СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2010 года по МПК C12N15/08 A61K35/14 A61K39/04 A61P31/06 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических противотуберкулезных цитотоксических клеток.

В основе патогенеза туберкулеза лежит нарушение взаимодействия иммунокомпетентных клеток в результате длительного персистирования микобактерий внутри антиген-презентирующих клеток. Стандартное лечение туберкулеза основано на применении антибиотиков, подавляющих развитие микобактерий на различных этапах их жизненного цикла. Лекарственная химиотерапия часто приводит к развитию лекарственно-устойчивых штаммов возбудителей инфекции и поэтому становится неэффективной, кроме того, обладает выраженным гепатотоксическим действием. В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Эффективный иммунный ответ на М. tuberculosis связан с индукцией клеточного звена иммунного ответа, который в данном случае реализуется посредством Т-хелперов 1 типа. Активность Т-хелперов 1 типа напрямую зависит от представления им антигена и их направленной дифференцировки, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами. Дендритные клетки (ДК) усиливают врожденный иммунитет, регулируют развитие специфического иммунного ответа, обеспечивают развитие иммунологической толерантности. В настоящее время активно исследуется возможность применения дендритных клеток для модуляции специфического иммунного ответа и развития новых методов иммунокоррекции. Это связано, прежде всего, с той ролью, которую ДК играют в организме в развитии иммунного ответа, в частности, дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивным Т-клеткам, определяя направленность и активность иммунных реакций. Кроме того, в эксперименте in vitro показано, что ДК, полученные из моноцитов, не поддерживают внутриклеточную репликацию вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv, в отличие от макрофагов, полученных из тех же самых моноцитов, благодаря снижению доступа микобактериальных вакуолей к циркулирущим эндосомам и ограничению доступа питательных веществ (Tailleux L, Neyrolles О, Honore-Bouakline S, Perret E, Sanchez F, Abastado JP, Lagrange PH, Gluckman JC, Rosenzwajg М, Herrmann JL. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells//J Immunol. - 2003. - V.15, №170(4). - P.1939-48).

Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных туберкулезом путем культивирования в полной среде с добавлением гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в течение 4 дней. Затем полученные незрелые дендритные клетки в течение последующих 4 суток культивировались совместно с аутологичными Т-клетками в присутствии липидных антигенов М. tuberculosis. Была показана стимуляция пролиферативной активности Т-клеток и увеличение количества ИФН-γ -продуцирующих клеток в ответ на липидные антигены М. tuberculosis (Ulrichs Т, Moody DB, Grant E, Kaufmann SH, Porcelli SA. T-cell responses to CD 1-presented lipid antigens in humans with Mycobacterium tuberculosis infection // Infect Immun. - 2003. - Vol.71, №6. - p.3076-87).

Интерлейкин-18 (ИЛ-18) - провоспалительный цитокин, который стимулирует продукцию ИФН-γ Т- и НК-клетками, тем самым способствуя активации макрофагов и уничтожению инфицированных микобактериями клеток. Однако у пациентов, больных туберкулезом, наблюдается значительное снижение продукции ИЛ-18 и ИФН-γ М. tuberculosis-стимулированными мононуклеарными клетками in vitro. Добавление в культуру антител к ИЛ-18, приводящее к связыванию эндогенного цитокина, резко снижает М. tuberculosis-индуцированную продукцию ИФН-γ, что говорит о роли ИЛ-18 в синтезе ИФН-γ. Рекомбинантный человеческий ИЛ-18 (рчИЛ-18) в дозе 10 нг/мл стимулирует М. tuberculosis-индуцированную секрецию ИФН-γ у больных туберкулезом. Добавление рчИЛ-18 при совместном культивировании зрелых антиген-активированных ДК и МНК необходимо для стимуляции и поддержания направленной дифференцировки наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа.

Задачей настоящего изобретения является создание способа генерации антиген-специфических цитотоксических клеток из периферической крови больных туберкулезом.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в совместном культивировании неприлипающей фракции МНК, выделенных из периферической крови больных туберкулезом с обработанными антигеном M. tuberculosis дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Причем для культивирования берутся зрелые ДК, полученные добавлением к антиген-активированным незрелым ДК индуктора созревания, например, липополисахарида E. coli, а совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.

Техническим результатом изобретения является активация антиген-специфических иммунных реакций по Т-хелпер 1 типу на антиген М. tuberculosis с помощью цитотоксических ИФН-γ-продуцирующих клеток, полученных при сокультивировании мононуклеарных клеток периферической крови больных туберкулезом легких с аутологичными антигенпрезентирующими дендритными клетками и интерлейкином-18 in vitro.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенные из периферической крови пациентов больных туберкулезом мононуклеарные клетки прилипающей фракции культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO₂ при 37°С с добавлением ГМ-КСФ (50 нг/мл) и ИЛ-4 (200 нг/мл). Через 24 часа культивирования к полученным незрелым ДК добавляется специфический антиген M. tuberculosis ESAT-6 в дозе 3 мкг/мл, а еще через 2 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится липополисахарид Е. coli (штамм 055:В5, Sigma) в дозе 5 мкг/мл.

Полученные дендритные клетки культивируются с мононуклеарными клетками неприлипшей фракции в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-18 в дозе 40 нг/мл.

Для определения эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа с помощью полученных ДК оценивали пролиферативную активность МНК, предварительно культивированных с антиген-активированными ДК, в ответ на специфический антиген M. tuberculosis ESAT-6 (табл.1).

Таблица 1
Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом легких, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16). Группы Спонтанный пролиферативный ответ, имп/мин ESAT-6-стимулированный пролиферативный ответ, имп/мин МНК 1003,818±215,35 1345,303±273,93 МНК+рчИЛ-18 1360,939±279,11 1833,758±310,69 МНК+ДК(без антигена) 2846,37±434,325 2987,148±549,88 МНК+ДК(с антигеном) 3041,424±619,85** 3014,758±553,83** МНК+ДК(с антигеном)+рчИЛ-18 3344,242±610,76* 3100,515±563,14* Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18
МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6
МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6
МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген M.tuberculosis ESAT-6 с добавлением рчИЛ-18.
**- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
*- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+рчИЛ-18

Кроме того, для тестирования активации Т-хелперов 1 типа оценивали количество клеток, продуцирующих ИФН-γ, с помощью технологии ELISpot и уровень продукции ИФН-γ в кондиционных средах от клеточных культур МНК в ответ на антиген ESAT-6 с помощью иммуноферментного анализа (табл.2).

Таблица 2
Продукция ИФН-γ МНК пациентов, больных туберкулезом легких, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16).   Количество ИФН-γ-продуцирующих клеток (на 100 тыс. МНК) Содержание ИФН-γ в кондиционных средах МНК, пг/мл   Спонтанное ESAT-6 Спонтанное ESAT-6 МНК 36±3 64±7 13±3 139±49 MHK+IL-18 45±41 119±23 58±35 187±99 МНК+ДК(без антигена) 82±11 102±6 100±78 383±140 МНК+ДК(с антигеном) 84±11** 163±35** 718±318** 882±376** МНК+ДК(с антигеном)+IЕ-18 114±13* 266±39*(#) 728±364* 1257±469*(#) Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18
МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген М tuberculosis ESAT-6
МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6
МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 с добавлением рчИЛ-18.
**- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
*- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой MHK+IL-18
# - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК

Для исследования потенциальной цитотоксической активности мы определяли экспрессию молекул перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с антиген-активированными ДК в ответ на специфический антиген ESAT-6. Перфорин - фактор цитотоксичности, мономерный белок, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране, что приводит к лизису инфицированных клеток. Показано достоверное повышение количества перфорин-позитивных клеток, что служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения М. tuberculosis (табл.3).

Таблица 3
Уровень экспрессии внутриклеточного белка перфорина мононуклеарными клетками больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=8). Группы Спонтанная экспрессия перфорина (% позитивных клеток) ESAT-6-стимулированная экспрессия перфорина (% позитивных клеток) МНК 12,056±1,234 15,114±1,660 МНК+рчИЛ-18 20,484±2,90** 19,695±3,065 МНК+ДК(без антигена) 23,233±3,040 21,194±0,954 МНК+ДК(с антигеном) 23,243±2,996** 28,571±3,628** МНК+ДК(с антигеном)+рчИЛ-18 31,391±6,788* 35,678±6,841*(#) Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18
МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6
МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6
МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 с добавлением рчИЛ-18.
** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
* - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой MHK+IL-18
# - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК

Совместное культивирование ДК и МНК больных туберкулезом легких является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции уровня продукции ИФН-γ и формировании цитотоксических клеток, экспрессирующих перфорин в ответ на специфический антиген М. tuberculosis. Использование рекомбинантного человеческого ИЛ-18 для усиления индукции ответа Т-хелперов 1 типа статистически достоверно увеличивает цитокинпродуцирующий и цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток in vitro. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-18 in vitro. Такой способ генерации дендритных и противотуберкулезных цитотоксических клеток не только снижает время и затраты на их получение, но и максимально отражает процесс дифференцировки клеток in vivo.

Способ по изобретению предусматривает совместное культивирование неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), которые выделяют из периферической крови пациентов больных туберкулезом легких, с обработанными антигеном Mycobacterium tuberculosis дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, при этом используют зрелые ДК. Зрелые ДК получают добавлением к антиген-активированным незрелым ДК индуктора созревания, представляющего собой липополисахарид Е. coli. Совместное культивирование указанных клеток проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 (IL-18). Способ по изобретению обеспечивает усиление пролиферативного потенциала специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, стимуляцию уровня продукции ИФН-γ, формирование цитотоксических клеток в ответ на специфический антиген М. tuberculosis. 3 табл.

Способ генерации антиген-специфических клеток с противотуберкулезной активностью, заключающийся в совместном культивировании неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больных туберкулезом, с обработанными антигеном Mycobacterium tuberculosis дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, отличающийся тем, что для совместного культивирования берут зрелые ДК, полученные добавлением к антиген-активированным незрелым ДК индуктора созревания липополисахарида E.coli, а совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 (ИЛ-18).