СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЭКСПЛАНТОВ ЛИШАЙНИКА ИСЛАНДСКИЙ МОХ (Cetraria islandica (L.) ACH.) Российский патент 2010 года по МПК A01H15/00 

Изобретение относится к области биологии, в частности к области биотехнологии, экспериментальной лихенологии, микробиологии, и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности, парафармацевтике, ветеринарии.

Уровень техники

Многие виды лишайников могут быть ценным сырьем для фармацевтической и пищевой промышленности, парафармацевтики, ветеринарии (Yamamoto Y., Miura Y., Higuchi M., Kinoshita Y., Yoshimura I., 1993. Using lichen tissue cultures in modem biology // The Bryologist 96: 384 393).

Однако одной из ключевых проблем является высокий уровень поражения лишайниковых эксплантов контаминантами (Yoshimura I., Kurokawa Т., Yamamoto Y., Kinoshita Y., 1993. Development of lichen thalli in vitro // Bryologist 96: 412-421).

Для высших растений разработаны методы стерилизации эксплантов (Бутенко Р.Г., 1999. Биология клеток растений in vitro и биотехнологии на их основе. - M: ФБК-пресс, 159 с.).

Они неприменимы для лишайников, например стерилизация сулемой не позволяла снизить поражение, не уничтожив самих симбионтов лишайника (Ahmadjian V., 1989. Studies on the isolation and synthesis of bionts of the cyanolichen Peltigeria canina (Peltigeraceae) // Pl. Syst. Evol. 165:29-38).

В патентной и научно-технической литературе нет других упоминаний о стерилизации лишайниковых эксплантов.

Задачей настоящего изобретения является создание нового способа стерилизации лишайниковых эксплантов, который обладает следующими качествами: снижает поражение эксплантов контаминантными микроорганизмами (минимум на 10%), не повреждает самих симбионтов лишайников.

Поставленная задача решается созданием нового способа стерилизации эксплантов лишайника Исландский мох (Cetraria islandica}, заключающегося в в последовательной обработке лишайниковых эксплантов стерилизующими агентами, отличающейся тем, что в качестве стерилизующих агентов используют последовательную обработку этанолом (в концентрации от 3 до 98%) и этаноловым экстрактом усниновой кислоты (концентрация от 10 до 1000 мг/мл) при времени обработки от 5 минут до 2 часов

Выход за пределы по последовательности использования специфических и неспецифических стерилизующих агентов и их концентрации приводит к следующим изменениям. При стерилизации менее 5 минут эффекта от обработки стерилизующими агентами не наблюдается, при чересчур длительной стерилизации (более 2 часов) возможно повреждение симбионтов лишайников. Использование этанола в концентрации ниже 3% неэффективно, а применение их в концентрациях выше 98 и 37% соответственно невозможно из-за отсутствия подобных растворов при нормальных условиях (данных растворов не бывает в природе).

Суть изобретения заключается в использовании для поверхностной стерилизации комбинации этанола и этанолового экстракта усниновой кислоты. Поверхность слоевищ лишайников обильно заселена ассоциативными микроорганизмами. Большинство из них относится к тем же систематическим группам, что и симбионты лишайников, поэтому использование одних только специфических стерилизующих агентов не эффективно. Выходом является использование комбинации из этанола и этанолового экстракта усниновой кислоты.

Изобретение подтверждается следующими примерами:

Пример 1

Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см². Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 3% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут.

После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 60% инокулированных фрагментов (поражение составляет 60%; в контроле без обработки - 100%).

Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников.

Пример 2

Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см². Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут.

После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 50% инокулированных фрагментов (поражение составляет 50%; в контроле без обработки - 100%).

Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников.

Пример 3

Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica} промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см². Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 98% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут.

После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 40% инокулированных фрагментов (поражение составляет 40%; в контроле без обработки - 100%).

Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников.

Пример 4

Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см². Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 10 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут.

После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 70% инокулированных фрагментов (поражение составляет 70%; в контроле без обработки - 100%).

Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников.

Пример 5

Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см². Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 10 минут), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 1000 мг/мл (на 10 минут). Общее время стерилизации составляет 20 минут.

После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 48% инокулированных фрагментов (поражение составляет 48%; в контроле без обработки - 100%).

Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников.

Пример 6

Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см². Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 1 час), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 1 час). Общее время стерилизации составляет 2 часов.

После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 37% инокулированных фрагментов (поражение составляет 40%; в контроле без обработки - 100%).

Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников.

Пример 7

Лишайник Исландский мох (Cetraria islandica) промывают стерильной водой, нарезают на небольшие фрагменты площадью 1 см². Фрагменты помещают в химические стаканы объемом 100 мл. Сначала в стакан наливают 50 мл 30% этанола (на 2 мин 30 с), а затем этанол выливают, лишайник промывают стерильной водой и добавляют 50 мл этанолового экстракта усниновой кислоты концентрацией 100 мг/мл (на 2 мин 30 с). Общее время стерилизации составляет 5 минут.

После обработки стерилизующим агентом экспланты промывают стерильной водой и помещают в чашки Петри с агаризованной средой Чапека. Культивирование проводят в термостате (25°С), в темноте в течение 2 недель. Спустя 2 недели контаминантами оказывается поражено 70% инокулированных фрагментов (поражение составляет 70%; в контроле без обработки - 100%).

Спустя 2 недели после инокуляции по краям лопастей слоевищ Цетрарии исландской наблюдался первичный неассоциированный рост симбионтов лишайников.

Из результатов таблицы следует, что оптимальные условия стерилизации достигаются в примерах №№3, 6. Увеличению эффективности стерилизации способствует увеличение времени обработки слоевищ лишайников (пример 6). Хороший результат дает увеличение концентрации стерилизующего агента (примеры 3, 5). Во всех приведенных примерах через 2 недели после инокуляции был отмечен рост симбионтов Цетрарии исландской, что говорит о том, что в результате стерилизации жизнеспособность симбионтов была сохранена.

Экспланты лишайника Исландский мох (Cetraria islandica) сначала обрабатывают этанолом в концентрации от 3 до 98%, а затем - этаноловым экстрактом усниновой кислоты в концентрации 10-1000 мг/мл. При общем времени стерилизации в течение от 5 минут до 2 часов достигается значительное снижение поражения эксплантов контаминантными микроорганизмами без повреждения самих симбионтов лишайников. 1 табл.

Способ стерилизации эксплантов лишайника Исландский мох (Cetraria islandica), заключающийся в последовательной обработке лишайниковых эксплантов стерилизующими агентами, отличающийся тем, что обработку осуществляют последовательно этанолом в концентрации от 3 до 98% и этаноловым экстрактом усниновой кислоты с концентрацией от 10 до 1000 мг/мл при общем времени обработки от 5 мин до 2 ч.