СПОСОБ СОЗДАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ АЛЛЕРГИИ К СТАФИЛОКОККОВОМУ АЛЛЕРГЕНУ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 C12N1/20 C12R1/44 

Изобретение относится к иммунологии и аллергологии, в частности к моделированию аллергии при стафилококкозе, и может быть использовано для определения аллергенной активности, контроля, стандартизации стафилококкового аллергена, изучения процессов аллергических реакций.

В существующих способах определение активности аллергенов проводят на сенсибилизированных животных по содержанию белка-аллергена и с помощью серологических реакций.

Наиболее стабильно выраженная аллергия проявляется у животных и людей, больных туберкулезом, или после введения вакцины БЦЖ, убитых микобактерий. Это происходит, в основном, из-за повышенного содержания гликолипидов, воска и т.д. в микобактериях, создающих «бронированную» защиту от лекарственных средств, и депонирования в местах введения микроорганизмов или проявления патологического процесса.

Поэтому, из-за отсутствия демонстративно выраженной аллергии при отдельных инфекционных болезнях, в том числе и при стафилококкозе, проводят аллергизацию лабораторных животных с полным или неполным адъювантом Фрейнда, содержащим убитые микобактерий во взвеси с жидким парафином и ланолином (Бырдаров С. В. Экспериментальная микробиология. - М., София. - 1965. С.112-113). В этих случаях это будет сочетанное проявление аллергии на два инфекционных патогена, и кожные реакции на соответствующие аллергены будут недостоверными.

Объективные показатели кожных реакций на моноаллерген могут быть получены на животных, сенсибилизированных видовым микроорганизмом, адекватным инфекционной болезни.

С учетом того, что в патогенезе инфекционных болезней человека и животных аллергия в различной степени выраженности участвует как обязательный компонент, были проведены исследования по обеспечению аллергизации морских свинок суспензией из автоклавированных стафилококков без дополнительных компонентов полного и неполного адъюванта Фрейнда.

За прототип взяли способ сенсибилизации в подушечки лапок морских свинок цельными микробными клетками стафилококков, убитых нагреванием в концентрации 5 млрд клеток в 1 мл, с неполным адъювантом Фрейнда (Фрадкин В.А. Диагностика и лечебные аллергены. - М.: Медицина, 1990. - С.10-11; Беклемишев Н.Д., Шамсудинова Г.С., Суходоева Г.С.Сравнительная оценка диагностической эффективности стафилококковых аллергенов //Аллергология и клиническая иммунология. - Алма-Ата, 1985. - С.26-31).

Недостатком известного способа является дополнительное использование взвеси убитых микобактерий туберкулеза в ланолине, жидком парафине адъюванта Фрейнда вместе с микробными клетками стафилококков для введения суспензии микроорганизмов в подушечки лапок морских свинок с обезболиванием мест введения 0,2% раствором новокаина. Присутствие туберкулезных аллергенов не дает объективной картины аллергизации на стафилококковые аллергены. Кроме того, ланолин и парафин, присутствующие в адъюванте Фрейнда, вызывают в местах введения суспензии образование гнойных абсцессов.

Для устранения указанных недостатков предлагается использование для аллергизации морских свинок взвеси 5,0-10,0 млрд/мл инактивированных нагреванием стафилококков, сорбированных на гидроксиде алюминия 3-5 мг/мл без компонентов адъюванта Фрейнда, вызывающих образование гнойных абсцессов и гибель животных.

Целью предлагаемого изобретения является создание у морских свинок безопасным способом стабильно выраженной аллергии для контроля, стандартизации стафилококкового аллергена и изучения процесса проявления аллергии.

Поставленная цель достигается сенсибилизацией морских свинок взвесью 5,0-10,0 млрд/мл микробных клеток стафилококков, инактивированных автоклавированием с последующей детоксикацией 0,2% раствором формалина при 42°С в течение 5-7 суток, сорбированных на гидроксиде алюминия 3-5 мг/мл, путем подкожного введения в объеме 0,5-1,0 мл.

Подкожное введение морским свинкам обезвреженных описанным способом стафилококков обеспечивает стабильно выраженную чувствительность у животных к стафилококковому аллергену в течение 4-5 месяцев и позволяет получить положительный эффект - снижение токсичности аллергизирующей суспензии, достоверность моделирования аллергии именно на стафилококковый аллерген, исключить образование гнойных абсцессов у животных.

Пример 1. Получение суспензии стафилококков для сенсибилизации морских свинок.

Стафилококки выращивались на жидкой синтетической питательной среде, содержащей в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты - 8,0; аспарагина - 1,0; хлористого натрия - 7,0; сернокислого цинка - 0,2; сернокислого магния - 0,4; сернокислого железа - 0,2; фосфорнокислого калия 2-зам. - 3,0; глицерина - 40 мл с последующим установлением реакции среды до 7,2 - 5%-ным раствором аммиака в 200,0 мл флаконах с объемом среды, равной 100,0 мл, в течение 5 суток до концентрации 5 млрд/мл микробных клеток. Их подвергли автоклавированию при 1,0 атм в течение 30 минут с последующим прибавлением формалина до 0,2% концентрации для детоксикации токсинов при 42°С в течение 5 суток, а затем в качестве адъюванта-депонента вносили гидроксид алюминия из расчета 3 мг/мл суспензии.

Пример 2. Испытание сенсибилизирующей суспензии стафилококков на безвредность на белых мышах и здоровых морских свинках.

Подкожное однократное введение 0,1 мл суспензии шести белым мышам и 1,0 мл шести морским свинкам не вызвало беспокойства, гибели животных и образования на месте введения гнойных абсцессов при наблюдении в течение 10-12 суток.

Пример 3. Моделирование аллергии на стафилококковый аллерген.

Морские свинки массой 350-400 г в количестве 14 голов были сенсибилизированы подкожным однократным введением суспензии убитых стафилококков, приготовленных описанным способом, в объеме 1,0 мл. Периодически через 30, 60, 90, 120, 150 суток животным вводили в депилированные боковые поверхности кожи стафилококковый аллерген в разведении 1:10, 1:20, 1:40 по 0,1 мл. Гиперемия кожи через 24 часа составляла в диаметре 11,0±1,0; 9,0±1,0 и 8,0±1,0 мм соответственно разведениям. При введении стафилококкового аллергена через 150 суток после сенсибилизации морских свинок отмечено уменьшение диаметров гиперемии кожи на 1,0-1,5 мм.

Пример 4. Изучение срока хранения аллергизирующей суспензии из стафилококков.

Суспензия стафилококков 5-10 млрд/мл, выдержанная в 0,2% растворе формалина, после сорбции на гидроксиде алюминия при рН 7,0±0,2 расфасовывалась в пенициллиновые флаконы и подвергалась автоклавированию при 1,0 атм в течение 20 минут.

По истечении шести и двенадцати месяцев сенсибилизирующие свойства суспензии для морских свинок не изменились.

Таким образом, созданная безопасным способом модель аллергии позволяет изучать активность стафилококкового аллергена в течение длительного времени по стабильно выраженной кожной реакции морских свинок.

Изобретение может быть использовано для определения аллергенной активности, контроля, стандартизации стафилококкового аллергена, изучения процессов аллергических реакций. Способ создания биологической модели аллергии к стафилококковому аллергену включает сенсибилизацию морских свинок суспензией стафилококков 5,0-10,0 млрд/мл, инактивированных автоклавированием с последующей детоксикацией 0,2% раствором формалина и сорбированных на гидроксиде алюминия 3-5 мг/мл. Полученную указанным способом суспензию однократного подкожно вводят морским свинкам в объеме 0,5-1,0 мл на одно животное. Аллергическую реакцию вызывают внутрикожным введением 0,1 мл стафилококкового аллергена в разведении 1:10, 1:20 и 1:40. Учет результатов реакции проводят по гиперемии кожи через 24 часа. Изобретение обеспечивает создание у лабораторных животных стабильно выраженной аллергии.

Способ создания биологической модели аллергии к стафилококковому аллергену, включающий сенсибилизацию морских свинок суспензией убитых стафилококков с последующим введением аллергена, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят 5,0-10,0 млрд/мл взвесью инактивированных стафилококков с 0,2%-ным раствором формалина, сорбированных на гидроксиде алюминия 3-5 мг/мл, путем однократного подкожного введения в объеме 0,5-1,0 мл на одно животное с последующим внутрикожным введением 0,1 мл стафилококкового аллергена в разведении 1:10, 1:20 и 1:40 и учетом реакции по гиперемии кожи через 24 ч.