Способ определения воздействия мутагена на биохимический состав сорго Советский патент 1993 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к селекции и генетике растений, и может быть использовано в мутационной селекционно-генетической практике, в частности для оценки воздействия мутагенов и выявления мутантных форм.

Цель изобретения - расширение диапазона оценки воздействия мутагена и эффективности его биохимического действия за счет использования УФ- и видимой области спектра.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения воздействия мутагена на биохимический состав сорго, включающем обработку зерновок мутагеном, высев их, получение от них семенного потомства по семьям, размол зерна, получение муки, определение в ней изменения содержания органических компонентов спектроскопией и выявление измененных по отношению к исходным, необработанным мутагеном зерновкам форм, а содержание органических компонентов определяют по анализу спектров УФ- и видимой области.

В науке и технике неизвестно неочевидное использование УФ- и видимой области спектра для расширения диапазона оценки воздействия мутагенов у растений и биохимической эффективности мутагенов. Использование ИК-спектров для решения этой задачи в прототипе не является оптималь00

ю ю

Оч 00

ю

ным, тэк как не охватывает всего возможного спектра биохимического и генетического последействия мутагенов. Вместе с тем общеизвестно, что основное действие мутагенов направлено на изменение последовательности оснований нуклеиновых кислот, например делеции у ДНК, что приводит к изменению структуры белка. Так как нуклеиновые кислоты и белки имеют интенсивные полосы поглощения в УФ-об- ласти спектра, то оценивать мутационный эффект на биохимический состав зерна более целесообразно в этой области, причем также возможен дополнительный анализ органических соединений, например липо- фильных, в видимой области спектра. Кроме того, одним из4 существенных преимуществ анализа УФ- и видимой области спектра, характеризующего изменение энергии электронов, является более высокая разрешающая -способность за счет увеличения предела обнаружения многих органических веществ, которые имеют полосу поглощения с большим значением молярного коэффициента абсорбции. Это примерно в 100 раз больше максимальных значений молярного коэффициента абсорбции в ИК-спект- ре. отражающем изменение вращательной и колебательной энергии молекулы.

Способ осуществляют следующим образом. Обрабатывают растение сорго или его части, например зерновки, мутагенами, например нитрозометилмочевиной в концентрации 0,05-0,01% при экспозиции 16- 20 ч. Высевают обработанные зерновки в почву для семенного размножения, получают от них семенное мутантное потомство. Собирают зерновки индивидуально с каждого растения (по семьям), отбирают из каждой семьи анализируемую пробу (навеску зерновок), стерилизуют в растворах спирта и хлорамина, высушивают, размалывают навеску зерновок, например, с помощью шаровой агатовой мельницы до мелкодисперсной фракции, причем размолу подвергают всю целую зерновку с околоплодником и зародышем. Полученную муку спектрофотометрируют в УФ- и видимой области спектра (200-700 нм) с помощью, например, SPECORD М 40. Определяют содержание органических компонентов муки, например нуклеиновых кислот, белков и липофильных соединений. Сравнивают полученные данные по содержанию органических компонентов у обработанных, форм с аналогичными данными у контрольных, т.е. у исходных, необработанных мутагеном форм, для выделения уклоняющихся форм с измененным содержанием органических компонентов. На основе сравнения полученных спектров для каждого мутагена выявляют биохимически наиболее эффективные мутагены и оптимальные режимы их использования.

Пример. Зерновки сорго различных

сортообразцов, например ВС-36. Отбор белое, Волжское 5. Волжское 51, Майло 352. Фетерита белая, а также зерновки Суданки 16 обрабатывали водными растворами мутагенов в следующих концентрациях: нит- розометилмочевина 0,05% и 0,01%, дмэтилсульфат 0.05% и смесь нитрозоме- тилмочевины 0,01 % и диоксана 1.00% с временем экспозиции 16 ч. В контрольном

5 варианте зерновки обрабатывали дистиллированной водой - растворителем мутагенов, при той же временной экспозиции. Обработанное таким образом зерно высевали в почву для семенного размножения Семенное

0 мутантное поколение собирали индивидуально по семьям внутри каждого сорта, зерно стерилизовали в течение 2 мин сначала в 70% растворе этилового спирта, затем, промыв водой 15 мин, в 1 % растворе хлорамина

5 в течение 5 мин, а затем вновь отмывали водой 15 мин для удаления органических остатков растительного и животного происхождения. Высушивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре 18 ч

0 Подготовленное таким образом для анализа целое зерно размалывали на агатовой шаровой мельнице до мелкодисперсной фракции в режиме 18 тыс. об/мин в течение 40 мин. Полученную муку таблетировали в кювету

5 для анализа в навески по 100 млг. Приготовленные образцы спектрофотометрировали на спектрофотометре SPECORD M 40 в диапазоне УФ-излучения (длины волн 200-339 нм) и в диапазоне видимого излучения (дли0 ны волн 340-700 нм) в режимах абсорбции и пропускания. Полученные спектры анализировали следующим образом: определяли длины волн, на которых имеются максимумы абсорбции и пропускания - в области

5 колебаний оснований нуклеиновых кислот 260 нм, белков 275-280 нм и липофильных соединений 332-340 нм. и сравнивали со спектрами, полученными для контрольных, необработанных мутагенами образцов. По

0 изменению смещения максимумов спектров по отношению к контрольным образцам выявляли характер и степень воздействия мутагенов.

Например, обработка диэтилсульфатом

5 в концентрации 0,05% вызывала резкое понижение спектрального максимума в области колебаний белков (длины волн 275-280 нм) по сравнению с контролем, а величина максимума в области колебаний липофиль- ных соединений (длины волн 332-340 нм) не

отличалась от контрольного. Особенно ярко эти изменения проявились у зерновок сор- тообразца Волжское 51.

Обработка мутагеном нитрозометилмо- чевиной в концентрации 0.01 % для всех изу- ченных сортообразцов не выявила значимых изменений по сравнению с конт- ролем. Увеличение концентрации этого мутагена до 0.05% приводило к значительному повышению максимума в области колеба- ний белков и вместе с тем к смещению максимума в области колебаний оснований нуклеиновых кислот. Зафиксированные изменения наиболее выражены у сортообраз- ца ВС 36.

Обработка смесью мутагенов нитрозо- мегилмочевиной в концентрации 0,01% с диоксаном в концентрации 1.00% вызывала повышение максимума в области колебаний белков по сравнению с контролем для всех изученных сортообразцов, особенно в случае Волжского 51 и Отбора белого. Наблюдаемая динамика была обусловлена биохимическим воздействием мутагенов и носила общий характер воздействия в це- лом по выборке. На основании анализа спектров можно предварительно выявлять биохимически измененные мутационные формы сорго различных сортообразцов в ранних мутантных поколениях для последу- ющей оценки и отбора среди них наследственных форм, а также определять оптимальные концентрации воздействия

мутагенов для тех или иных зафиксированных изменений.

В заявленном способе по сравнению с прототипом проводимые измерения в УФ- и видимой области спектра увеличивают как аналитическую точность, так и диапазон оценки определяемого биохимического воздействия мутагенов, что повышает эффективность контроля биохимического действия мутагенов.

Прототип для оценки действия мутагенов не применим, так как те органические соединения, изменение которых свидетельствует о мутационном эффекте, а именно нуклеиновые кислоты и белки, не имеют интенсивно выраженных спектральных полос поглощения в ИК-области и, следовательно, не могут быть четко идентифицированы.

Формула изобретения Способ определения воздействия мутагена на биохимической состав сорго, включающий обработку зерновок мутагеном, посев их. получение их семенного потомства по семьям, размол зерна, получение муки, определение в ней изменения содержания органических компонентов спектроскопией и выявление измененных форм по сопоставлению с исходными, необработанными мутагенами, отличающийся тем, что содержание органических компонентов определяют по ультрафиолетовой и видимой областям спектра.

Использование: сельское хозяйство, растениеводство, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: воздействие мутагена на биохимический состав сорго определяют спектроскопией по УФ- и видимой области спектра в муке обработанных мутагеном зерновок и при сопоставлении с исходными формами, необработанными мутагеном, выявляют измененные формы. с/ с