СИНТЕТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к конструированию синтетических сред для выращивания микобактерий туберкулеза разных видов, Pseudomonas molleo, синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, стафилококков, сальмонелл, Е. coli, протея и т.д. а также пробиотических микроорганизмов.

По своему происхождению питательные среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные), искусственные с использованием универсального источника азота и углерода - пептонов, полученных путем неполного расщепления белков с помощью ферментов (пепсина, трипсина) - это различные гидролизаты: рыбные, казеиновые, мясные, дрожжевые - и синтетические питательные среды, приготовленные из сбалансированных химических компонентов (Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб., 1998. - С.78-79).

В то же время при изготовлении стафилококковой, колисальмонеллезной анатоксинвакцин, маллеина для целей гуманной и ветеринарной медицины выращивание микроорганизмов производится на средах с использованием мясопептонно-картофельного бульона или гидрализатов мяса, рыбы, казеина, отличающихся нестабильностью состава, неравномерностью роста и содержанием балластных веществ в препаратах.

Известные синтетические питательные среды Курской биофабрики (питательные среды Евглевского №1 и №2) используются для выращивания микобактерий туберкулеза разных видов при изготовлении диагностических аллергенов (Евглевскнй А.А. Экспериментальное обоснование и практические аспекты диагностики и профилактики инфекционных и аллергических болезней животных. Автореф. дис. … докт. вет. наук, Ленветинститут, 1990. - С.8-9).

Однако указанные синтетические среды универсальностью не обладают. А содержание сернокислого цинка 0,1 г/л не всегда обеспечивает поверхностное выращивание микобактерий туберкулеза. Известные среды имеют также в своем составе дефицитный цитрат аммония.

Практически выращивание микобактерий туберкулеза проводится с использованием синтетических сред для получения туберкулезного аллергена - туберкулина ППД вместо МПКГБ. Синтетические среды не содержат балластные вещества мяса, казеина, пептона, и впервые были использованы для получения ППД-туберкулина (F.Seibert в 1934 г., М.А.Линниковой в 1939 г., А.А.Евглевским в 1963 г.)

Известная синтетическая питательная среда для выращивания микобактерий туберкулеза (патент №2139345, 10.10.1999, автор А.А.Евглевский) включает, мас.%: лимонную кислоту 6,0±2,0; аспарагин 7,5±1,5; цитрат аммония 3,0±1,0; сернокислый магний 0,75±0,15; сернокислое железо 0,075±0,015; сернокислый цинк 0,15±0,075; двухзамещенный фосфорно-кислый калий 7,5±1,5; глицерин - остальное.

Однако указанная синтетическая среда пригодна для выращивания только микобактерий туберкулеза, то есть не обладает универсальностью, пригодностью для выращивания ряда других патогенных и пробиотических микроорганизмов при изготовлении биопрепаратов.

Целью предлагаемого изобретения является повышение питательных свойств синтетической среды, пригодной для стабильного роста и максимального накопления ряда патогенных и пробиотических микроорганизмов.

Поставленная цель достигается путем увеличения содержания лимонной кислоты до 9-11 г/л, сернокислого цинка до 0,5 г/л, дополнительным внесением янтарной кислоты 3,0 г/л, фосфорнокислого натрия 2-х замещенного 1,5 г/л, глицина 1,0 г/л, хлористого натрия 0,5 г/л, снижением содержания дорогостоящего аспарагина до 2-4 г/л и полным изъятием дефицитного цитрата аммония.

Разработанная синтетическая среда содержит химические ингредиенты в следующем соотношении, в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонная кислота 9,0-11,0; аспарагин - 2,0-4,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 6,0; сернокислый цинк - 0,5; сернокислый магний - 0,7; сернокислое железо - 0,1; хлористый натрий - 0,5; фосфорнокислый натрий двухзамещенный - 1,5; глицин - 1,0; янтарная кислота - 3,0 и глицерин 40-50 мл.

Реакция среды устанавливается 5-10% раствором аммиака до рН 7,0-7,1 перед автоклавированием, а для выращивания стафилококков до рН 7,5-7,6 с увеличением хлористого натрия до 5-6 г/л.

Введение лимонной и янтарной кислот (ди-, трикарбоновые кислоты цикла Кребса) способствует повышению обмена веществ у микроорганизмов, улучшению растворимости химических ингредиентов и образованию цитрата аммония при нейтрализации лимонной кислоты 5-10% раствором аммиака. Образование цитрата аммония как азотистого соединения, необходимого для построения белковых молекул микроорганизмов, способствует улучшению обмена веществ и росту микробной биомассы. Введение в состав питательной среды глицина в сочетании с аспарагином (амид аспарагиновой кислоты) улучшает биосинтез белковых структур микроорганизмов, а хлористый натрий и фосфорнокислый натрий двухзамещенный повышают буферность среды, способствуют сохранению рН среды при длительном выращивании микобактерий туберкулеза и стафилококков.

Предлагаемый состав среды отличается от прототипа и аналогов качественным и количественным соотношением ингредиентов и обеспечивает накопление отжатой убитой бакмассы микобактерий туберкулеза до 130±10,0 г/л после 60-суточного выращивания, микробных тел сальмонелл и Е. coli после 2-3-суточного инкубирования до 70±10,0 млрд/мл, стафилококков после 10-12-суточного выращивания до 13±1,0 млрд/мл, пробиотиков после 2-3-суточного выращивания 70-90 млрд/мл. Таким образом, заявляемая универсальная синтетическая среда отвечает условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Синтетическая питательная среда, обеспечивающая стабильно высокое накопление микроорганизмов с последующим получением из них туберкулина ППД, туберкулезного анатоксина, маллеина, колибактериозной, колисальмонеллезной, стафилококковой анатоксин-вакцин и т.д., отвечает условию патентоспособности «промышленная применимость».

Синтетическую среду для выращивания микроорганизмов получали путем последовательного растворения в дистиллированной воде ингредиентов или растворения их с предварительным смешиванием компонентов в сухом виде в соотношении, г/л: лимонная кислота 10,0; аспарагин 3,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный 6,0; сернокислый цинк 0,5; сернокислый магний 0,7; сернокислое железо 0,1; хлористый натрий 0,5; фосфорнокислый натрий двухзамещенный 1,5; глицин 1,0; янтарная кислота 3,0; глицерин 50 мл - и последующей нейтрализацией среды 5-10% раствором аммиака и доведения объема жидкой среды добавлением дистиллированной воды до 1 литра.

Для выращивания стафилококков в составе синтетической среды содержание хлористого натрия довели до 5 г/л при сохранении вышеуказанного соотношения всех остальных компонентов, и рН среды до 7,5 в связи с особенностями физиологии этого вида микроорганизмов.

При приготовлении плотной основы синтетическую среду разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1 и добавляют 2,5% агара с последующей стерилизацией при 100°С в течение 30-60 минут и расфасовкой в пробирки, чашки Петри для уплотнения и дальнейшего использования для выращивания микроорганизмов.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение питательной ценности синтетической питательной среды при выращивании микобактерий туберкулеза.

В исследованиях использованы лабораторно-производственный штамм №8 микобактерий туберкулеза и свежевыделенные микроорганизмы.

Посев микроорганизмов проводили с помощью платиновой петли (спирали) на поверхность жидкой синтетической среды. В процессе инкубирования через 20-30 суток происходило полное покрытие пленкой микобактерий туберкулеза всей поверхности среды диаметром до 0,5-0,7 см, а через 60 суток утолщение пленки достигало 1,0 см и более. После автоклавирования выращенных микобактерий туберкулеза с последующим отжатием бакмассы через несколько слоев марли и высушиванием проводили взвешивание.

В среднем постоянное накопление полувлажной (отжатой через несколько слоев марли) бакмассы микобактерий туберкулеза составляло 120-130 г/л, а сухой - 12-13 г/л.

Пример 2. Выращивание микобактерий туберкулеза на плотной агаровой среде.

В синтетическую среду заявленного состава, а также при разведении ее дистиллированной водой 1:1 добавляли 2,5% агара, стерилизовали при 100°С в течение 30-60 минут, расфасовывали в пробирки и выращивали микобактерии туберкулеза. Рост микобактерий туберкулеза в пробирках с агаром происходит через 7-10 суток после посева микроорганизмов, как в варианте с заявленной концентрацией синтетической питательной среды, так и при ее разбавлении дистиллированной водой 1:1. Таким образом, при приготовлении плотной среды с добавлением агара приготовленную жидкую синтетическую среду разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1.

Пример 3. Испытание эффективности роста стафилококков, сальмонелл и кишечной палочки (Е. coli) на универсальной жидкой синтетической среде и на ее минеральной основе в заявленной концентрации и в разведении дистиллированной водой 1:1 с 2,5% агаром.

Концентрация стафилококков после 12±2,0 дневного выращивания в двухлитровых биобутылях с объемом среды, равной 1,0 литру, составляет 12±1,0 млрд./мл микробных клеток, а сальмонелл и кишечной палочки после 2-3 дневного инкубирования - 70±10,0 млрд/мл при сплошном прорастании колониями микроорганизмов агаровой поверхности пробирок на минеральной основе. При выращивании микроорганизмов на плотной агаровой среде жидкую минеральную основу предварительно разбавляют наполовину дистиллированной водой. Снижение концентрации в сочетании с 2,5% агаром не влияет на рост упомянутых микроорганизмов.

Приведенные примеры подтвердили пригодность питательной среды в предлагаемых вариантах для выращивания не только микобактерий туберкулеза, но и других патогенных микроорганизмов: сальмонелл, кишечной палочки, синегнойной палочки, протея, а также пробиотических микроорганизмов, то есть ее универсальность. Для выращивания стафилококков в составе среды увеличивают содержание хлористого натрия до 5-6 г/л и рН до 7,5-7,6 в соответствии с физиологическими требованиями этого вида микроорганизмов.

Результаты накопления бактериальной массы при выращивании микроорганизмов на заявленной питательной синтетической среде приведены в таблице.

Таблица Накопление бактериальной массы при выращивании микроорганизмов на синтетической питательной среде. № п/п Наименование микроорганизмов Сроки выращивания Накопление (концентрация) микроорганизмов 1. Микобактерии туберкулеза (бычьего вида) 30 суток 60 г автоклавированной и отжатой бакмассы 60 суток 120 г автоклавированной и отжатой бакмассы 2. Стафилококки (золотистый) 7 суток 7-8 млрд/мл     12 суток 12±1,0 млрд/мл 3. Сальмонеллы 2-3 суток 70±10 млрд/мл 4. Кишечная палочка 2-3 суток 70±10 млрд/мл 5. Синегнойная палочка 2-3 суток Густая слизеподобная       масса 6. Сенная палочка - Bacillus 2-3 суток Густая слизеподобная   subtil is   масса 7. Лактобактерии 2-3 суток Густая слизеподобная масса

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения синтетических питательных сред для выращивания микроорганизмов. Синтетическая питательная среда для выращивания микроорганизмов содержит лимонную кислоту, аспарагин, фосфорнокислый калий двухзамещенный, сернокислый цинк, сернокислый магний, сернокислое железо, хлористый натрий, фосфорнокислый натрий двухзамещенный, глицин, янтарную кислоту, глицерин, дистиллированную воду и при необходимости агар при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить питательные свойства синтетических питательных сред. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Синтетическая питательная среда для выращивания микроорганизмов, включающая лимонную кислоту, аспарагин, фосфорнокислый калий двухзамещенный, сернокислый цинк, сернокислый магний, сернокислое железо, глицерин, отличающаяся тем, что дополнительно содержит янтарную кислоту, глицин, фосфорнокислый натрий двухзамещенный, хлористый натрий и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:
лимонная кислота 9,0-11,0 аспарагин 2,0-4,0 фосфорнокислый калий двухзамещенный 6,0 сернокислый цинк 0,5 сернокислый магний 0,7 сернокислое железо 0,1 хлористый натрий 0,5 фосфорнокислый натрий двухзамещенный 1,5 глицин 1,0 янтарная кислота 3,0 глицерин 40-50 мл дистиллированная вода остальное

2. Синтетическая питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что в разведении с дистиллированной водой 1:1 дополнительно содержит 2,5% агара.