СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО АЛЛЕРГЕНА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A61K39/85 C12R1/44 

Изобретение относится к микробиологии, аллергологии и биотехнологии и предназначено для получения безальбумозного нативного аллергена для аллергической диагностики стафилококкоза у животных.

Известные способы получения нативных и очищенных аллергенов для аллергической диагностики туберкулеза, бруцеллеза, стафилококкоза, туляремии и т.д. предусматривают выращивание микроорганизмов на мясогидролизатных или синтетических питательных средах, концентрацию растворимых токсино-аллергенов трихлоруксусной кислотой, переосаждение сернокислым аммонием, спиртом или использование нативных препаратов для постановки внутрикожных или офтальмо проб.

Согласно существующему определению понятия «аллергены» - это антигены, стимулирующие гиперчувствительность, аллергию. При этом аллергические антитела (реагины - IgE) и сенсибилизированные лимфоциты не образуют с антигеном-аллергеном комплексов, а фиксируются в коже, слизистой и при попадании аллергена при внутрикожной пробе, ингаляции, офтальмопробе его фиксируют, вызывая патологический процесс, очаг, из которого выделяется гистамин, происходит расширение капилляров и образование гиперемии - аллергическая реакция. Специфичность аллергической реакции во многом зависит от качества аллергена (Федосова В.Н. Бактериальные и аллерговакцины в лечении аллергических заболеваний. Биопрепараты. 2006. №4. С.16-19).

За прототип взят способ получения стафилококкового аллергена из фильтратов 5-6 дневных мясопептонных бульонных культур стафилококков путем осаждения трихлоруксусной кислотой и спиртом для постановки внутрикожных проб в объеме 0,1 мл (Трилолитова А.А. Аллергены стафилококковые и стрептококковые. Бактериальные и вирусные препараты. Изд-во Томского университета. 1971. С.166-177).

Недостатком способа является использование для выращивания стафилококков бульона гидролизата мяса по Хоттингеру, концентрация, очистка аллергена трихлоруксусной кислотой и спиртом. Наличие в питательной среде балластных веществ мяса способствуют сенсибилизации организма и появлению аллергической реакции на бульон, а применение трихлоруксусной кислоты и спирта для концентрации и очистки аллергена приводит к изменению исходной, нативной конфигурации аллергена.

Целью предлагаемого изобретения является повышение качества аллергена путем замены мясного бульона на синтетическую питательную среду, обеспечивающую стабильное высокое накопление стафилококков и содержание молекулярных продуктов биосинтеза и деструкции стафилококков, позволяющих исключить использование трихлоруксусной кислоты и спирта для концентрации и очистки аллергена.

Поставленная цель достигается использованием синтетической питательной среды, содержащей в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты - 8,0; аспарагина - 1,0; хлористого натрия - 7,0; сернокислого цинка - 0,2; сернокислого магния - 0,4; сернокислого железа - 0,2; фосфорно-кислого калия 2-зам. - 3,0; глицерина - 40 мл с последующим установлением реакции среды до 7,7±0,1 - 5-10% раствором аммиака перед автоклавированием, для выращивания стафилококков в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным одному литру, в течение 10-12 суток до накопления 10±2,0 млрд/мл микроорганизмов, стерилизацией при 1,0 атм в течение 30 минут, отделением фильтрацией бакмассы от культуральной жидкости и доведением концентрации растворимых аллергеноактивных веществ до 1,0±0,2 мг/мл путем прибавления дистиллированной воды, расфасовкой препарата по флаконам и стерилизацией при 1,0 атм в течение 20 минут.

Стафилококковый аллерген при внутрикожном введении крупному рогатому скоту, больному гнойно-катаральным маститом, в объеме 0,2 мл в среднюю треть шеи вызывал утолщение кожной складки через 48-72 часов в пределах 3-7 мл, а у собак, больных дерматитами при внутрикожном введении аллергена в объеме 0,1 мл во внутреннюю поверхность тазовой конечности, вызывал гиперемию кожи более 10 мм в диаметре при учете реакции через 24 и 48 часов.

Биологическую активность и контроль нативного стафилококкового аллергена проводили на разработанной биологической модели путем сенсибилизации морских свинок и беспородных собак подкожным введением суспензии автоклавированных стафилококков (3-5 млрд/мл), сорбированных на гидроксиде алюминия в объеме 0,5-1,0 мл.

У сенсибилизированных морских свинок на внутрикожное введение 0,1 мл стафилококкового аллергена в депилированные боковые поверхности появлялась гиперемия кожи диаметром 10±2,0 мм.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому, с использованием синтетической питательной среды заявляемого состава.

Применение синтетической питательной среды для выращивания стафилококков и получения нативного стафилококкового аллергена необходимой активности без использования трихлоруксусной кислоты для концентрации аллергена позволяет достичь получения стабильного по составу и биологической активности стафилококкового аллергена, свободного от балластных веществ мяса и воздействия химической денатурации препарата трихлоруксусной кислотой.

Максимальное накопление стафилококков на синтетической среде свыше 10,0 млрд/мл и стерилизация при 1,0 атм в течение 30 минут обеспечивает концентрацию молекулярных продуктов биосинтеза и деструкцию микроорганизмов до 1,2 мг/мл в культуральном фильтрате, позволяет исключить концентрацию аллергеноактивных веществ трихлоруксусной кислотой и спиртом и определить технологический режим промышленного производства специфического диагностического препарата.

Предлагаемое изобретение для наглядности иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения стафилококкового аллергена

Стафилококковый аллерген получен выращиванием стафилококков в течение 12 суток на синтетической питательной среде, содержащей в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты - 8,0; аспарагина - 1,0; хлористого натрия - 7,0; сернокислого цинка - 0,2; сернокислого магния - 0,4; сернокислого железа - 0,2; фосфорно-кислого калия 2-зам. - 3,0; глицерина - 40 мл с последующим установлением реакции среды до 7,7±0,1 - 5-10% раствором аммиака перед автоклавированием, в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным 1,0 литру, до 10±2,0 млрд/мл взвеси микроорганизмов, последующей стерилизацией при 1,0 атм в течение 30 минут, отделением фильтрацией биомассы и определением содержания растворимых аллергеноактивных веществ в 1 мл фильтрата и доведением дистиллированной водой до 1,2 мг/мл протеина, расфасовкой препарата по флаконам для стерилизации при 1,0 атм в течение 20 минут.

Пример 2. Испытание стафилококкового аллергена на сесибилизированных морских свинках в разведении 1:10 и 1:100.

Стафилококковый аллерген ввели внутрикожно по 0,1 мл в депилированные боковые поверхности 8 морским свинкам. При учете реакции через 24 часа средние размеры гиперемии кожи на внутрикожное введение стафилококкового аллергена в разведении 1:10 составили 12±2,0 мм, а на разведение аллергена 1:100 диаметр гиперемии в среднем составил 9±1,0 мм.

Пример 3. Испытание стафилококкового аллергена на курах, больных стафилококкозом.

В исследовании использовано 46 голов кур, больных стафилококкозом. Стафилококковый аллерген в цельном виде вводили в бородку. У всех кур отмечено увеличение в 1,5-2 раза бородки через 24-36 часов после введения аллергена.

Пример 4. Испытание аллергенной активности стафилококкового аллергена на беспородных собаках, сенсибилизированных суспензией убитых стафилококков, и собаках, больных дерматитом.

В исследовании использовано 9 голов беспородных собак в возрасте 6-12 месяцев, сенсибилизированных убитыми стафилококками, и 18 голов собак, больных дерматитами с разными формами течения. Стафилококковый аллерген вводили внутрикожно в цельном виде (1 мг/мл протеина) по 0,1 мл в среднюю треть шеи и во внутреннюю поверхность тазовых конечностей.

При учете реакции через 48 и 72 часов гиперемия кожи у обеих групп животных в среднем составила 12±2,0 мм.

Изобретение касается создания безопасного безальбумозного стафилококкового аллергена. Способ получения стафилококкового аллергена включает выращивание стафилококков на синтетической среде, содержащей в г на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты - 8,0, аспарагина - 1,0, хлористого натрия - 7,0, сернокислого цинка - 0,2, сернокислого магния - 0,4, сернокислого железа - 0,2, фосфорнокислого калия 2-замещенного - 3,0, глицерина - 40 мл с последующим установлением реакции среды до 7,7±0,1 - 5-10% раствором аммиака перед автоклавированием в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 л, в течение 10-12 суток до 10,0±2,0 млрд/мл взвеси микроорганизмов. Далее культуральную жидкость стерилизуют при 1,0 атм в течение 30 минут, отделяют фильтрацией культуральную жидкость от бактериальной массы. Способ предусматривает использование растворимых аллергеноактивных соединений без использования трихлоруксусной кислоты. Полученный препарат используется в качестве нативного аллергена с содержанием до 1,0±0,2 мг/мл протеина для внутрикожной аллергической диагностики стафилококкоза животных.

Способ получения стафилококкового аллергена путем использования растворимых продуктов биосинтеза и водно-термической деструкции стафилококков, отличающийся тем, что выращивание стафилококков проводят на жидкой синтетической среде, содержащей на 1 л дистиллированной воды, г: лимонной кислоты - 8,0, аспарагина - 1,0, хлористого натрия - 7,0, сернокислого цинка - 0,2, сернокислого магния - 0,4, сернокислого железа - 0,2, фосфорнокислого калия 2-замещенного - 3,0, глицерина - 40 мл, с последующим установлением реакции среды до 7,7±0,1 5-10%-ным раствором аммиака перед автоклавированием в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 л, в течение 10-12 суток до (10,0±2,0) млрд/мл взвеси микроорганизмов, стерилизацией при 1,0 атм в течение 30 мин, отделением фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы и доведением концентрации растворимых аллергеноактивных субстанций до (1,0±0,2) мг/мл протеина добавлением дистиллированной воды.