ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙЙ STEPHANIA GLABRA (ROXB) MIERS - ПРОДУЦЕНТ СТЕФАРИНА Российский патент 1997 года по МПК C12N5/00 A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию клеток растений стефании гладкой in vitro,и предназначено для получения при глубинном культивировании штамма, ценных биологически активных веществ, в частности алкалоида стефарина, на базе которого создан эффективный препарат, зарегистрированный под названием "стефаглабрин сульфат", уменьшающий трофические расстройства денервированных конечностей, способствующий ранней и более полной регенерации поврежденных нервов, а также обладающий антихолинэстеразным действием.

Стефания гладкая Stephaniaglabra (Roxb) Miess растение семейства луносемянниковых, распространена в субтропических районах Индии, Бирмы, Китая, Вьетнама, Лаоса. В местах естественного произрастания содержит до 6% (на сухую массу) суммы алкалоидов, в том числе стефарина до 0,8% В настоящее время единственным источником получения стефарина является культура ткани растения стефании гладкой, растущая in vitro и депонированная во Всероссийской коллекции клеточных культур как штамм "ВИЛР Sg-6" под номером ВСКК ВР N 28 [1]
Однако, известный штамм ВИЛР Sg-6 не обладает достаточно высокой продуктивностью.

Цель изобретения получение нового продуктивного штамма культуры клеток стефании гладкой с продуктивностью по алкалоиду стефарину до 200 мг/л, превышающей таковую штамма ВИЛР Sg-6.

Такой штамм был получен в результате работы, поведенной в ИФР РАН и НПО "ВИЛАР" РСХА, и депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур под номером ВСКК-ВР N 56.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Родословная получен методом клеточной селекции из исходного штамма ВИЛР Sg-6.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования 60.

Причина депонирования продуцент.

Стандартные условия выращивания температура 26±1^oC, влажность 70% темнота, жидкая питательная среда.

Ниже приведен состав питательной среды.

NH₄NO₃ 1700,0 ± 50,0
KNO₃ 1600,0 ± 50,0
KH₂PO₄ 234,0 ± 50,0
CaCl₂•2H₂O 64,0 ± 50,0
MgSO₄•7H₂O 850,0 ± 50,0
MnSO₄•4H₂O 22,3 ± 1,0
FeSO₄•7H₂O 27,85 ± 1,0
Трилон Б (ЭДТА) 37,85 ± 1,0
ZnSO₄•2H₂O 8,6 ± 1,0
H₃BO₃ 6,2 ± 1,0
KJ 0,83 ± 0,1
Na₂MoO₄•2H₂O 0.25 ± 0,1
CuSO₄•5H₂O 0,025 ± 0,01
CoCl₂•6H₂O 0,025 ± 0,01
Са-пантотенат 2,0 ± 0,5
Тиамин 2,0 ± 0,5
2,4 Д 0,1 ± 0,05
НУК 10,5 ± 0,05
Пищевой сахар 50000 ± 5000
Сосуды для выращивания конические или плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 0,5 л.

Технические данные качалки эллипсоидная траектория движения платформы, амплитуда колебаний 5-7 мм, число оборотов в минуту 100.

Кратность рассева 1:10.

Время субкультивирования 14 дней.

Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях выращивания:
средний размер клеток 67 мкм, с пределами варьирования 42 144 мкм, форма преимущественно округлые, реже вытянутые, суспензия агрегирована.

Ниже приведена агрегированность суспензии стефании гладкой.

Число клеток в агрегате агрегатов
1 0 2
2 5 4 7
6 10 12 13
11 20 27 41
21 50 29 38
Более 50 13 14
Способность к морфогенезу при стандартных условиях выращивания отсутствует.

Название целевого продукта и характеристика его биосинтеза алкалоид изохинолиновой группы стефарин, содержание в ткани при использовании хроматоспектрофотометрического метода 1,0-2,0% от сухой массы, в культуральной жидкости следовые количества.

Способ проверки жизнеспособности штамма нативная окраска 0,5% голубым Эванса.

Физиолого-биохимические признаки динамика нарастания биомассы и накопления алкалоида (табл.1), за цикл выращивания (14 суток) биомасса увеличивается в 8-12 раз и синтезируется стефарина 1,0-2,0 на сухую биомассу, кроме стефарина показано присутствие еще 4-х неидентифицированных соединений.

Новизна изобретения заключается в том, что был получен новый штамм ВСКК-ВР N 56, который имеет продуктивность в два раза выше, чем известный штамм.

Заявленный штамм может использоваться в медицинской промышленности.

Условия получения и использования суспензионной культуры клеток стефании гладкой штамма ВСКК-ВР N 56 приведены в примере.

Пример. Штамм ВСКК-ВР N 56 получают методом клеточной селекции из исходного штамма ВИЛР Sg-6. Суспензию исходного штамма фракционируют путем отстаивания в цилиндре в течение 15 мин, надосадочную фракцию, обогащенную одиночными клетками и мелкими (до 10 клеток) агрегатами, смешивают с 1,0%-ной агарозой в отношении 1:1 и рассеивают на чашки Петри с конечной плотностью 3•10⁴ кл/мл. Через 4-6 недель получают колонии, отличающиеся по морфофизиологическим признакам. В них методом иммуноферментного анализа определяют уровень биосинтеза стефарина и отбирают колонии с содержанием алкалоида более 0,5% от сухой массы. Эти колонии культивируют в чашках Петри в жидкой среде на поверхности субстрата из пенополиуретана в течение 3-4 пассажей до получения 2-2,5 г свежей массы. Затем индивидуальные колонии переносят в колбы с жидкой средой, помещают на качалку для получения суспензионной культуры. Через 2-3 пассажа проверяют содержание стефарина. Далее стабильно растущие клоны проверяют на содержание стефарина через 6, 15, 18 и 24 месяца. В результате выделяют стабильный штамм ВСКК-ВР N 56 -с индексом роста 8-12 и продуктивностью до 360 мг/л стефарина (табл.2).

Приведенные результаты свидетельствуют, что по накоплению биомассы новый штамм равен исходному, но по содержанию стефарина вдвое превышает его.

Полученный штамм выращивают в темноте, при температуре 26^oC, влажности 70% в конических или плоскодонных колбах Эрленмейера на качалке со следующими техническими данными: эллипсоидная траектория движения платформы, амплитуда колебаний 5-7 мм, число оборотов в минуту 100. Состав питательной среды приведен в табл. 1, продолжительность цикла выращивания 14 суток. В этот срок, соответствующий началу стационарной фазы, производят объем биомассы, отделяя ее от культуральной жидкости на фильтре, затем сушат на воздухе, полочной сушилке или в вакуумном сушильном шкафу при температуре не выше 60^oC.

Выделение стефарина проводят по следующей схеме:
сухую биомассу обрабатывают раствором аммиака;
стефарин извлекают толуолом в виде основания:
толуол отгоняют;
сухой остаток растворяют в этиловом спирте и подкисляют серной кислотой;
сульфат стефарина выделяют кристаллизацией. Выход целевого продукта - 50% от расчетного содержания.

Таким образом, использование предлагаемого штамма стефании гладкой ВСКК-ВР N 56 позволяет получать сульфат стефарина биотехнологическим методом. Алкалоидная продуктивность этого штамма более чем в два раза превышает таковую существующего штамма.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм клеток растения стефания Stephania glabra (Roxb) Miers ВСКК-ВР N 56 получен путем клеточной селекции из исходного штамма ВИЛР Sg-6 и характеризуется высокой продуктивностью, до 200 мг/л, по алкалоиду стефарину. 2 табл.

Штамм культивируемых клеток растения Stephania glabra (Roxb) Miers ВСКК-ВР N 56 продуцент стефарина.