Изобретение относится к биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности и может быть использована для получения диагностикумов, бйореактивов и яекарствённых средств.
Mevjicago sativa - люцерна посевная,
многолетняя трава, произрастающая на
территорий Советского Союза. Удельная пе-роксидазная активность в 15-20 раз
активности корней хрена,
Цель изобретения - получение штамма клеток Medlcago sativa. продуцирующ его пероксидазу.
Данный штамм получен на кафедре Клёточной физиологии и иммунологии МГУ и депонирован во Всесоюзной коллекции клеток высших растений Института физиологии. растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под номером 23.
История получения штамма.
Источником получения штамма слуткияи листья стерильных зеленых 30 дневных растений. Первичный каллус образовался на агаризованной среде Гамборга В-5, Содержащей фитогормоны, мг/л: 2,4 Д 8: НУК 0,5; кинетин 8. Культивирование листовых эксплантов проводили при постоянном освещении интенсивностью 2000 лк в чашках/ Петри диаметром 10 см, содержащей 25 мл среды. В каждую чашку Петри помещали по 6 листовых пластинок нижней стороной в среду. Через 30 сут после эксплантации с целью получения суспензионной культуры первичные каллусы перенобили в жидкую среду с фйтогормонами всоставе, мг/л: 2,4 Д 0,1: НУК 0,5; кинетин 0,1. Для этого 400 мг каллусной ткани помещали в колбы объёмом 500 мл, содержащей 20 мл среды и культивировали ее на качалке при 140 об/мин в т ление 14 сут. После этого 20 мл суспензии переносили в колбы объемом 1 л, содержащей 100-150 мл среды. Суспензию в этих условиях пассировали в течение 5 циклов выращивания.
Далее в ИФР АН СССР в 1985 г. суспбН зия была переведена на среду Мурасиге и Скуга с витаминаКчи по Стаба и фитогормонами, мг/л: 2,4 Д1; кинетин 0,1.
Культуральные свойства штамма. Характер роста: суспензия желтоватого оттенка, индекс роста по сырой и сухой биомассе 10-15, по числу клеток 30-36, число живых клеток 60-80%.
Суспензия выращивается в течение 96 пассажей в режиме накопительного культивирования в жидкой среде, мг/л: NH4N031650
KN031900
CaCl2 2Н20440
MgS04 7И20370
КН2Р04170.
НзВОз6,2
MnS04 4Н2022,3
ZnS04-74208,6
Kl0,83
Na2Mo04 -2420a;25
CuS04 5H200,25
CoCl2 -64200,25
FeS04 6H20.27,8
N32 ЭДТА37, 3 Витамины no Стаба: фолиевая кислота 0,5; рибофлавин 0,5; биотии 1,0; Са-пантотенат 1,0: пиридоксин 1,0: тиамин 1.0; амид никотиновой кислоты 2,0; цианокобаламин 0,0015.
. Кинетин 0,1. 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота1,0
.Гидролизат казеина500
Сахароза30000
Температура 26±1%, влажность 67±3%, темнота колбы на 1 л с 100 мл питательной среды на качалке 80-98 об/мин, радиус вращения 18-20 с. Продолжительность цикла выращивания 13-15 дней, исходная плотность засева 0,8-2,0 г сухой массы на 1 л или 1 -10 клеток/мл, кратность рассева 1/7-1/10.
Цитологическая характеристика. Суспензия клеток люцерны состоит из меристематических (размером 4,8-9.5 мкм) и паренхимных (11,4-28,5 мкм) клеток. Процентное соотношение агрегатов в экспоненциаль ую фазу роста: 2-5 клеток 20-30%, 10 клеток 30-35%, 10 клеток 37-38%, отдельные пэренхимные клетки 2-4%.
Кариологическая характеристика.
Распределение клеток по числу хромосом, %: п - 17;2п-26; Зп-19;4п- 11; 4п-21.
Способы хранения.,
Метод пересевов - цикл выращивания в жидкой среде 13-15 дней, замораживание в жидком азоте - условия подготовки, состав среды обычный, возраст культуры 6-7 дней, криопротектор ДМСО в конечной концентрации 7%, замораживание проводилось по ступенчатой программе, оттаивание в водяной бане при 40°С, промывание материала питательной средой и высев с максимальной плотностью на поверхность агаризованной среды, процент живых клеток сразу после оттаивания и промывания 20-30%.
Характеристика биосинтеза пероксидазы в клетках люцерны.
Активность пероксидазы, измеренная спектрофотометрически по гваяколу, в цикле выращивания возрастает, выявляя значительную активность в фазу деградации клеток (22-30 сут). Оптимум активности в
клетках и в среде при рН 5,5. Активность в клетках достигает 300 ед.ОП/мг-сух.м-мин, при расчете на 1 мл среды активность в клетках колеблется в разные циклы выращивания в фазу деградации в пределах
1200-2200 ед.ОП/мл-мин. а в среде 400800 ед.ОП/мл-мин.
Анаксия в течение 24-36 ч приводит к увеличению активности в 2-3 раза, однако стабильность фермента при этом падает.
Изучение физико-химических характеристик показало, что основным компонентом пероксидрзы клеток люцерны является изофермент С (р1 8,9; 9,2; 9.3), который выделен в гомогенном состоянии двойной
ионообменной хроматографией на КМ-сефацеле. Выход изофермента С составляет 0,25-0,30 мг/г сухих клеток. Изоферментный состав (молекулярный вес, RZ, Kd, Kin) изофермента С пероксидазы люцерны близки по свойствам изоферменту С пероксидазы хрена.
Пример конкретного выполнения.
Штамм люцерны культивируют на среде
указанного выше состава при 26°С в темноте. В постстацйонарную фазу роста (21-26 сут) биомассу клеток отделяют от жидкой среды фильтрованием под вакуумом. 300 г сырой биомассы прои ывают 500 мл 5 мМ К-фосфатного буфера рН 7.0 и разрушают на гомогенизаторе при CKOpOQTH 15 тыс.об/мин в течение 5 мин при 4°С, осадок отделяют центрифугированием (20 мин, 14 тыс.об/мин,
4°С). Раствор декантируют от осадка, осадок суспендируют в 500 мл 1 М раствора КС1 в течение 30 мин, затем отделяют центрифугированием. Гомогенат диализуют против 5-кратного избытка 5 мМ ацетатного буфера рН 6,0 в течение 14 ч. Далее раствор наносят на колонку (2,6x2 см), уравновешенную 5 мМ ацетатным буфером со скоростью 15 мл/ч. Адсорбировавшиеся на колонке белки элюируют линейным градиентом исходного буфера рН
6,0, собирая фракции в интервале 180200 мМ. Рехроматографию проводят в анаогичных условиях. После рехроматографии исследовали изоферментный состав различных фракций, определяли молекулярную массу фермента методом электрофореза и гель-фильтрации, изучали термоактивацию фермента при 50 и 65°С. В таблице представлены данные, позвол$(ющие сравнить свойства пероксидазы хрена (коммерческий препарат) и полученный препарат щелочной изоформы пероксидазы люцерны.
Сравнительный анализ нового препарата с коммерческим препаратом пероксидазы хрена показывает, что культура клеток люцерны может быть использована в качестве альтернативного источника коммерческой пероксидазы с более широкой сферой его применения.
Формула изобретения
Штамм Medlcago satlva L ВеКК(ВР) №23-продуцент пероксидазы.
Изобретение относится к биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения диагностикумов. биореакторов и лекарственных средств. Целью изобретения является получение штамма клеток Medlcago satiya, продуцирующего перокси- дазу. Данный штамм получен и депонирован во Всесоюзной коллекции клеток высших растений ИФР АН СССР под номером 23 и обладает высокой продуцирующей пероксидазу способностью. 1 табл.
