, если испытуемая культура является аутоштаммом, то количество выросших колоний уменьшится незначительно, тогда как в контрольном посеве (чужеродного штамма) колоний или совсем не окажется, или, если и вырастут, например, при пониженном иммунитете, то их все равно будет значительно меньше.

Идентификация всех аутоштаммов нормальной микрофлоры проводилась по этой разработанной нами методике.

Пример 1.

Идентификация аутоштамма кишечной палочки.

У шести здоровых исследуемых людей сравнивалась выживаемость выделенных от них культур кишечной палочки по сравнению с производственным штаммом М-17 по вышеописанной методике.

Таблица 1 Результаты выживаемости культур кишечной палочки через 30 минут. Обследуемые Опыт Контроль 1 + - 2 + - 3 + - 4 + - 5 + - 6 + - Примечание: (+) - наличие роста (-) - отсутствие роста

Следует отметить, что в этом и во всех нижеприведенных примерах рост микробов при посеве «тотчас» отмечался во всех случаях как в опыте, так и в контроле.

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что и через 30 минут в опыте кишечная палочка, выделенная из организма обследуемого, сохранилась, что позволяет считать ее аутоштаммом, тогда как в контроле бактерии во всех случаях погибли, о чем говорит полное отсутствие их роста.

Пример 2.

Для идентификации следующей группы аутоштаммов были взяты такие представители нормальной микрофлоры, как выделенные из организма обследуемых энтерококки.

Из таблицы 2 видно, что энтерококки аутоштаммов также выживают значительно лучше по сравнению с контрольным штаммом энтерококка. Производственный штамм № - «Faecium SF 68».

Таблица 2 Результаты выживаемости культур энтерококка. Обследуемые Опыт Контроль 1 + - 2 + - 3 + - 4 + - 5 + - Примечание: (+) - наличие роста (-) - отсутствие роста

Пример 3

Идентификация бифидумбактерий

У трех здоровых исследуемых людей сравнивалась выживаемость выделенных от них культур бифидумбактерий по сравнению с выживаемостью производственного штамма 791 бифидумбактерий, взятого в качестве контроля. Посевы с бифидумбактериями инкубировались в анаэростате.

Таблица 3 Результаты выживаемости культур бифидумбактерий. Обследуемые Опыт Контроль 1 + - 2 + - 3 + - Примечание: (+) - наличие роста (-) - отсутствие роста

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что бифидумбактерии, выделенные из организма обследуемых и помещенные на их кожу, за 30 минут не погибают, при полной гибели контрольного производственного штамма бифидумбактерии 791, что позволяет отнести выделенные микроорганизмы к аутоштаммам.

Пример 4

Идентификация лактобактерий. У шести здоровых исследуемых людей сравнивалась выживаемость выделенных от них культур бифидумбактерий по сравнению с культурой лактобатерий штамма «лактобациллюс плантарум №8Р-А3» по вышеописанной методике.

Таблица 4 Результаты выживаемости культур лактобактерий. Обследуемые Опыт Контроль 1 + - 2 + - 3 + - 4 + - 5 + - 6 + - Примечание: (+) - наличие роста (-) - отсутствие роста

Результаты 6 опытов, представленных в таблице 4, также свидетельствуют о принадлежности культур, выделенных у обследуемых к аутоштаммам.

Следующим для проверки принадлежности микроорганизма к аутоштамму был взят микрококк, также выделенный из организма, а в качестве контрольного штамма «Микрококкус лизодейтикус».

Таблица 5 Результаты выживаемости культур микрококков. Обследуемые Опыт Контроль 1 + - 2 + - 3 + - 4 + - Примечание: (+) - наличие роста (-) - отсутствие роста

Как видно из таблицы 5, выделенные из организма обследуемых микрококки после пребывания на коже их рук также через 30 минут не погибли, а сохранились, тогда как контрольный во всех 4 случаях за это же время погиб и при высеве через 30 минут не выделялся. Это дает возможность считать выделенные культуры микрококков также аутоштаммами.

Пример 5.

Проводилась идентификация аутоштаммов эпидермальных стафилококков, выделенных из полости носа. Длительность их выживаемости сравнивалась с выживаемостью стафилококка штамма Р-109.

Данные таблицы 5 также свидетельствуют о гибели через 30 минут контрольного штамма, тогда как выделенные из организма микробы при тех же условиях остались живыми, что свидетельствует об их принадлежности к аутоштаммам.

Таблица 6 Результаты выживаемости культур эпидермального стафилококка. Обследуемые Опыт Контроль 1 + - 2 + - 3 + - Примечание: - (+) - наличие роста (-) - отсутствие роста

Во всех случаях, приведенных в наших примерах, микроорганизмы нормальной микрофлоры, выделенные из организма обследованных, сохранили жизнеспособность в течение 30 минут на их же коже, тогда как аналогичные за это же время всегда погибали, что позволяет идентифицировать выделенных микробов как аутоштаммы.

Таким образом, предлагаемый способ идентификации аутоштаммов является более простым, точным и нетрудоемким.

Изобретение относится к области медицины и микробиологии и представляет собой способ идентификации аутоштаммов микроорганизмов нормальной микрофлоры. Способ включает нанесение на кожу одной руки обследуемого выделенного от него микроорганизма, а на кожу другой руки - аналогичного, имеющего другое происхождение. Тотчас и через 30 минут осуществляют забор микроорганизмов с кожи тампоном, смоченным стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, и посев на селективную питательную среду. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение суток, а затем сравнивают рост колоний. Аутоштаммы идентифицируют по большей интенсивности роста и большему количеству колоний. Изобретение позволяет быстро и нетравматично для обследуемого идентифицировать аутоштаммы. 6 табл.

Способ идентификации аутоштаммов микроорганизмов нормальной микрофлоры, включающий нанесение на кожу одной руки обследуемого выделенного от него микроорганизма, а на кожу другой руки - аналогичного, имеющего другое происхождение, с последующим их забором и посевом на селективную питательную среду тампоном, смоченным стерильным изотоническим раствором хлорида натрия тотчас и через 30 мин, инкубацию посевов в термостате при температуре 37°С в течение суток и идентификацию аутоштаммов по большей интенсивности роста и большему количеству колоний.