ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ ИФР Sg 26127 (STEPHANIA GLABRA (ROXB.) MIERS) В УСЛОВИЯХ IN VITRO - ПРОДУЦЕНТ СТЕФАРИНА Российский патент 2012 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму клеток растения стефании гладкой в условиях in vitro, и предназначено для получения при глубинном культивировании штамма ценных биологически активных соединений, в частности стефарина.

Стефания гладкая (Stephania glabra (Roxb) Miers) - растение семейства луносемянниковых распространено в субтропических районах Индии, Бирмы, Китая, Вьетнама, Лаоса, произрастает в районах предгорий и в горах, поднимаясь на высоту до 1800-2000 м над уровнем моря. В местах естественного произрастания в растении содержится до 6% (на сухую массу) алкалоидов. Преобладающими алкалоидами в подземной части растения являются гиндарин и стефарин, а в наземной - циклеанин (Муравьева Д.А. Фармакогнозия. Москва. Изд-во «Медицина» 1978. С.360-362). Гиндарин, стефарин, циклеанин относятся к изохинолиновым алкалоидам. Гиндарин -производное бензилизохинолина, стефарин - производное проапорфина, циклеанин - производное бисбензилизохинолина. В настоящее время единственным источником получения алкалоидов в России является культура клеток растения стефании гладкой.

Известен штамм растения стефания гладкая ВСКК-ВР №56 - продуцент стефарина, депонированный во Всероссийской коллекции клеточных культур в условиях in vitro (Патент РФ №2089610 от 10.09.97, БИ №25).

Штамм ВСКК-ВР №56 - продуцент стефарина, содержание которого достигает 1,0-2,0% от сухой биомассы. Этот штамм культивируют в условиях in vitro в колбах на качалке.

Однако, кроме стефарина, в штамме ВСКК-ВР №56 определено наличие еще четырех неидентифицированных соединений, а также выход биомассы, по мнению авторов, недостаточно высок.

Известен штамм растения стефания гладкая ИФР Sg 113 в условиях т vitro-продуцент стефарина и способ его культивирования в биореакторе (Патент РФ №2377296 от 27.12.2009, БИ №36).

Штамм ИФР Sg 113 - продуцент стефарина, содержание которого максимально достигает 0,5% от сухой массы ткани при получении до 210 г сухой биомассы за один цикл культивирования, то есть до 1005 мг стефарина с 20 л среды при выращивании в биореакторе при отсутствии других алкалоидов.

Однако, по мнению авторов, продуктивность (мг стефарина на 1 л среды) штамма ИФР Sg 113 недостаточно высока.

Задача настоящего изобретения - создание нового штамма культуры клеток стефании гладкой в условиях in vitro - co стабильным синтезом стефарина с достаточным содержанием его в биомассе без примесей других алкалоидов и более высокой продуктивностью.

Эта задача решается тем, что создан новый штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая ИФР Sg 26127 (Stephania glabra (Roxb) Miers) в условиях in vitro, депонированный в Российской коллекции культивируемых клеток высших растений при учреждении Российской Академии наук Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под номером 69 - продуцент стефарина.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Родословная:

Получен методом клеточной селекции из коллекционного штамма Sg 86mf (Осипова Е.А. Вариабельность роста и синтеза стефарина в клоновых популяциях Stephania glabra: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва. 1997. 25 С.).

Причина депонирования - продуцент.

Стандартные условия выращивания: температура 26±1°С, влажность помещения 70%, темнота, жидкая питательная среда.

Разработан новый состав среды (описан выше).

Культуральные признаки:

Биомасса гомогенная, бело-кремовой окраски, культуральная жидкость светло-коричневого или коричневого цвета.

Описание цитологических наблюдений при стандартных условиях выращивания. Клетки преимущественно округлые, реже вытянутые. Суспензия агрегирована.

Способ проверки жизнеспособности штамма:

Окрашиванием мертвых клеток 0,5% водным раствором красителя синим Эванса.

Название целевого продукта:

Алкалоид стефарин изохинолиновой группы, производное проапорфина. Содержание в ткани при использовании денситометрического метода 0,5-0,8% от сухой биомассы. Отсутствие алкалоидов гиндарина, циклеанина, пронуциферина. Физиологические признаки:

Нарастание биомассы за цикл выращивания к 14 суткам в 10-12 раз. Жизнеспособность на протяжении цикла субкультивирования сохраняется на уровне 80-90%. Удельная скорость роста в экспоненциальной фазе роста составляет 0,30-0,35 / сут, время удвоения клеток в популяции на 2-3 сутки.

Сущность настоящего изобретения состоит в том, что снижение количества 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислоты в среде приводит к повышению ростовых показателей и увеличению содержания стефарина, а значит к увеличению выхода продукта.

Новизна изобретения заключается в том, что был получен новый штамм ИФР Sg 26127 в условиях in vitro, отличающейся от ранее используемой, снижением 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислоты. Этот штамм способен к стабильному биосинтезу стефарина при отсутствии других алкалоидов, в том числе гиндарина, циклеанина и пронуциферина.

Штамм ИФР Sg 26127 получают методом клеточной селекции. Суспензию штамма Sg 86mf (Осипова Е.А. Вариабельность роста и синтеза стефарина в клоновых популяциях Stephania glabra: Автореф. дисс.канд. биол. наук. Москва. 1997. 25 С.) смешивают с 1,0%-ным агаром в отношении 1:1 и высевают на чашки Петри с конечной плотностью 3·10⁴ кл./мл. Через 4-6 недель получают колонии, различающиеся по морфофизиологическим признакам. После экстракции из клеток колоний алкалоидов раствором серной кислоты и разделения их на хроматографической пластинке в системе растворителей проводят скрининг относительно стандарта. Отбирают колонии с содержанием стефарина более 0,5% на сухую биомассу. Эти колонии переносят в колбы с жидкой средой. После трех, а затем после девяти пассажей оставляют колонии со стабильным содержанием стефарина на уровне не менее 0,1%.

Полученный штамм культивируют при температуре 26±1°С, в темноте на заявляемой модифицированной среде Мурасиге и Скуга следующего состава:

NH₄NO₃ 1650-1750 KNO₃ 1550-1650 KH₂PO₄ 184-284 CaCl₂·7H₂O 94-124 MgSO4·7H₂O 800-900 MnSO₄·4H₂O 21-24 FeSO₄·7H₂O 26-29 Трилон Б 39-40 ZnSO₄·2H₂O 8-10 Н₃ВО₃ 5-8 KI 0,7-1,0 Na₂MoO₄·2H₂O 0,1-0,4 CuSO₄·5Н₂О 0,01-0,04 CoCl₂·6H₂O 0,01-0,04 Ca-пантотенат 1-3 Тиамин 1-3 2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота 0,001-0,009 α-нафтилуксусная кислота 0,5±0,2 Сахар (рафинад) 50000,0±5000,0 Дистиллированная вода до 1 л среды.

Продолжительность цикла культивирования 14 суток. Отделение биомассы от культуральной жидкости, сушку и получение сульфата стефарина проводят по стандартной методике (Патент РФ N 2089610 от 10.09.97, БИ №25).

В результате настоящего изобретения получен новый штамм ИФР Sg 26127 в условиях in vitro с более высокой продуктивностью при стабильным уровне содержания стефарина 0,5-0,8% от сухой массы ткани при условии отсутствия других алкалоидов, в том числе гиндарина, циклеанина, пронуциферина, что является более технологичным для дальнейших операций по выделению стефарина из биомассы и получения медицинского препарата. За цикл культивирования в колбах с 1 литра среды при максимальном содержании стефарина до 0,8% от сухой массы получают до 22 г сухой биомассы, то есть до 176 мг стефарина при отсутствии других алкалоидов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму продуценту стефарина. Штамм культивируемых в условиях in vitro клеток растения стефания гладкая (Stephania glabra (Roxb.) Miers) ИФР Sg 26127 депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений (ВККК-ВР) под номером №69. Изобретение обеспечивает стабильный синтез стефарина с достаточным содержанием его в биомассе без примесей других алкалоидов и более высокой продуктивностью.

Штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая ИФР Sg 26127 (Stephania glabra (Roxb.) Miers) в условиях in vitro, депонированный в Российской коллекции культивируемых клеток высших растений при учреждении Российской Академии наук Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под номером 69 - продуцент стефарина.