КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2010 года по МПК A61K9/06 A61N5/00 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно касается фармакологической композиции для флуоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) с использованием просенсибилизатора - гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК).

Метод ФДТ основан на применении фотосенсибилизаторов, обладающих свойствами селективно накапливаться в патологических, в частности онкологических, тканях и при воздействии лазерного излучения в присутствии кислорода вызывать фотохимические реакции, приводящие к избирательному разрушению опухолевых клеток.

Введение в организм АЛК индуцирует в нем повышенный уровень флуоресцирующего протопорфирина IX (PpIX) - первого порфирина в цепи биосинтеза всех природных порфиринов. Из-за нехватки в раковых клетках фермента феррохелатазы содержание PpIX в них спустя 3-4 часа после введения в организм АЛК в несколько раз выше по сравнению со здоровой тканью. В итоге, освещая ткань светом на длине волны 630 нм, по наличию голубого свечения можно установить наличие раковой ткани.

В настоящее время наиболее хорошо разработаны методы диагностики с использованием флуоресценции PpIX злокачественных опухолей бронхов, пищеварительного тракта, мочевого пузыря и поверхностных кожных опухолей. В последнем случае наиболее часто применяют АЛК в виде растворов. Однако для наружного применения гораздо более удобны более вязкие выпускные формы. В литературе описан ряд содержащих АЛК составов для наружного применения, которые можно рассматривать как аналоги настоящего изобретения, - различные мази, кремы, лосьоны. Условно все эти составы можно поделить на содержащие в составе воду и неводные. Недостатками последних, в частности липосомальных, являются сложность состава и изготовления [Casas A., Fukuda Н., DiVenosa G., Del A.M., Batlle С. - The influence of the vehicle on the synthesis of porphyrins after topical application of 5-aminolaevulinic acid. Implications in cutaneous photodynamic sensitization - Br. J. Dermat. 2000, 143, 564-572], [Pierre M.B.R., Tedesco A.C., Marchetti J.M., Bentley M.V.L.B. - Stratum corneum lipids liposomes for the topical delivery of 5-aminolevulinic acid in photodynamic therapy of skin cancer: preparation and in vitro permeation study http://www.biomedcentral.com/1471-5945/1/5 BMC Dermatology 2001, 1:5], а также низкая стабильность при хранении. Так, содержание АЛК в липосомальной форме через месяц хранения составляет 30-60% от начального уровня [Auner B.G., Petzenhauser Е., Valenta С.- Influence of 6-ketocholestanol on skin permeation of 5-aminolevulinic acid and evaluation of chemical stability - J. Pharm. Sci. 2004, 93, 2780-2787], в неводной гелевой форме через 200 дней хранения при 5°С - менее 45% [McCarron Р.А., Donnelly R.F., Andrews G.P., Woolfson A.D. - Stability of 5-aminolevulinic acid in novel non-aqueous gel and patch-type systems intended for topical application - J. Pharm. Sci. (2005) Vol.94, No.8, pages 1756-1771].

Известны составы АЛК в виде водных лосьонов [US Patent 6,559,183 (2003) «Nano-emulsion of 5-aminolevulinic acid»] и кремов [US Patent 6,034,267 (2000)], US Patent 7,247,655 (2007)], однако стабильность их также невысока. Примерами могут служить крем и лосьон, в которых уже через месяц хранения при 4°С остается не более 50% и 75% от начального содержания АЛК соответственно [Auner B.G., Petzenhauser Е., Valenta С. - Influence of 6-ketocholestanol on skin permeation of 5-aminolevulinic acid and evaluation of chemical stability - J. Pharm. Sci. 2004, 93, 2780-2787].

Более близки к нашей композиции по составу гелевые формы АЛК, содержащие в качестве компонента среды воду. Известен двухфазный гель, приготовляемый на основе воды и моноолеата глицерина в соотношении 30: 70 по массе [Turchiello F., Vena F.C.B., Maillard Ph., Souza C.S., Bentley M.V.L.B., Tedesco A.C. - Cubic phase gel as a drug delivery system for topical application of 5-ALA, its ester derivatives and m-THPC in photodynamic therapy (PDT) - Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 2003, 70, 1-6]. Основными недостатками этой композиции является крайне малое содержание активного вещества - всего 0,2%. Это ограничивает применение такого состава в ФДТ, так как показано, что минимальное содержание АЛК не должно быть менее 5% [Asta Juzeniene, Petras Juzenas, Vladimir Iani Topical Application of 5-Aminolevulinic Acid and its Methylester, Hexylester and Octylester Derivatives: Considerations for Dosimetry in Mouse Skin Model. - Photochemistry and Photobiology, 2002, 76(3): 329-334]. Другим недостатком можно считать низкую стабильность при хранении (за 30 дней количество АЛК снизилось на ~8%), кроме того, процесс получения состава на основе геля вода - моноолеат глицерина довольно сложен и занимает не менее суток.

Наиболее близки по составу к нашей композиции гелевые формы АЛК на водной основе. В качестве прототипа изобретения выбран водный гель на основе альгината в качестве гелеобразующего полимера в буферном растворе, обеспечивающем рН композиции 5-6 [US Patent 6,860,879 (2005)]. Основным недостатком этой композиции является то, что она приготовляется ex-tempore смешением твердой смеси АЛК и альгината с буферным раствором.

Задачей настоящего изобретения является создание стабильной при хранении гелевой композиции, содержащей АЛК в качестве активного компонента в количестве не менее 5% и водный гель в качестве основы.

Для решения этой задачи предложена композиция, включающая в качестве активного вещества гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты, гелеобразующий полимер - гидроксиэтилцеллюлозу, пластификатор, органическую добавку и воду при следующем соотношении компонентов (мас.%)

гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты 5,0-20,0 гидроксиэтилцеллюлоза 1,15-1,65 пластификатор 3,0-5,0 органическая добавка 5,0-20,0 вода остальное

Задача решается также тем, что в качестве пластификатора используют полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.

Задача решается также тем, что в качестве органической добавки используют пропиленгликоль, и/или этиленгликоль, и/или диэтиленгликоль, и/или глицерин, и/или диметилсульфоксид.

Задача решается также тем, что композиция дополнительно включает в качестве поверхностно-активного вещества блок-сополимер этилен- и пропиленоксида в количестве 2,5-5 мас.%.

Задача решается также тем, что композиция содержит дополнительно консервант в количестве 0,05-0,3 мас.%.

Задача решается также тем, что в качестве консерванта композиция содержит метиловый или пропиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты или N-(3,3бис(гидроксиметилметил)-2,5-диоксо-4-имидазолидинил)-N,N'-бис(гидроксиметил)-мочевину или их смеси

Гелеобразующий полимер гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ) можно использовать различных типов, различающихся степенью полимеризации, например, с молекулярным весом 7,2×10⁵ или 1,3×10⁶, при этом требуемые реологические свойства композиции (вязкость, пластичность) регулируют количеством используемого ГЭЦ.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) 300-1500 или полипропиленгликоль (ППГ) 250-1050 способствуют получению пластичного геля с высокими адгезивными свойствами.

Органические добавки вносят с целью повышения скорости проникновения активного вещества через верхние слои кожи.

Неионогенный ПАВ, представляющий собой блок-сополимер этилен- и пропиленоксида (Проксанол 268), способствует повышению смачиваемости верхнего слоя кожи.

Консерванты вводят для предотвращения развития в композиции микроорганизмов при длительном хранении.

Что касается технологии приготовления предлагаемых гелевых композиций, то она является максимально простой и фактически сводится к последовательному смешению компонентов, что занимает не более 3-х часов.

Специфическую активность, т.е. способность индуцировать образование PpIX, оценивали по флуоресценции индуцированного PpIX в здоровой коже кроликов и опухоли мышей. Распределение индуцированного PpIX при местном применении геля АЛК в тканях мышей с опухолью Эрлиха сведено в табл.1.

Из данных табл.1 следует, что АЛК в гелевой композиции хорошо проникает через роговой слой кожи и всасывается в кровь, о чем свидетельствует наличие специфической флуоресценции PpIX во внутренних органах и участках кожи и мышц, отдаленных от зоны аппликации. При этом количество индуцированного PpIX в опухоли растет с увеличением продолжительности аппликации и концентрации АЛК в геле. На фиг.1 показана зависимость от времени интенсивности флуоресценции индуцированного PpIX при аппликации геля с 20% содержанием АЛК в различных участках опухоли Эрлиха (1 - прилежащих к коже, 2 - на глубине 2-3 мм, 3 - на глубине 4-6 мм), а на фиг.2 та же зависимость при аппликации в течение 4 ч геля с различным содержанием АЛК.

Использование гелевой композиции с содержанием АЛК 5-20% для ФДТ саркомы S-37 на самцах мышей гибрида F1 показало, что предлагаемая композиция является эффективным средством для ФДТ и ФД онкологических заболеваний.

Таблица 1 Ткань Интенсивность флуоресценции, отн. ед. до аппликации через 4 ч Опухоль 1,6±0,2 7,0±1,0 Кожа со стороны эпидермиса 1,0±0,003 4,3±0,3 Кожа со стороны дермы 1,0±0,003 3,5±0,1 Кожа уха 1,1±0,1 2,6±0,3 Мышца 1,6±0,4 2,7±0,9 Печень 2,2±0,1 8,0±2,6 Желчный пузырь 1,6±0,1 28,2±10,5 Почки 1,6±0,2 4,9±0,4

Предлагаемое изобретение иллюстрируется приведенными примерами, но не ограничивается ими.

Примеры 1-18. Приготовление образцов геля АЛК

Образцы геля АЛК приготавливали в четырехгорлой круглодонной колбе вместимостью 50 см³, снабженной магнитной мешалкой с нагревом, термометром, обратным холодильником в атмосфере аргона, который барботировали в течение всего процесса приготовления. По окончании процесса гель АЛК затаривают во флаконы из темного стекла в специальном боксе в атмосфере аргона.

В случае применения в составе композиции блок-сополимера этилен- и пропиленоксида использовали методику А, в противном случае - методику Б.

Методика А. Приготовление образцов геля АЛК, содержащих блок-сополимер этилен- и пропиленоксида (проксанол 268)

К расчетному количеству воды, достаточному для приготовления 25 г геля АЛК, при комнатной температуре при перемешивании вносят ГЭЦ, поднимают температуру до 50°С и перемешивают при этой температуре 40 мин. После остывания массы до комнатной температуры вносят измельченный проксанол 268 и перемешивают. В полученную прозрачную однородную массу вносят заранее приготовленную смесь пропиленгликоля, ПЭГ, и в случае необходимости консервант (метилпарабен, пропилпарабен и диазолидинилмочевину или их смесь) и перемешивают еще 40 мин. Затем вносят АЛК, перемешивают до полного растворения, после чего перемешивают еще 15 мин и затаривают.

Методика Б. Приготовление образцов геля АЛК, не содержащих блок-сополимер этилен- и пропиленоксида

К расчетному количеству воды, достаточному для приготовления 25 г геля АЛК, при комнатной температуре при перемешивании вносят заранее приготовленную суспензию из расчетных количеств ГЭЦ, в случае необходимости, консерванта, органической добавки и пластификатора. Температуру поднимают до 50°С и перемешивают при этой температуре 40 мин. Затем дают массе остыть до комнатной температуры, в образовавшийся прозрачный гель вносят 5 г АЛК, перемешивают еще 15 мин и затаривают.

Составы образцов геля АЛК, приготовленных по методикам А и Б, приведены в табл.2.

Все приведенные в табл.2 композиции оказались устойчивыми в течение года.

Пример 19-22. Оценка местно-раздражающего действия геля АЛК

Оценку местно-раздражающего действия исследуемых образцов геля АЛК проводили макроскопически по наличию отека, гиперемии, шелушению, изъязвлению и другим патологическим проявлениям со стороны кожного покрова в зоне воздействия геля.

Гелевую композицию, содержащую 5-20% АЛК (состав по примерам 1-4), наносили на предварительно эпилированные участки спины мыши или крысы или на внутреннюю поверхность предплечья добровольцев, накрывали полиэтиленовой пленкой и фиксировали пластырем. Время аппликации составляло 4 часа.

Визуальный осмотр участков, подвергшихся аппликации, показал, что данная композиция при многократном (ежедневно в течение 5 дней) накожном применении не оказывала местно-раздражающего действия.

Примеры 23-25. Испытания эффективности геля на здоровой коже

Исследования проводили на кроликах породы «Шиншилла», самках, массой 2,5-3,5 кг. Образец геля (состав по примерам 1, 2, 4) наносили на предварительно эпилированные участки кожи спины кролика, накрывали полиэтиленовой пленкой и фиксировали пластырем. Время аппликации препарата составляло 4 часа. Предварительно животных седировали путем внутривенного введения реланиума (10-30 мг) или дроперидола (5 мг).

Индуцированную флуоресценцию в здоровой коже оценивали методом локальной флуоресцентной спектроскопии с возбуждением излучением твердотельного лазера с удвоением частоты (532 нм). При математической обработке интегральную интенсивность флуоресценции в диапазоне 620-650 нм нормировали на интегральную интенсивность аутофлуоресценции ткани в диапазоне 555-585 нм [Соколов В.В., Филоненко Е.В., Телегина Л.В. и др. Квантовая электроника, 2002, №11, 963-969], полученную величину обозначили как D_f. Регистрацию флуоресценции проводили контактным способом на диагностической установке «Спектр-Кластер» (ООО «Кластер», г.Москва); для получения достоверного результата измеряли от 5 до 10 спектров кожи.

Интенсивность флуоресценции протопорфирина IX в области нанесения геля на кожу превышала таковую для интактных участков кожи кролика не менее чем в два раза. В табл.3 приведена интенсивность нормированной флуоресценции (D_f) индуцированного протопорфирина IX в здоровой коже кролика после 4-х часовой аппликации геля АЛК. Из приведенных данных следует, что в области значений концентраций АЛК 5-20% диагностическая контрастность не снижается.

Таблица 3 № примера Состав композиции D_f 23 как в примере 1 2,5±0,5 24 как в примере 2 2,4±0,3 25 как в примере 4 2,3±0,2

Примеры 26, 27. Проведение фотодинамической терапии

Исследования были проведены на мышах гибридах F1 самцах с саркомой S-37. Опухолевый штамм S-37 поддерживали in vivo в асцитном варианте. Для экспериментов асцитическую жидкость в разведении 1:3 изотоническим раствором прививали подкожно на наружную поверхность бедра в количестве 0,05 см³/животное. Лечение начинали на 6-й день после прививки опухолевого материала. Размер опухолей на день лечения составлял (4-5)×(4-5) мм².

Гель, содержащий 10% или 20% АЛК (состав по примерам 2, 4), наносили на кожу из расчета 60 мг действующего вещества на мышь; ФДТ проводили через 4 ч аппликации.

В качестве источника оптического излучения использовали светодиодный источник с максимумом излучения на 530±15 нм. Расстояние между торцом излучателя и опухолью составляло 2-3 мм. Прибор устанавливали на максимальную мощность (плотность мощности ~30 мВт/см²) и облучали в течение 1 ч. Таким образом, световая доза составляла ~100 Дж/см².

Критерием оценки противоопухолевого эффекта являлось торможение роста опухоли (ТРО, %), которое вычисляли по формуле

где V_контр и V_опыт - объем опухоли в контрольной и опытных группах соответственно.

Данные по противоопухолевой эффективности ФДТ с гелевой композицией, содержащей АЛК, представлены в табл.4.

В табл.4 представлены данные по противоопухолевой эффективности ФДТ после 4-часовой аппликации геля АЛК у мышей с саркомой S-37. Как видно из данных табл.4, ФДТ с гелевой композицией, содержащей 20% АЛК (4-часовая аппликация), приводила к ТРО на 71-50%, при этом эффект сохранялся на уровне ≥50% в течение 11-14 дней после лечения.

Таблица 4 № опыта Состав композиции Доза мг/см² Параметры облучения ТРО на сутки после лечения, % Плотность мощности, мВт/см² Плотность энергии, Дж/см² 7 11 14 18 20 26 как в примере 4 40 30 54 71 55 51 35 29 27 как в примере 2 40 52 50 44 18 3

Таким образом создана стабильная при хранении гелевая композиция, содержащая АЛК в качестве активного компонента в количестве 5-20%, для индуцирования образования протопорфирина IX во флуоресцентной диагностике и фотодинамической терапии.

Предложенная композиция является эффективным средством для ФДТ и ФД онкологических заболеваний.

Изобретение относится к медицине и касается фармакологической композиции для флуоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ) с использованием просенсибилизатора - гидрохлорида 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК). Композиция для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии включает гидрохлорид 5-аминолевуливой кислоты в качестве активного вещества, гелеобразующий полимер - гидроксиэтилцеллюлозу и воду. При этом композиция дополнительно содержит пластификатор и органическую добавку. Композиция также может включать поверхностно-активное вещество - блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида в количестве 2,5-5,0 мас.%, а также консервант в количестве 0,05-0,3 мас.%. Изобретение обеспечивает создание стабильной при хранении гелевой композиции, содержащей АЛК в качестве активного компонента в количестве не менее 5% и водный гель в качестве основы. Предлагаемая композиция может быть эффективно использована для ФД и ФДТ. 5 з.п.ф-лы, 4 табл., 2 ил.

1. Композиция для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии, включающая в качестве активного вещества гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты, гелеобразующий полимер и воду, отличающаяся тем, что в качестве гелеобразующего полимера она содержит гидроксиэтилцеллюлозу, а также дополнительно содержит пластификатор и органическую добавку при следующем соотношении компонентов:
гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты 5,0-20,0% гидроксиэтилцеллюлоза 1,15-1,65% пластификатор 3,0-5,0% органическая добавка 5,0-20,0% вода остальное

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве пластификатора она содержит полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве органической добавки она содержит пропиленгликоль или этиленгликоль, или диэтиленгликоль, или глицерин и/или диметилсульфоксид.

4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида в количестве 2,5-5 мас.%.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит консервант в количестве 0,05-0,3 мас.%.

6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве консерванта она содержит метиловый или пропиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты или N-(1,3-бис(гидроксиметил)-2,5-диоксо-4-имидазолидинил)-N,N'-бис(гидроксиметил)-мочевину или их смеси.