СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРУПНОЗЕРНЫХ ФОРМ У АПОМИКТИЧНЫХ ГИБРИДОВ КУКУРУЗЫ Российский патент 2010 года по МПК A01H1/06 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при возделывании гибридов кукурузы.

В селекционной практике известны способы увеличения крупности семян злаков путем обработки посевного материала химическими мутагенами.

Известен способ получения крупнозерных форм овса путем обработки семян N-нитрозометилмочевиной (Ксенда Т.В., Азовцева А.П. Изменчивость хозяйственно-ценных признаков овса под влиянием химических мутагенов. // Химический мутагенез и селекция. - М.: Наука, 1971. С.307-312). Для этого сухие семена овса (сорт Орел) в течение 20 часов обрабатывали N-нитрозометилмочевиной (НММ) в концентрации 0,012% и 0,006% и диметилсульфатом (ДМС) - 0,05% и 0,025%. ДМС оказался эффективнее по влиянию на признак крупнозерности. При использовании ДМС в концентрации 0,025% в поколении M₂ выделено в три раза больше крупнозерных форм, чем при обработке НММ. В М₃ выделена семья (№12711), у которой вес 1000 зерен на 6 г превысил контроль (необработанные мутагеном семена), что составило 19,4%.

Известен способ увеличения содержания запасных белков в зерновках у сильных сортов яровой мягкой пшеницы путем обработки последних 5-азацитидином (Ванюшин Б.Ф. и др. Увеличение белковости зерновок пшениц под влиянием 5-азацитидина - ингибитора метилирования ДНК. // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1990. №1. С.75-83.). 5-Азацитидин вводили в растения на стадиях колошения и цветения несколькими способами: 1) опрыскивая колос и флаговый лист из пульверизатора раствором 5-азацитидина с концентрацией 2,5 мкг/мл; 2) инъекцией в соломину (верхнее междоузлие) 0,5 мл раствора 5-азацитидина с концентрацией 0,1-5 мкг/мл; 3) погружая надрезанный флаговый лист на несколько дней в раствор 5-азацитидина с концентрацией 1-5 мкг/мл. У всех подвергнутых тому или иному воздействию 5-азацитидина растений пшеницы по сравнению с контролем содержание суммарного белка в зерне увеличено в 1,2-1,5 раза.

Недостатком известного способа является то, что индуцированное 5-азацитидином увеличение содержания запасных белков в зерновках не сопровождается возрастанием их веса (получением крупнозерных форм).

Известно, что метилирование ДНК играет особую роль в регуляции экспрессии генов, репликации генома и клеточной дифференцировке у растений и животных (Патрушев Л.И. Экспрессия генов. - М.: Наука, 2000. 527 с.). Для экспрессии многих генов необходимо, чтобы они были неметилированы. У высших растений ДНК сильно метилирована по остаткам цитозина. Синтетический нуклеозид 5-азацитидин при репликации может включаться в ДНК, замещая в ней цитозиновые остатки. В местах такой замены, метилирование ДНК с образованием остатков 5-метилцитозина, становится невозможным (Jones P.F., Taylor S.M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. // Cell. 1980. V.20. P.85.).

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения крупнозерных форм кукурузы Zea mays L. (Моргун В.В. Экспериментальный мутагенез и его использование в селекции кукурузы. - Киев: Наук. думка, 1983. 280 с.). Константную инбредную линию ВИР 27 обрабатывали рядом мутагенов: N-нитрозоэтилмочевиной (концентрация - 0,0001%), 1,4-бис-диазоацетилбутаном (0,1%), стрептомицином (10 мкг/мл). Время экспозиции 24 часа. Вес 1000 семян у выделенных мутантных линий кукурузы относительно контроля возрос на 20,8-24,8% (средние по поколениям М₆-М₁₀). Линия ЧК 218, полученная при обработке стрептомицином, была использована в качестве родительского компонента при создании сорта кукурузы Юбилейный 60 (скрещивание гибрида (CG 10×F115) с линией ЧК 218), который был районирован в 1982 году в Черкасской области (Каталог впервые предлагаемых к районированию с 1982 года сортов сельскохозяйственных культур. - М., 1981).

Недостатком известного способа является случайный характер мутационного эффекта и его зависимость от многих факторов, а также изменение первичной последовательности нуклеотидов в геноме кукурузы.

Технической задачей изобретения является увеличение веса семян апомиктичных гибридов кукурузы при сохранении первичной последовательности нуклеотидов в ее геноме.

Поставленная техническая задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.

Сухие семена апомиктичных гибридов кукурузы замачивают при комнатной температуре в водном растворе 5-азацитидина с концентрацией 0,08-0,24 мкг/мл при массовом соотношении семена - раствор 5-азацитидина, равном 1:(4-6). Время экспозиции продолжается до стадии прорастания. По мере уменьшения количества раствора его добавляют до начального объема. В поколениях М₁-М₂ отбирают семьи с увеличенной крупностью семян (крупнозерные формы) в сравнении с контролем (необработанные семена) и используют для дальнейшего получения урожаев. Способ позволяет увеличить вес семян у апомиктичных гибридов кукурузы и половых растений на 13-29%.

Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что для получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы используют водный раствор синтетического нуклеозида 5-азацитидина в концентрации 0,08-0,24 мкг/мл, который препятствует метилированию ДНК при эпигенетическом маркировании генов и позволяет увеличить вес семян до 13-29%. Использование эпимутагена 5-азацитидина, блокирующего метилирование ДНК, позволяет сохранить структуру гена (сохраняется первичная последовательность нуклеотидов), включив при этом экспрессию отдельных генов, что позволяет увеличить хозяйственно-полезные признаки у апомиктичных гибридов кукурузы, конкретно, вес семян.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Материалом служили 39-хромосомные (30Zm+9Td) апомиктичные гибриды кукурузы Zea mays L. с гамаграссом Tripsacum dactyloides L. Сухие семена замачивали при комнатной температуре в бюксах с раствором 5-азацитидина концентрации 0,24 мкг/мл в массовом соотношении 1:4 и выдерживали до стадии прорастания (2-3 дня) с периодическим подливанием раствора до исходного объема. Проклюнувшиеся зерновки переносили в чашки Петри с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой, и проращивали в термостате при температуре 27°С. Контрольные семена (необработанные) проращивали в чашках Петри, замачивая их в дистиллированной воде.

В таблице 1 представлены данные по влиянию 5-азацитидина (AZ) на выживаемость проростков. Из табл.1 видно, что при обработке 5-азацитидином гибнет около 30% проростков, что говорит о токсическом действии данного препарата, наблюдаемом также и при обработке классическими химическими мутагенами.

Пример 2.

Сухие семена 39-хромосомных (30Zm+9Td) апомиктичных гибридов кукурузы Zea mays L. с гамаграссом Tripsacum dactyloides L. замачивали при комнатной температуре в бюксах с раствором 5-азацитидина концентрации 0,08 мкг/мл в массовом соотношении 1:6 и выдерживали до стадии прорастания (2-3 дня) с периодическим подливанием раствора до исходного объема. Проклюнувшиеся зерновки переносили в чашки Петри с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой, и проращивали в термостате при температуре 27°С. Контрольные семена (необработанные) проращивали в чашках Петри, замачивая их в дистиллированной воде.

Влияние 5-азацитидина на крупность зерна изучали на взрослых растениях поколений М₁ (на парниках селекционно-генетического комплекса ИЦиГ СО РАН, г.Новосибирск) и М₂ (на экспериментальном участке КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко, г.Краснодар). Контролем служили растения, выросшие из необработанных семян.

Кукурузно-трипсакумные гибриды имеют вегетационный период более 5 месяцев, поэтому в условиях Новосибирской области проростки сначала сажали в горшочки с землей в теплице, а затем растения высаживали в парник. С каждого растения М₁ семена убирались отдельно. Семена поколения M₂ высевали в полевых условиях по семьям (потомство каждого растения М₁). Так как апомиктичные гибриды являются мужскостерильными, то для формирования эндосперма зерновок необходимо оплодотворение центральной клетки зародышевого мешка пыльцой кукурузы. В качестве опылителей использовали тетраплоидные формы кукурузы - Тестер пурпуровый (г.Новосибирск) и С-435 (г.Краснодар). В поколениях М₁-М₂ отбирали семьи с увеличенным весом семян (крупнозерные формы) по сравнению с контролем.

В таблице 2 представлены данные по среднему весу семян в поколениях М₁-М₂ растений апомиктичного кукурузно-трипсакумного гибрида (2n=39=30Zm+9Td), выросших из обработанных 5-азацитидином (AZ) семян, при опылении тетраплоидной формой кукурузы (2n=4x=40). Из табл.2 видно, что в поколении М₁ у двух семей (№90 и №116) из четырнадцати средний вес семян достоверно выше, чем в контроле (на 28,4% и 13,6% соответственно). При посеве поколения М₂ в полевых условиях у этих семей он также достоверно выше (№90 - на 28,8%; №116 - на 12,5%). Во втором поколении и в других семьях выявлялись достоверные отличия от контроля как в сторону увеличения веса зерновок (№88, №106), так и уменьшения (№114).

На чертеже представлены распределения по признаку "вес семян" в M₂ лучших семей, обработанных 5-азацитидином, и в контроле. Из чертежа видно, что при обработке 5-азацитидином, по сравнению с контролем, достоверна не только разница средних, но и частотный характер опытных и контрольных распределений по этому признаку, что подтверждается сравнением по методу Колмогорова - Смирнова. При этом в семьях, обработанных 5-азацитидином, относительно контроля наблюдалось возрастание частот классов с максимальным значением признака "вес семян" (распределения сдвинуты вправо).

Полученные результаты позволяют говорить о возможности действия 5-азацитидина на экспрессию импринтинга и разблокировании генов, полученных зиготой от матери. При этом эффект увеличения веса семян в разных семьях составляет 12,5-28,8% и обнаруживается как в M₁, так и М₂.

Использование заявляемого способа позволит получать крупнозерные формы у апомиктичных гибридов кукурузы при сохранении первичной последовательности нуклеотидов в ее геноме.

Таблица 1 Способ получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы   Опыт-1 Опыт-2   Контроль AZ Контроль AZ Заложено зерновок 24 37 20 33 Проклюнулось зерновок 24 36 20 33 Погибло в чашках Петри 0 6 0 3 Погибло после посадки 0 6 1 7 Погибло всего 0 (0%) 12 (33%) 1 (5%) 10 (30%) Взрослых растений 24 24 19 23

Таблица 2 Способ получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы № растения M₁ (AZ) M₂ (AZ) Вес зерновки, г Лимиты, мг n Вес зерновки, г Лимиты, мг n 87 0,094±0,007 7-155 36       88 0,084±0,006 3-140 37 0,094±0,004** 4-170 167 90 0,113±0,006*** 15-165 34 0,103±0,003*** 2-195 231 94 0,061±0,006 4-115 26 0,078±0,003 2-175 183 95 0,091±0,007 10-145 33 0,098±0,003*** 2-175 226 97 0,097±0,005 4-140 43 0,092±0,006 5-175 68 98 0,081±0,005 3-130 59       99 0,084±0,005 3-135 39       103 0,080±0,006 7-140 60 0,085±0,004 3-185 122 106 0,088±0,006 3-145 45 0,099±0,003*** 2-175 168 108 0,088±0,005 6-125 61 0,072±0,008 4-130 27 114 0,067±0,006* 3-125 45 0,062±0,004** 2-140 102 115 0,090±0,004 3-145 73 0,089±0,004 4-165 102 116 0,100±0,006* 3-150 58 0,090±0,003** 2-170 204 Z 0,090±0,002 3-165 705 0,091±0,001*** 2-195 1600 Контроль 0,088±0,002 1-170 578 0,080±0,003 2-170 156 Примечание. Звездочками отмечена достоверность отличий от контроля: *Р<0,05; **Р<0,01; ***P<0,001.

Сухие семена апомиктичных гибридов кукурузы замачивают в водном растворе 5-азацитидина с концентрацией 0,08-0,24 мкг/мл при массовом соотношении семена - раствор 5-азацитидина, равном 1:(4-6), и выдерживают до стадии прорастания. В поколениях M₁-М₂ отбирают семьи с крупнозерными формами и используют для дальнейшего получения урожаев. Способ позволяет увеличить вес семян у апомиктичных гибридов кукурузы и половых растений на 13-29% с сохранением исходного генотипа. 2 табл., 1 ил.

Способ получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы, включающий обработку семян химическим реагентом, с последующим отбором в поколениях M₁ и М₂ растений с хозяйственно-полезными свойствами, отличающийся тем, что в качестве химического реагента используют водный раствор 5-азацитидина с концентрацией 0,08-0,24 мкг/мл при массовом соотношении семена-раствор 5-азацитидина, равном 1:(4-6), при этом семена выдерживают в растворе до стадии прорастания.