СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ АУТОШТАММА ЛАКТОБАКТЕРИЙ ЖИДКОЙ "ЛАКТИ" Российский патент 2008 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 C12R1/225 

Изобретение относится к области микробиологии и медицины и касается изготовления биомассы аутоштамма лактобактерий жидкой, применяемой для коррекции и поддержания микробиоценоза кишечника и генитального тракта как с целью профилактики, так и для восстановления микрофлоры при дисбактериозе.

Лактобактерии, входящие в состав нормофлоры, выполняют такие важные функции, как участие в переваривании и усвоении пищи путем активизации пристеночного пищеварения и утилизации пищевых субстратов. Вырабатывая в процессе жизнедеятельности молочную кислоту, перекись водорода, лизоцим, лактолин, выполняют антагонистическую функцию по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Лактобактерии относятся к единственным представителям нормофлоры, подавляющим рост и развитие в кишечнике гнилостных бактерий, а также возбудителей кишечных инфекций, в том числе возбудителей дизентерии и сальмонеллеза.

Лактобактерии являются основным микробиологическим звеном, формирующим колонизационную резистентность (защиту) в желудке и тонком кишечнике.

Известен способ получения препарата для лечения желудочно-кишечных заболеваний, который заключается в культивировании штамма Lactobaccilus Bulgaricus в питательной среде, приготовленной из сои в анаэробных условиях при 35-42°С с последующим высушиванием культуры, добавлением сахара, грануляцией полученной смеси и таблетированием (а.с. СССР №619187, опубл. 15.08.78 г.).

Однако описанный способ предлагает применять для лечения желудочно-кишечных заболеваний только один вид лактобактерий, который не относится к одноименному виду лактобактерий кишечника потребителя препарата (в настоящее время выделено и изучено 67 видов лактобактерий) и не является его аутохтонной микрофлорой. Отсутствие на поверхности лактобактерий адгезинов, родственных клеткам слизистой желудочно-кишечного тракта, не способствует приживлению, размножению и колонизации Lactobaccilus Bulgaricus.

Кроме того, при приеме бактерий, находящихся в состоянии покоя, которое достигается при длительном замораживании и лиофильной сушке, применяемых при производстве препарата, необходимо время (2-3 суток) для восстановления активности бактериальной клетки, что снижает эффект лечения.

Известен способ изготовления аутоштаммов бифидо- и лактобактерий, включающий в себя этапы забора испражнений, выращивания бактерий и приготовления биомассы из них (а.с. СССР №1286212, опубл. 30.01.87 г.).

Однако суспензия бифидо- и лактобактерий, приготовленная указанным способом, требует немедленного применения и не хранится более 2-3 суток, так как производится без применения стабилизатора, который способствует сохранению бактерий аутоштамма в активном состоянии более длительное время. Не проводится контроль приготовленной суспензии на активность бактерий и отсутствие посторонней микрофлоры, что противоречит требованиям законодательной документации и не ограждает потребителя от заноса при приеме суспензии посторонней микрофлоры.

Посев испражнений производится после титрования исследуемого материала стерильным физиологическим раствором, делая последовательно десятикратные разведения до 10^-8. Однако не производится посев из нативного материала, что не представляет возможным получить культуру бифидо- и лактобактерий при снижении их содержания в кишечнике менее чем 100 КОЕ в 1 г химуса.

Наиболее близким, принятым за прототип, является способ получения банка аутохтонных штаммов микроорганизмов для восстановления кишечного микробиоценоза человека (патент РФ №2126043, опубл. 10.02.99 г.).

Данный способ включает в себя отбор проб фекалий, выделение аутоштаммов бифидобактерий, лактобактерий, энтерококков, кишечной палочки, наработку биомассы, консервирование и хранение в течение жизни человека. Периодически банк аутохтонных штаммов пополняется биомассой поздних лет жизни. Ранее приготовленные образцы аутоштаммов периодически (не реже 1 раза в год) подвергаются контролю на активность и повторному процессу производства, если активность снижена более нормативной.

Однако при изготовлении банка образцов делают посев испражнений с десятикратным разведением после титрования стерильным физиологическим раствором, минуя этап посева нативных испражнений. При такой методике исключается возможность получения культур при снижении их числа в кишечнике менее чем 100 КОЕ в 1 г.

Выращивают и отбирают ограниченное число видов бифидобактерий, лактобактерий, энтерококков, кишечной палочки, хотя в настоящее время известно, например, одних только лактобактерий около 67 видов. Таким образом, виды лактобактерий, не относящихся к выше перечисленным, в образцы не попадают.

Не проводится контроль полученных аутоштаммов на активность и отсутствие посторонней микрофлоры, что является неотъемлемой частью производства. Многократное повторение процесса лиофильной сушки одного и того же ранее полученного образца аутоштамма приводит к снижению биохимической активности и утрате способности адгезировать и колонизировать слизистые оболочки желудочно-кишечного и генитального тракта.

Ректальное введение микробной массы через зонд затрудняет процесс приема биомассы, не представляется возможным производить эту процедуру в домашних условиях. Кроме того, введенные бактерии осядут в толстом кишечнике, в то время как желудок и тонкий кишечник, которые содержат в норме от 10³ до 10⁴ КОЕ лактобактерий в 1 мл химуса, заселению не подвергаются. А вместе с тем лактобактерии являются единственными микроорганизмами, создающими защиту слизистой желудка и 12-перстной кишки от таких условно-патогенных микроорганизмов, как хеликобактер, которые являются причиной возникновения гастритов и язвенной болезни желудка.

Предложенный способ получения банка аутохтонных штаммов микроорганизмов является очень трудоемким, дорогостоящим и доступным очень ограниченному кругу потребителей. Он также не может быть использован в промышленном объеме, т.к. требует наличия большого количества морозильных установок для хранения ранее приготовленных образцов, а также постоянной работы (не реже 1 раза в год) с каждым образцом биомассы аутоштамма.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение жидкой биомассы из клеток лактобактерий с родственной антигенной структурой клеткам кишечника потребителя, повышение качества полученной биомассы и увеличение срока сохранения активности клеток.

Техническим результатом является получение жидкой биомассы из клеток лактобактерий с родственной антигенной структурой клеткам кишечника потребителя, повышение качества полученной биомассы.

Технический результат достигается тем, что способ получения биомассы аутоштамма лактобактерий жидкой, предусматривающий отбор пробы нативного материала, посев на селективную питательную среду, выращивание лактобактерий, выделение лактобактерий, их контроль, проведение повторного пассажа, выращивание полученной культуры лактобактерий в селективной питательной среде с последующим добавлением консерванта и контролем полученной биомассы лактобактерий, согласно изобретению, первоначальный посев в селективную питательную среду производят без разведения нативного материала, не позднее двух часов с момента взятия пробы, к биомассе лактобактерий добавляют консервант, в качестве которого используют сахарозо-желатиновую среду, в соотношении 1:1 соответственно.

Между отличительными признаками и достигаемым техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь.

Посев нативного материала (испражнений), без его разведения непосредственно на селективную питательную среду, в течение 2-х часов с момента взятия пробы, позволяет выделить лактобактерии даже при незначительном количестве их в содержимом кишечника.

Повторный пассаж и выращивание полученной чистой культуры лактобактерии в селективной жидкой среде, с последующим добавлением консерванта из расчета 1:1 способствует сохранению активности клеток на протяжении одного и более месяцев.

Проведение контроля полученной жидкой биомассы гарантирует ее качество.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Для получения биомассы аутоштамма лактобактерии отбирают пробу нативного материала (испражнений) у конкретного человека. Не позднее двух часов с момента взятия пробы осуществляют ее посев, без разведения, на селективную питательную среду, в качестве которой используют стандартную молочно-растительную среду (МРС-4), что позволяет выделить лактобактерии даже при незначительном количестве их в содержимом кишечника, то есть менее 100 КОЕ в 1 г. При использовании наименьшего разведения 10^-1 и посеве по методике 0,1 мл возможно выделение лактобактерии при наличии их в содержимом кишечника в количестве более 100 КОЕ на 1 г. После выделения изучают морфологические, тинкториальные свойства выделенной культуры, подтверждающие принадлежность полученных клеток к семейству Lactobaccilacea...роду Lactobaccilus, т.к. на молочно-растительной среде возможен рост других бактерий, таких как стафилококки, грибы рода Candida, дрожжевые клетки, сходных по характеру роста с клетками лактобактерий.

Проводят повторный пассаж выделенных лактобактерий на селективную питательную среду МРС-4 с целью выращивания чистых популяций клеток, пассаж и выращивание полученнной чистой культуры лактобактерий в селективной жидкой среде МРС-1, после чего добавляют консервант из расчета 1:1 с целью сохранения активности клеток на протяжении одного и более месяцев.

Проводят контроль полученной жидкой биомассы на количество жизнеспособных лактобактерий и отсутствие посторонней микрофлоры, что оченнь важно при работе с культурами, выделенными из испражнений.

Пример. Нативный материал для посева забирают из порции испражнений конкретного человека в стерильную баночку или пробирку. Не позднее 2 часов с момента отбора пробы, после подготовки образца путем тщательного растирания в небольшом количестве стерильного физиологического раствора, производят посев на плотную селективную среду МРС-4.

Образцы с посевом нативного материала помещают в термостат, где выдерживают при температуре 36±1°С в течение 2-3 суток в атмосфере углекислого газа.

Изучают морфологические и тинкториальные свойства выделенной культуры, для чего ее образцы окрашивают по Граму.

Отношение микробов к окраске по Граму является важным дифференциальным признаком.

Изолируют колонию лактобактерий с помощью бактериологической петли, производят повторный пассаж и выращивание биомассы лактобактерий в течение 1-3 суток в условиях углекислого газа при температура 36±1°С, пассаж и выращивание полученной чистой культуры лактобактерий в селективной жидкой среде МРС-1, после чего вносят консервант в соотношении 1:1 из расчета одна часть селитивной жидкой питательной среды МРС-1 с выросшей чистой культурой и одна часть консерванта. Тщательно перемешивают. В качестве консерванта используют сахарозо-желатиновую среду.

Производят контроль каждого образца выращенной биомассы на отсутствие посторонней микрофлоры и количество жизнеспособных лактобактерий.

Для определения чистоты культуры (осутствие посторонней микрофлоры) отбирают 1 мл биомассы и производят посев на плотные питательные среды: питательный агар с 9% натрия хлорида, среду Сабуро, среду Эндо. Посевы помещают в термостат и выращивают 24-72 часа, после инкубации посевы просматривают. Посторонней микрофлоры не должно быть.

Для определения количества жизнеспособных лактобактерий в 1 мл биомассы готовят ряд десятикратных разведений.

Из пробирки с разведеннием 10^-5 отбирают 1 мл содержимого, производят посев на плотную среду МРС-4 и помещают в термостат при температуре 36±1°С на 44-48 часов в атмосферу углекислого газа.

По истечении времени инкубации проводят подсчет выросших колоний. Количество жизнеспособных лактобактерий в 1 мл биомассы определяют по формуле

А=В×10ⁿ,

где А - количество жизнеспособных лактобактерий в 1 мл биомассы;

В - число колоний, выросших на плотной среде МРС-4;

n - номер последней пробирки десятикратных разведений.

Биомасса должна содержать количество жизнеспособных лактобактерий не менее 10⁶ КОЕ в 1 мл биомассы.

В связи с тем, что по предлагаемому способу получают жидкую биомассу из клеток лактобактерий с родственной антигенной структурой клеткам кишечника потребителя, она может успешно применяться для восстановления нарушений микробиоценоза кишечника и поддержания его в здоровом состоянии как при дисбактериозах, так и с профилактической целью.

Особенно важно использование предлагаемого способа для нормализации микробиоценоза у беременных женщин с целью профилактики дисбактериоза у новорожденных и детей 1-го года жизни.

Изобретение относится к микробиологии и касается получения биомассы аутоштамма лактобактерий. Способ предусматривает отбор проб нативного материала. Посев пробы не позднее 2 часов с момента взятия пробы без разведения на селективную питательную среду. Выращивают лактобактерии и выделяют чистую культуру лактобактерий, осуществляя контроль полученной биомассы лактобактерий. Проводят повторный пассаж выделенных лактобактерий. Выращивают полученную чистую культуру лактобактерий в селективной жидкой среде с последующим добавлением консерванта, в качестве которого используют сахарозо-желатиновую среду, в соотношении 1:1 соответственно и контролем полученной жидкой биомассы. Изобретение позволяет получить жидкую биомассу клеток лактобактерий с родственной антигенной структурой к клеткам кишечника потребителя и повысить качество полученной биомассы.

Способ получения биомассы аутоштамма лактобактерий жидкой, предусматривающий отбор пробы нативного материала, посев на селективную питательную среду, выращивание лактобактерий, выделение лактобактерий, их контроль, проведение повторного пассажа, выращивание полученной культуры лактобактерий в селективной питательной среде с последующим добавлением консерванта и контролем полученной биомассы лактобактерий, отличающийся тем, что первоначальный посев в селективную питательную среду производят без разведения нативного материала, не позднее 2 ч с момента взятия пробы, к биомассе лактобактерий добавляют консервант, в качестве которого используют сахарозожелатиновую среду, в соотношении 1:1 соответственно.