ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ (Stephania glabra (Roxb) Miers) ИФР Sg 113 - ПРОДУЦЕНТ СТЕФАРИНА И СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В БИОРЕАКТОРЕ Российский патент 2009 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения стефании гладкой, адаптированной к выращиванию в биореакторе, и предназначено для получения при глубинном культивировании штамма ценных биологически активных соединений, в частности стефарина, и может быть использован в фармацевтической промышленности.

Stephania glabra (Roxb) Miers - растение семейства луносемянниковых. Распространено в субтропических районах Индии, Бирмы, Китая, Вьетнама, Лаоса. Произрастает в районах предгорий и в горах, поднимаясь на высоту до 1800-2000 м над уровнем моря. В местах естественного произрастания в растении содержится до 6% (на сухую массу) алкалоидов. Преобладающие алкалоиды подземной части растения - гиндарин и стефаглабрин, надземной - циклеанин. Гиндарин, стефаглабрин, циклеанин относятся к изохинолиновым алкалоидам. В настоящее время единственным источником получения изохинолиновых алкалоидов в России является культура клеток растения стефании гладкой.

Известен штамм ВСКК-ВР N56 - продуцент стефарина, депонированный во Всероссийской коллекции клеточных культур (Патент РФ №2089610 от 29.03.94 БИ 10.09.97).

Этот штамм - продуцент стефарина, содержание которого достигало 1,0-2,0% от сухой биомассы,

Однако кроме стефарина в этом штамме показано наличие еще четырех неидентифицированных соединений. Штамм культивировали в системе in vitro в колбах на качалке. Описания его культивирования в биореакторе барботажного типа в научно-технической и патентной литературе нет.

Задача изобретения - получение нового штамма культуры клеток стефании гладкой (Stephania glabra (Roxb) Miers) - продуцента стефарина с достаточным содержанием его в биомассе для выделения стефарина и без примесей других алкалоидов, а также создание нового способа его культивирования в биореакторе барботажного типа.

Эта задача решается тем, что созданы новый штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая, Stephania glabra (Roxb) Miers ИФР Sg 113, - продуцент стефарина - и способ его культивирования.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Родословная. Получен методом клеточной селекции из коллекционного штамма Sg 86mf (Осипова Е.А. Вариабельность роста и синтеза стефарина в клоновых популяциях Stephania glabra: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва. 1997. 25 С.)

Причина депонирования - продуцент.

Стандартные условия выращивания - температура 26±1°С, влажность помещения 70%, темнота, жидкая питательная среда. Состав питательной среды (мг/л):

NH₄NO₃ 1700,0±50,0 KNO₃ 1600,0±50,0 KH₂PO₄ 234,0±50,0 CaCl₂ 7·H₂O 64,0±30,0 MgSO₄7·H₂O 850,0±50,0 MnSO₄4·H₂O 22,3±1,0 FeSO₄7·H₂O 27,85±1,0 Трилон Б (ЭДТА) 37,85±1,0 ZnSO₄2·H₂O 8,6±1,0 Н₃ВО₃ 6,2±1,0 KJ 0,83±0,1 Na₂MoO₄ 2·H₂O 0,25±0,1 CuSO₄ 5·H₂O 0,025±0,01 CoCl₂ 6·H₂O 0,025±0,01 Ca-пантотенат 2,0±0,5 Тиамин 2,0±0,5 2,4-дихлорфенокси-   уксусная кислота (2,4-Д) 0,1±0,05 α-нафтилуксусная кислота (НУК) 0,5±0,2 Сахар (рафинад) 50000,0±5000,0

Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях выращивания. Клетки преимущественно округлые, реже вытянутые, суспензия агрегирована.

Культуральные признаки. Биомасса гомогенная, белой или бело-розовой окраски, культуральная жидкость белого или светло-розового цвета.

Способ проверки жизнеспособности штамма. Окрашиванием мертвых клеток 0,5% водным раствором красителя синим Эванса.

Название целевого продукта. Алкалоид стефарин изохинолиновой группы, производное проапорфина. Содержание в ткани при использовании денситометрического метода 0,1-0,5% от сухой массы клеток. Отсутствие алкалоидов гиндарина, циклеанина, пронуциферина.

Физиологические признаки. Нарастание биомассы за цикл выращивания к 14 суткам в 6-8 раз. Жизнеспособность на протяжении цикла субкультивирования сохраняется на уровне 80-90%. Удельная скорость роста в экспоненциальной фазе роста составляет 0,08-0,14 /сут, время удвоения клеток в популяции на 5-8 сутки. Продуктивность клеток по сухой биомассе 0,4-0,9 г/л·сут.

Новизна изобретения заключается в том, что был получен новый штамм ИФР Sg 113, который способен к стабильному биосинтезу стефарина при отсутствии других алкалоидов, в том числе гиндарина, циклеанина и пронуциферина. Кроме того, создан новый способ его культивирования в биореакторе барботажного типа за счет того, что перемешивание проводят путем барботажа при возрастающем расходе воздуха с 0,1 л/л·мин по 1,5 л/л·мин в течение цикла культивирования.

Сущность настоящего изобретения, заключается в том, что получен такой штамм, синтезирующий только стефарин, и в нем отсутствует другие алкалоиды, а именно гиндарин, циклеанин, пронуциферин. Это свойство сохраняется при культивировании в биореакторе барботажного типа.

Изобретение иллюстрируется следующим примером,

Пример. Штамм ИФР Sg 113 получают методом клеточной селекции. Суспензию штамма Sg 86mf смешивают с 1,0%-ным агаром в отношении 1:1 и высевают на чашки Петри с конечной плотностью 3·10⁴ кл/мл. Через 4-6 недель получают колонии, различающиеся по морфофизиологическим признакам. После экстракции из клеток колоний алкалоидов раствором серной кислоты и разделения их на хроматографической пластинке в системе растворителей проводят скрининг относительно стандарта. Отбирают колонии с содержанием стефарина более 0,5% на сухую биомассу. Эти колонии переносят в колбы с жидкой средой. После трех, а затем после девяти пассажей оставляют колонии со стабильным биосинтезом стефарина на уровне не менее 0,1%. Выделенный штамм переносят для культивирования в биореактор.

Полученный штамм культивируют в биореакторе барботажного типа общим объемом 20 л и рабочим объемом 15 л при возрастающем расходе воздуха от 0,1 л/л·мин по 1,5 л/л·мин в течение цикла культивирования, что обеспечивает концентрацию растворенного кислорода в пределах 20-70% от насыщения. Полученный штамм культивируют при температуре 26±1°С, в темноте, на модифицированной среде Мурасиге и Скуга. Состав среды приведен выше. Продолжительность цикла культивирования 14 суток, максимальный выход стефарина на 12-14 сутки.

В результате изобретения получен штамм ИФР Sg 113 со стабильным уровнем содержания стефарина 0,1-0,5% от сухой массы ткани и отсутствием других алкалоидов, в том числе гиндарина, циклеанина, пронуциферина, что является более технологичным для дальнейших операций по выделению стефарина из биомассы. В результате изобретения разработан новый способ культивирования штамма в биореакторе барботажного типа. За цикл культивирования в биореакторе при максимальном содержании стефарина 0,5% от сухой массы клеток получают до 210 г сухой биомассы, то есть до 1005 мг стефарина при отсутствии других алкалоидов, что является достаточным для последующих стадий.

Штамм культивируемых клеток растения стефании гладкой Stephania glabra (Roxb) Miers ИФР Sg 113 получен методом клеточной селекции из коллекционного штамма Stephania glabra Sg 86 mf и депонирован в ВККК ВР под №67. Штамм обладает стабильным уровнем биосинтеза стефарина 0,1-0,5% от сухой массы ткани при условии отсутствия других алкалоидов, что является более технологичным для дальнейших операций по выделению стефарина из биомассы и получения медицинского препарата. Культивируют штамм в биореакторе барботажного типа при перемешивании в темноте, при температуре 25-27°С, влажности 70%. Причем перемешивание проводят путем барботажа при возрастающем расходе воздуха с 0,1 л/л-мин до 1,5 л/л-мин. Это обеспечивает при максимальном содержании стефарина 0,5% от сухой массы ткани получение до 210 г сухой биомассы, то есть до 1005 мг стефарина при отсутствии других алкалоидов. 2 н.п. ф-лы.

1. Штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая Stephania glabra (Roxb) Miers BKKK BP №67 - продуцент стефарина.

2. Способ культивирования штамма по п.1, заключающийся в его культивировании при перемешивании в темноте при температуре (26±1)°С, влажности 70% на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, причем культивирование проводят в биореакторе, а перемешивание проводят путем барботажа при возрастающем расходе воздуха с 0,1 по 1,5 л/(л·мин) в течение цикла культивирования.