СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕФАРИНА СУЛЬФАТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ Российский патент 2010 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.

Стефарина сульфат - сульфат изохинолинового проапорфинового алкалоида стефарина, выделенного из стефании гладкой [Stephania glabra (Roxb.) Miers], сем. лукосемянниковых (Menispermaceae) - многолетнего тропического травянистого растения. Это растение произрастает в субтропических и тропических горных районах Южного Китая, Японии, Бирмы, Вьетнама, Индии. В СССР были предприняты попытки интродукции данного растения в субтропиках Закавказья, однако они успеха не имели.

Стефарина сульфат имеет формулу (C₁₈H₁₉NO₃)₂·H₂SO₄

Представляет собой белый кристаллический порошок, с температурой плавления (247-252)°C с разложением, растворим в воде и водном спирте. Является субстанцией лекарственного средства, названного стефаглабрина сульфатом (Stephaglabrini sulfas).

Известно использование стефаглабрина сульфата (0,25% водный раствор) в медицинской практике в качестве антихолиноэстеразного средства, (авторское свидетельство СССР №315388, 1963 г.).

Известно, что стефаглабрин сульфат обладает специфической ингибирующей активностью на развитие соединительной ткани, предотвращая образование рубца при повреждении нерва, и может быть применен в качестве средства для лечения травматических и послеоперационных повреждений периферической нервной системы (патент СССР №1713151, 1985 г.).

В мире многие лекарственные средства, ароматические вещества, пищевые добавки и другие ценные вещества получают из природного растительного сырья. Около 30% всех применяемых лекарств содержат вещества специализированного обмена растений - вторичные метаболиты.

Их получают обычно экстракцией из растений, большинство которых относятся к экзотическим и исчезающим видам, произрастающим в труднодоступных районах с нерегулируемой климатической, экологической и даже политической обстановкой, не гарантирующей стабильной поставки и качества сырья. Плантационный способ выращивания растений, очевидно, не устраняет некоторых природных неблагоприятных условий и вместе с тем требует больших земельных площадей особого характера с возможным альтернативным использованием. В результате этот способ часто оказывается нерентабельным, а получаемое сырье, как правило, содержит ряд вредных примесей - гербицидов, пестицидов, радионуклеидов и других загрязнителей.

Так, известен способ получения стефаглабрина из растительного сырья, включающий экстракцию корневищ растения стефания гладкая ксилолом в щелочной среде, дальнейшую обработку серной кислотой, растворение осадка в спирте, добавление соляной кислоты, извлечение целевого продукта хлороформом с последующим добавлением серной кислоты и кристаллизацией (Авторское свидетельство СССР №315387, 1977 г.). Один из основных недостатков этого способа состоит в дефиците исходного сырья.

Недостатки известных способов получения биологически активных соединений экстракцией из растительного сырья устраняются при получении их из биомассы клеток растений путем выращивания клеток растений в культуре.

В культуру вводят клетки из различных органов растения: корня, листа, черенка, стебля, цветоноса и т.д. Доказана способность культур растительных клеток к синтезу веществ, присущих интактному растению, при этом некоторые растительные клетки продуцируют их в количествах даже больших, чем материнское растение. Поэтому культуры клеток растений представляют интерес как источник получения различных веществ для фармацевтической, парфюмерно-косметической, пищевой и химической промышленностей.

Этот альтернативный способ получения ценных веществ растительного происхождения имеет следующие преимущества:

- гарантированное получение растительного материала в требуемом количестве с заданными характеристиками независимо от сезона, климатических и погодных условий;

- практически абсолютная экологическая чистота производства биомассы культуры клеток и отсутствие в ней поллютантов;

- более короткие сроки накопления биоматериала, которые в культуре составляют несколько недель, а в природе - до 10 лет, при этом содержание целевых веществ в культуре клеток может быть не ниже, чем в растении;

- возможность синтеза в культуре клеток новых веществ, не образуемых в растениях в природных условиях;

- возможность использования для получения культур клеток индустриальных биотехнологических приемов и оборудования вместо существующих методов сбора дикорастущих растений или плантационного выращивания их с большими затратами труда.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая, описанный в патенте РФ №2089610, 1997 г. Согласно указанному способу, клетки выращивают в глубинной суспензии при перемешивании в темноте, при температуре 24-26°C на питательной среде.

Продолжительность цикла выращивания составляет 14 суток. В этот срок, соответствующий началу стационарной фазы, отделяют выращенную биомассу клеток от культуральной жидкости фильтрацией в вакууме и высушивают до постоянного веса при температуре 50°C.

Выделение стефарина из биомассы клеток осуществляют следующим образом: обрабатывают высушенную и измельченную биомассу раствором аммиака, извлекают неоднократно толуолом стефарин в виде основания, отгоняют толуол, растворяют сухой остаток в спиртовом растворе серной кислоты. Сульфат стефарина выделяют кристаллизацией.

Основным недостатком известного способа является низкий выход целевого продукта, обусловленный низким уровнем синтеза стефарина - ниже 0,2% по отношению к сухой биомассе. Кроме того, более 50% стефарина теряется на последующих стадиях, причем тем больше, чем ниже его содержание в биомассе.

Значительная часть потерь приходится на многочисленные стадии его выделения из различных твердых и жидких сред. Так, толуольное извлечение стефарина осуществляют в несколько стадий. На первой из них извлекают стефарин толуолом из подщелоченной биомассы. На втором этапе стефарин извлекают из водно-щелочного раствора, полученного после экстракции стефарина из первого толуольного извлечения раствором серной кислоты и последующим подщелачиванием. Полученный экстракт является рафинатом при экстракции стефарина водным раствором кислоты. Последний, в свою очередь, после подщелачивания используется как рафинат для получения толуольного экстракта стефарина.

Технической задачей настоящего изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Для этого в способе получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая, включающем глубинное культивирование клеток стефании гладкой на жидкой питательной среде при перемешивании и аэрации воздухом в темноте в конце экспоненциальной фазы роста культуры, в питательную среду вводят метиловый эфир жасмоновой кислоты и олеиновую кислоту.

При этом метиловый эфир жасмоновой кислоты вводят в питательную среду до конечной концентрации 0,05-0,15 мМ.

При этом олеиновую кислоту вводят в питательную среду в количестве 5-20% к объему питательной среды.

Глубинное культивирование клеток стефании гладкой осуществляют на жидкой питательной среде следующего состава, мг/л:

Макросоли:   аммоний азотнокислый 1700 калий азотнокислый 1800 калий фосфорнокислый однозамещенный 234 кальций хлористый 64 магний сернокислый 7-водный 850 Микроэлементы:   калий йодистый 0,83 кобальт двухлористый 6-водный 0,025 борная кислота 6,2 марганец сернокислый 4-водный 22,3 медь сернокислая 5-водная 0,025 натрий молибденовокислый 2-водный 0,25 цинк сернокислый 7-водный 8,5 Хелат железа:   железо сернокислое 7-водное 27,8 этилендиаминтетраацетат натрия 3,73 Регуляторы роста:   кислота α-нафтилуксусная 0,5 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,1 пантотенат кальция 2 тиамина хлорид 2 источники углерода:   пищевой сахар 50·10³

Технический результат предложенного способа обусловлен тем, что культивирование проводят при введении в культуру на определенной стадии ее развития веществ, стимулирующих биосинтез целевого продукта - стефарина и экстрагирующих стефарин из клеток в момент его образования, и тем самым препятствующих его последующим преобразованиям в побочные продукты, а кроме того, исключающих избыточное пенообразование среды при ее аэрации.

Положительный эффект метиловый эфир жасмоновой кислоты на биосинтез вторичных метаболитов (шиконин, паклитаксел, гликозиды женьшеня) наблюдали для некоторых культур клеток при оптимальных, специфических для каждой культуры условиях культивирования (концентрация метиловый эфир жасмоновой кислоты, момент его введения в культуру и общая длительность культивирования). Таких данных с культурой клеток стефании гладкой - продуцента стефарина до сих пор не имелось. По наблюдениям авторов, в культуре этих клеток в шейкерных колбах при введении в питательную среду метилового эфира жасмоновой кислоты в конечной концентрации 0,1 мМ на экспоненциальной фазе роста (7, 8, 9 сутки) происходит увеличение биосинтеза стефарина на всем дальнейшем периоде культивирования вплоть до 14 суток. Максимальное увеличение выхода стефарина в 1,6 раз по сравнению с культивированием без метилового эфира жасмоновой кислоты получено при добавке стимулятора к концу экспоненциальной фазы роста клеток (9 суток). К сожалению, при введении в питательную среду метилового эфира жасмоновой кислоты происходит обильное пенообразование.

Как показали исследования авторов, в это же время (8 или 9 суток от начала культивирования) необходимо ввести в культуру вещества, способные экстрагировать образующийся в массовом количестве стефарин, уменьшить его дальнейший метаболизм в нецелевые продукты и в то же время предотвратить обильное пенообразование, вызываемое метиловым эфиром жасмоновой кислоты. Таким веществом, экстрагирующим стефарин из культуры клеток стефании гладкой и не допускающем обильного пенообразования в этой культуре клеток при введении в нее метилового эфира жасмоновой кислоты, является, по наблюдению авторов, органический растворитель - олеиновая кислота. Ее требуемое количество составляет от 5 до 20% к объему питательной среды.

Таким образом, с целью увеличения выхода стефарина в культуре клеток стефании гладкой предлагается способ, при котором культивирование клеток осуществляют при сочетанном введении в культуру веществ, стимулирующих биосинтез стефарина, экстрагирующих его из клеток в момент образования и исключающих пенообразование в культуре. Веществом-стимулятором является метиловый эфир жасмоновой кислоты (метилжасмонат) или жасмоновая кислота и ее другие эфиры, обладающие свойствами стимулировать в клетках биосинтез целевого продукта без существенного отрицательного влияния на рост клеток. Количество и момент введения метилжасмоната в культуру определяются свойствами его и культуры и составляют 0,05-0,15 (лучше 0,1) мМ/л и 8-9 суток, соответственно. Веществом - экстрагентом и пеногасителем одновременно является органический растворитель - олеиновая кислота. Ее вводят в то же время, что и вещество-стимулятор (метилжасмонат). Количество вводимой олеиновой кислоты - от 5 до 20% (лучше 10%) к объему питательной среды.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки стефании гладкой культивируют обычным способом в биореакторах при перемешивании и аэрации воздухом (в шейкерных колбах или ферментаторах различной емкости, в зависимости от масштаба работы). Биореакторы со стерильной питательной средой вышеописанного состава засевают посевной культурой, выращиваемой при постоянном 2-недельном пассировании в соотношении, как пример, один объем культуры на 10 объемов свежей питательной среды.

Устанавливают принятый режим культивирования: температура (26±1)°C, отсутствие освещения, интенсивность перемешивания и аэрации - в соответствии с типом и объемом биореактора. На 8-9 сутки роста в культуральную жидкость, находящуюся в биореакторе, вводят с соблюдением правил асептики 0,1 М раствор метилжасмоната в этиловом спирте из расчета 1 мл раствора на 1 л культуры. Тем самым создается требуемая (конечная) концентрация метилжасмоната в среде около 0,1 мМ. В это же время в нее вводят асептически олеиновую кислоту в количестве 5-20% к объему культуры. Предварительно олеиновую кислоту насыщают питательной средой, выдерживая их вместе в течение около суток, затем олеиновую кислоту автоклавируют при температуре и времени экспозиции, как принято для стерилизации питательной среды. По окончании цикла культивирования олеиновую кислоту, содержащую стефарин, отделяют от водной культуральной суспензии. Стефарин выделяют из олеиновой кислоты, как и из других органических растворителей (ксилол, хлороформ, толуол).

Следующие примеры иллюстрируют предложенный способ, не ограничивая его по существу.

Пример 1.

Клетки растения стефания гладкая культивировали в колбах вместимостью 750 мл, встряхиваемых на орбитальном шейкере при 150 об/мин, в каждой из которых содержалось по 150 мл питательной среды, инокулированной 15 мл суспензии клеток предыдущего пассажа. В некоторые колбы вносили по 0,15 мл 0,1 М раствора метилжасмоната в этаноле на 7 или 8 или 9 сутки культивирования и культивировали до 14 суток. Конечная концентрация метилжасмоната в культуральной жидкости составляла 0,1 мМ/л. По частям колбы изымали из процесса на 10, 12 и 14 сутки культивирования и определяли в них количество биомассы и содержание в последней стефарина. Полученные данные о выходе стефарина представлены в таблице (выборочно).

Время внесения метилжасмоната, сутки Общее время культивирования, сутки Содержание стефарина в сухой биомассе, % Выход стефарина, мг/колба - 12 0,37 9,8 7 12 0,56 7,4 8 12 0,50 9,4 9 12 0,48 9,5 - 14 0,37 11,4 7 14 0,66 14,0 8 14 0,78 16,7 9 14 0,66 18,2

Из представленных данных следует, что наибольший объемный выход стефарина имеет место с введением метилжасмоната на 8-9 сутки при общей продолжительности культивирования 14 суток. По сравнению с контролем выход увеличивается в 1,5-1,6 раза.

Пример 2.

Суспензию клеток растения стефания гладкая культивировали в ферментаторе БИОР-01 (изготовитель - ОКБ г.Кириши). В стерильный аппарат со стерильной средой (55 л), выведенный на заданный температурный режим (26±1)°C, внесли инокулят, в качестве которого использовали клетки, выращиваемые в конических колбах емкостью 750 мл (объем заполнения 200 мл) при встряхивании на шейкере (150 об/мин) в темноте при 26±1°C в течение 2-х недель. Объем инокулята - 15 л клеточной суспензии (вместе с равным объемом добавленной свежей питательной среды), что соответствует посевной дозе 30 г/л сырой биомассы.

Включали необходимые перемешивание и аэрацию и начинали процесс культивирования с постепенным увеличением расхода воздуха через барботер (от 0,06 до 1,2 м³/ч) за время культивирования с начала до конца (2 недели). На 9 сутки культивирования ввели в аппарат через пробоотборник 70 мл 0,1 М раствора метилжасмоната в этаноле. Процесс культивирования закончили досрочно на 13 сутки из-за избыточного ценообразования и нарушения работы выхлопной линии. Содержание стефарина в высушенной биомассе клеток оказалось равным 0,35%.

Пример 3.

Суспензию клеток растения стефания гладкая культивировали в ферментаторе БИОР-01 в условиях, идентичных описанным выше, но без введения метилжасмоната. Содержание стефарина в сухой биомассе клеток, полученной в 10 циклах периодического культивирования, не превышало 0,25%.

Пример 4.

Суспензию клеток растения стефания гладкая культивировали в колбах и в ферментаторе БИОР-01 в условиях, описанных в опытах 1 и 3, соответственно, но с введением на 9 сутки, кроме метилжасмоната, олеиновой кислоты в количестве 10% от объема питательной среды. После двухнедельного культивирования олеиновую кислоты отделяли от культуральной суспензии и определяли в ней содержание стефарина в расчете на единицу объема культуры. В этом случае объемное удельное содержание стефарина в культуре оказалось выше, чем в опытах без метилжасмоната и/или без олеиновой кислоты.

Клетки растения стефания гладкая культивируют на жидкой питательной среде при перемешивании и аэрации воздухом в темноте. Добавление в питательную среду в конце экспоненциальной фазы роста культуры метилового эфира жасмоновой кислоты и олеиновой кислоты повышает выход стефарина сульфата, который является субстанцией для получения медицинского препарата стефаглабрина сульфата. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая, включающий глубинное культивирование клеток стефании гладкой на жидкой питательной среде при перемешивании и аэрации воздухом в темноте и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в конце экспоненциальной фазы роста культуры в питательную среду вводят метиловый эфир жасмоновой кислоты и олеиновую кислоту.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что метиловый эфир жасмоновой кислоты вводят в питательную среду до конечной концентрации 0,05-0,15 мМ.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что олеиновую кислоту вводят в питательную среду в количестве 5-20% к объему питательной среды.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что глубинное культивирование клеток стефании гладкой осуществляют на жидкой питательной среде следующего состава, мг/л:
макросоли:
аммоний азотно-кислый 1700 калий азотно-кислый 1800 калий фосфорно-кислый однозамещенный 234 кальций хлористый 64 магний серно-кислый 7-водный 850