САМОКОНСЕРВИРУЮЩИЙСЯ БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2010 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений от болезней.

Одним из основных источников возбудителей болезней растений является почва, в которой развиваются и сохраняются в виде спор фитопатогенные грибы, такие как Fusarium, Helminthosporium, Rhisoctonia, Pythium, Sclerotium, Alternaria, Verticillium. Для борьбы с почвенными патогенами используются главным образом химические фунгициды. Однако интенсивное использование химических препаратов приводит к экологическим нарушениям, к появлению более устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов и к другим нежелательным последствиям.

Все шире в практике сельскохозяйственного производства используется интегрированная система защиты растений, которая включает использование биологических препаратов, в том числе на основе антагонистов, подавляющих рост фитопатогенов.

Известен жидкий препарат на основе штамма Trichoderma viride-AL (Апсите А.Ф. и др. Вест. с.-х. науки №9 (397), с.114-118, 1989). Препарат представлен мицелиальной (вегетативной) формой гриба в виде культуральной жидкости, которая эффективно защищала ячмень, овес, рожь, пшеницу, свеклу и картофель от корневых и стеблевых гнилей. Недостатком этого препарата является отсутствие товарной формы, что не позволяет обеспечить хранение препарата. Таким же недостатком обладает и препарат на основе культуральной жидкости штамма №23 Trichoderma viride (Патент РФ №2186847).

Известен жидкий препарат триходермин на основе гриба Trichoderma lignorum (Патент РФ №2035145). Для получения этого препарата культивирование проводят в жидкой среде в течение 3-5 сут, затем биомассу концентрируют и для увеличения срока хранения вводят глицерин, поливинилпирролидон или полиэтиленоксид. Однако при этом не удается сохранить биологическую активность препарата более трех месяцев даже при температуре не выше +10°С.

Известен препарат на основе мицелия штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16, который получают в результате культивирования в течение 40-60 часов и последующего концентрирования биомассы (Патент РФ №2170511). Для увеличения срока хранения в концентрированную биомассу добавляют карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) и соли магния. Основным недостатком препарата является также невысокий срок хранения - не более трех месяцев при температурах от +15 до +30°С.

Известен пастообразный препарат на основе гриба Trichoderma harzianum, используемый для борьбы с аскохитозом, белой и черной стеблевыми гнилями огурцов и томатов (Патент РФ №2094991). Препарат готовят, выращивая биомассу на твердом субстрате (зерна ячменя, пшеницы) в течение 5-7 сут, затем сушат и размалывают. Для приготовления пасты в раствор прилипателя, в качестве которого используется КМЦ, добавляют сухую размолотую биомассу гриба. Недостатками этого препарата являются многостадийность, длительный срок и трудоемкость его приготовления.

Известны сухие препараты Триходермин-10 и Фиор II, рекомендуемые против болезней различных сельскохозяйственных культур (Алейте А.Ф. и др. Вест. с.-х. науки №9 (397), c.114-118, 1989). Препараты изготавливают, наращивая биомассу гриба на твердом носителе (зерне, торфе, соломе) или в жидкой среде на подносах в течение длительного времени (до 14 суток). Способ производства длителен по времени и трудоемок.

Известен препарат на основе штамма Gliocladium catenulatum, эффективный против многих болезней растений, который получают культивированием на твердом носителе или в жидкой среде до полного высыпания спор с последующим высушиванием и размалыванием (Патент США №5968504). Если биомассу наращивают в жидкой среде, то перед высушиванием в нее вводят носитель, состоящий из одного или нескольких веществ из ряда - сахароза, молочный порошок, каолин, крахмал, лигнин и КМЦ. Время приготовления препарата составляет не менее 7 сут. Недостатком этого препарата также является длительный и трудоемкий процесс его приготовления.

Известна фунгицидная композиция на основе штамма Trichoderma harzianum, содержащая носитель, целиком или частично состоящий из питательных веществ, которые обеспечивают интенсивное развитие гриба при применении (Патент США №5266316). Биомассу выращивают на твердой среде, основу которой составляют крахмал и целит, в течение 10 сут, затем гранулируют и сушат. Полученный препарат сохраняет активность в течение года. Однако такой способ приготовления препарата также длителен и трудоемок.

Для повышения в полевых условиях эффективности препаратов на основе грибов, активных против болезней растений, разработаны композиции, содержащие «доставочную» среду, в состав которой могут входить песок, глина, мука, отруби, вермикулит, торф и т.д. (Патент РФ №2127521). Способ приготовления препаратов включает выращивание биомассы в течение 3-7 сут в жидкой среде. Жидкую концентрированную или лиофилизированнную биомассу добавляют в стерильные контейнеры с поставочной средой, куда вносят также NН₄Сl в качестве источника азота. Контейнеры инкубируют в течение 5-20 сут при 30°С и упаковывают в трехслойные стерильные пластиковые пакеты. Полученные таким образом препараты можно хранить при +4°С в течение нескольких месяцев. Недостатком этой композиции является длительный процесс приготовления и невысокий срок хранения.

Известна гранулированная композиция и способ стабилизации всех микробиологических агентов, используемых в биозащите сельскохозяйственных культур (Патент США №6455036). При приготовлении композиции в концентрированную биомассу, выращенную в жидкой среде, вводят сорбент, поглощающий воду (сополимер крахмала и полиакрилонитрила), вещество, стабилизирующее клеточную мембрану (обычно сахарозу или другой дисахарид), и гранулирующий агент, например диатомовую землю. Дополнительно может быть введено масло. После смешения и гранулирования смесь высушивают. Полученные таким образом препараты на основе различных биоагентов сохраняют жизнеспособность в течение года при комнатной температуре. Однако в приведенном примере для препарата на основе гриба Fusarium oxysporum время приготовления составляет более 7 сут. Кроме того, предложенная композиция является дорогостоящей, так как содержит 10-65% cахаров.

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются композиция на основе грибов-антагонистов различных родов, активных против болезней растений, и способ ее приготовления, включающий культивирование гриба в жидкой среде в течение 6-10 сут до полного высыпания спор, концентрирование биомассы на фильтре, обработку биомассы разбавленной кислотой в концентрации от 0,02 до 0,1 N для предотвращения бактериального заражения, смешивание с пористым носителем (вермикулитом, перлитом, диатомовой землей, минеральной ватой или их смесью) и высушивание на воздухе (Патент США №5068105). Предпочтительно смешивание биомассы, разбавленной кислотой, с вермикулитом в соотношении от 1:1 до 3:1. Такой препарат сохраняет активность при комнатной температуре не менее 6 недель. Недостатком этой композиции кроме длительного процесса приготовления является невысокий срок хранения. Кроме того, такой препарат перед применением требует активации путем инкубации с разбавленной кислотой и питательными веществами в течение 1-2 дней.

В целом, анализ уровня техники показывает, что известные микофунгицидные препараты, которые имеют достаточно большой срок хранения, представляют собой сухие композиции, содержащие живые споры грибов-антагонистов. Однако приготовление таких препаратов весьма трудоемко и занимает длительное время (до 10 суток и более). Известные препараты, которые могут быть приготовлены быстрее (в течение 1-3 сут) и с меньшими трудовыми затратами, представляют собой жидкие или пастообразные композиции, содержащие в основном вегетативную форму грибов-антагонистов. Они имеют высокую активность, но короткий срок хранения (не более 3-х месяцев).

Задачей изобретения являлась разработка ускоренного способа получения и рецептуры препарата для борьбы с болезнями растений на основе мицелия грибов-антагонистов родов Trichoderma и Gliocladium, имеющего срок хранения не менее 6 месяцев при температурах +15 - +30°С.

Задачу решали следующим образом. Мицелий грибов-антагонистов получали культивированием в жидкой среде с оптимизацией условий выращивания биомассы, что позволяло получить продукт в течение 1-2 суток. После концентрирования биомассы в 3-10 раз фильтрованием, сепарированием или центрифугированием в нее вводили хотя бы одно вещество, способствующее спорообразованию. Готовый препарат упаковывали, обеспечивая доступ воздуха. Такой препарат имеет высокую активность непосредственно после его приготовления. В процессе хранения происходит спорообразование грибов-антагонистов, которое приводит к самопроизвольной консервации препарата. Таким образом, при хранении препарат переходит в споровую форму, допускающую длительное хранение без существенной потери активности. В качестве веществ, способствующих спорообразованию, использовали следующие:

- кислоты в концентрации, создающей рН 2.0-5.0;

- ингибиторы клеточного метаболизма в концентрации до 0,05 мас.%;

- сорбенты.

При использовании для приготовления препаратов сорбентов в качестве веществ, способствующих спорообразованию, возможно использование исходной культуральной жидкости без предварительного концентрирования.

Известно применение кислот в качестве консервирующих агентов для сохранения различных продуктов. Споры бактерий при рН ниже 5,0 не прорастают, и таким образом предотвращается порча продукта (Г.Шлегель. Общая микробиология. М.: Мир, 1987, с.212). В ходе разработки настоящего изобретения выяснено, что концентрация кислот в препарате, создающая рН 2.0-5.0, не вызывает гибели грибов-антагонистов, но способствует спорообразованию. В заявляемом способе приготовления препарата используется гораздо более концентрированная кислота

(10-100%), чем в прототипе, что позволяет достигнуть необходимой величины рН без существенного разбавления концентрированной биомассы.

Известны ингибиторы клеточного метаболизма, которые представляют собой соли тяжелых металлов (CuSO₄, AgNO₃, HgCl₂ и другие). Эти соединения, которые называются также ферментными ядами, при введении в культуру вызывают гибель микроорганизмов (Г.Шлегель. Общая микробиология. М.: Мир, 1987, с.204). В ходе разработки настоящего изобретения выяснено, что небольшие концентрации ингибиторов клеточного метаболизма (до 0,05 мас.%) способствуют спорообразованию мицелиальных грибов.

Известно использование сорбентов для приготовления биопрепаратов. Сорбенты используются для обеспечения необходимого водно-солевого баланса при культивировании грибов на твердых средах (Патент США №5266316), в качестве водопоглощающих агентов, способствующих стабилизации биомассы в процессе высушивания (Патент США №5068105, Патент РФ №2035144), в качестве гранулирующих агентов (Патент США №6455036) или доставочной среды (Патент США №6280719). При таком использовании сорбентов важными характеристиками являются способность удерживать влагу, малый удельный вес, обеспечение пространства для роста гриба. Эти же характеристики сорбентов важны и при использовании их в рамках заявляемого изобретения. Однако кроме этого в ходе разработки настоящего изобретения найдено, что кислотные группы, имеющиеся на поверхности многих сорбентов, способствуют спорообразованию, действуя аналогично растворам кислот. При сорбции грибов-антагонистов на поверхности таких сорбентов грибы попадают в среду, способствующую их переходу в споровую форму. Если используется сорбент, имеющий недостаточное количество кислотных групп на своей поверхности (например, активированный уголь), дополнительное количество таких групп на поверхности может быть создано специальным введением в препарат дополнительных порций кислот.

Для приготовления самоконсервирующегося препарата в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано любое из перечисленных выше веществ, способствующих спорообразованию, или их смесь. В случае приготовления препарата с использованием кислоты, а также смеси кислоты и ингибитора клеточного метаболизма препарат представляет собой жидкую или пастообразную субстанцию, в ходе хранения которой грибы-антагонисты переходят в так называемые "глубинные" споровые формы. В случае приготовления препарата с использованием сорбента, а также сорбента в смеси с кислотой препарат представляет собой твердую порошкообразную или гранулированную субстанцию, в ходе хранения которой мицелий грибов-антагонистов непосредственно контактирует с кислородом воздуха и переходит в так называемые "поверхностные" споровые формы.

В препарат могут также вводиться дополнительно источники углерода и энергии, азота, а также прилипатели-диспергаторы, обеспечивающие оптимальные физико-химические свойства (стабильность рабочей суспензии препарата и ее высокую адгезию к обрабатываемым семенам или вегетирующим растениям).

Таким образом, самоконсервирующийся биопрепарат для защиты растений от болезней в соответствии с настоящим изобретением непосредственно после приготовления может иметь следующий состав (мас.%):

биомасса грибов-антагонистов 10-99 источник углерода и энергии не более 85 кислота до рН 2,0-5,0 не более 5 ингибитор клеточного метаболизма не более 0,05 прилипатель-диспергатор не более 10 или   биомасса грибов-антагонистов 0-90 источник углерода и энергии не более 50 источник азота не более 1 сорбент 10-90 кислота до рН 2,0-5,0 не более 5 прилипатель-диспергатор не более 10

В ходе хранения препарата его состав изменяется - биомасса грибов-антагонистов переходит из вегетативной в споровую форму, содержание источников углерода и азота уменьшается, а содержание кислот может увеличиться в ходе метаболизма грибов.

В качестве грибов-антагонистов могут быть использованы грибы родов Trichoderma и Gliocladium.

В качестве источников углерода и энергии используются углеводы или их смеси, а также продукты, содержащие большое их количество, например мука или отходы переработки различных сельскохозяйственных растений, например меласса или зеленая патока.

В качестве веществ - источников азота могут использоваться нитраты и соли аммония, различные белковые гидролизаты и т.д. или их смеси.

В качестве кислот могут быть использованы неорганические и органические кислоты, такие как соляная, хлорная, азотная, муравьиная, уксусная, трихлоруксусная, лимонная или их смеси.

В качестве ингибиторов клеточного метаболизма могут применяться соли тяжелых металлов или их смеси. Предпочтительно использование солей меди как микроэлемента, необходимого для развития растений.

Сорбент представляет собой пористое вещество растительной или минеральной природы, нетоксичное для биоагента. Это могут быть различные виды активированного угля, сорбент на основе растительных остатков - лесорб, силикагель, вермикулит, торф, цеолит и т.д. или их смеси.

В качестве веществ - прилипателей-диспергаторов могут быть использованы набухающие в воде полимеры, обладающие высокими адгезионными свойствами (например, КМЦ, поливиниловый спирт (ПВС)) и поверхностно-активные вещества, такие как твин 20, твин 80 или их смеси. Эти вещества могут вводиться в препарат в процессе его приготовления, но могут быть добавлены и непосредственно в рабочий раствор препарата перед применением.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма №4097 Trichoderma virtue Pers ex S.F.Gray в жидкой среде.

3-5 миллионов поверхностных конидий гриба помещают в колбы объемом 750 мл с 150 мл органосинтетической среды следующего состава (на 1 л среды):

картофельно-глюкозный бульон 60 мл меласса 20 мл мочевина 0,5 г однозамещенный фосфат калия 2,0 г сернокислый магний 7-водный 0,25 г вода питьевая до 1 л.

Культивируют на качалке при 220 об/мин при 28°С в течение 20-48 часов. В регулярно отбираемых пробах культуральной жидкости контролируют значение рН и сухой вес биомассы гриба. Через 20-40 часов культура гриба представляет собой созревший мицелий, который становится зернистым. При микроскопировании культура гриба в этот период представлена в основном мицелием, содержащим до 10% хламидоспор. рН при этом остается в пределах 7,0±0,5.

Пример 2. Получение концентрированной биомассы на основе культуральной жидкости штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

Культуральную жидкость по примеру 1 концентрируют сепарированием, центрифугированием или фильтрованием. Полученная биомасса содержит 5-15% сухих веществ.

Пример 3. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют кислоту соляную (25%) до рН 2,0 и сахарозу в количестве 5% от веса биомассы. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер. Препараты хранят при комнатной температуре и относительной влажности не менее 30%.

Пример 4. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют 85% крахмала, муравьиную кислоту до рН 5,0 и 0,005% AgNO₃. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 5. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют кислоту хлорную (20%) до рН 2,5 и CuSO₄×5H₂O 0,01%. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 6. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют декстран в количестве 50% от веса биомассы, кислоту уксусную до рН 5,0 и КМЦ - 5%. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 2 часа для разбухания целлюлозы. Массу периодически перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 7. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют мелассу в количестве 30% от веса биомассы, кислоту уксусную до рН 5,0, затем кислоту лимонную до рН 4,0, CuSO₄×5H₂O 0,05% и КМЦ - 2%. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 2 часа для разбухания целлюлозы. Массу периодически перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 8. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют кислоту соляную (15%) до рН 3,0, лактозу в количестве 20% и крахмал в количестве 5% от веса биомассы, 0,01% Ag₂SO₄ и 5% ПВС. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 9. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma wide Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют кислоту соляную (15%) до рН 5,0, муку кукурузную в количестве 30% от веса биомассы, 0,01% AgNO₃ и 0,04% CuSO₄×5H₂O. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 10. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют кислоту трихлоруксусную до рН 3,5, глюкозу в количестве 10% от веса биомассы, 5% КМЦ и 5% твин 20. Смесь тщательно перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 11. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют кислоту соляную (15%) до рН 3,0, лактозу в количестве 20% от веса биомассы, 0,01% Cu(NO₃)₂, 2% твина 20 и 3% КМЦ. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 2 часа для разбухания целлюлозы. Массу периодически перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 12. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 1, добавляют лесорб - сорбент на основе растительных остатков в количестве 90% от веса биомассы. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 13. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют 10% силикагеля, 50% крахмала и 1% NH₄Cl. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 14. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют 10% фруктозы, кислоту соляную (20%) до рН 2,0, 1% нитрата калия и вермикулит в количестве 40%. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 15. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют 30% крахмала, 10% силикагеля, 20% торфа и 1% NH₄H₂PO₄. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 16. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют 20% глюкозы, 20% активированного угля, 0,5% NH₄Cl и 0,5% КNО₃. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 17. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют муку кукурузную в количестве 20% от веса биомассы, кислоту изолимонную до рН 5,0, 15% активированного угля и КМЦ - 5%. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 2 часа для разбухания целлюлозы, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 18. Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют лактозу в количестве 25% от веса биомассы, кислоту уксусную до рН 5,0, затем кислоту муравьиную до рН 4,0, 20% цеолита и 1% NH₄Cl. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 19. Культивирование гриба Trichoderma viride штамм 30 в жидкой среде.

3-5 миллионов поверхностных конидий гриба помещают в колбы объемом 750 мл с 150 мл органосинтетической среды следующего состава(на 1 л среды):

сернокислотный гидролизат БВК 70 мл глицерин 30 мл двузамещенный фосфат калия 0,5 г однозамещенный фосфат калия 0,5 г сернокислый магний 7-водный 0,25 г сернокислый аммоний 3,0 г вода питьевая до 1 л.

Культивируют на качалке при 180 об/мин при 30°С в течение 20-48 часов. В регулярно отбираемых пробах культуральной жидкости контролируют значение рН и сухой вес биомассы гриба. Через 20-40 часов культура гриба представляет собой созревший мицелий. Биомассу гриба концентрируют, отделяя остатки питательной среды сепарированием, центрифугированием или фильтрованием.

Пример 20. Получение препарата на основе биомассы гриба Trichoderma viride штамм 30.

К биомассе, полученной, как описано в примере 19, добавляют кислоту хлорную до рН 2,0. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 21. Получение препарата на основе биомассы гриба Trichoderma viride штамм 30.

К биомассе, полученной, как описано в примере 19, добавляют кислоту азотную (10%) до рН 3,0, крахмал в количестве 15% от веса биомассы, 0,0005% HgCl₂ и 10% твина 80. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 22. Получение препарата на основе биомассы гриба Trichoderma viride штамм 30.

К биомассе, полученной, как описано в примере 19, добавляют 90% лесорба. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 23. Получение препарата на основе биомассы гриба Trichoderma viride штамм 30.

К биомассе, полученной, как описано в примере 19, добавляют мелассу в количестве 10% от веса биомассы, 1% гидролизата БВК, 10% поливинилового спирта и 30% торфа. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 24. Культивирование гриба Gliocladium virens штамм 19 в жидкой среде.

3-5 миллионов поверхностных конидий гриба помещают в колбы объемом 750 мл с 150 мл органосинтетической среды следующего состава (г на 1 л среды):

дрожжевой экстракт 5,0 сахароза 20,0 двузамещенный фосфат калия 0,5 однозамещенный фосфат калия 0,5 сернокислый магний 7-водный 0,25 сернокислый аммоний 3,0 вода питьевая до 1 л.

Культивируют на качалке при 180 об/мин при 30°С в течение 20-48 часов. В регулярно отбираемых пробах культуральной жидкости контролируют значение рН и сухой вес биомассы гриба. Через 20-40 часов культура гриба представляет собой созревший мицелий, начинается образование глубинных конидий и хламидоспор. Биомассу гриба концентрируют, отделяя остатки питательной среды сепарированием, центрифугированием или фильтрованием до содержания сухих веществ 15-25%.

Пример 25. Получение препарата на основе биомассы гриба Gliocladium virens штамм 19.

К биомассе, полученной, как описано в примере 24, добавляют кислоту соляную до рН 2,0. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 26. Получение препарата на основе биомассы гриба Gliocladium virens штамм 19.

К биомассе, полученной, как описано в примере 24, добавляют кислоту трихлоруксусную (15%) до рН 3,0, лактозу в количестве 20,0% от веса биомассы, 0,005% Ag₂SO₄, 10% твина 20. Смесь тщательно перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 27. Получение препарата на основе биомассы гриба Gliocladium virens штамм 19.

К биомассе, полученной, как описано в примере 24, добавляют 90% лесорба. Смесь тщательно перемешивают и помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 28. Получение препарата на основе биомассы гриба Gliocladium virens штамм 19.

К биомассе, полученной, как описано в примере 24, добавляют кислоту лимонную до рН 5,0, зеленую патоку в количестве 10% от веса биомассы, 10% цеолита, 5% твина 20 и 3% КМЦ. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 2 часа для разбухания целлюлозы. Массу периодически перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Пример 28(а). Получение препарата на основе штамма №4097 Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray.

К 100 г биомассы, полученной, как описано в примере 2, добавляют 3,2 мл 20% соляной кислоты до рН 3,0, 10 г крахмала, 5 г ПВС и 10 мг CuSO₄×5H₂O. Смесь тщательно перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Полученный препарат содержит: 84,36% биомассы, 2,97% кислоты, 8,44% крахмала, 4,22% ПВС и 0,01% CuSO₄×5H₂O.

Пример 28(6). Получение препарата на основе биомассы гриба Gliocladium virens штамм 19.

К 100 г биомассы, полученной, как описано в примере 24, добавляют 20 г торфа, перемешивают, добавляют 5,5 мл ледяной уксусной кислоты до рН 4,5, и 10 г глюкозы. Смесь тщательно перемешивают, затем помещают в неплотно закрытый контейнер.

Полученный препарат содержит: 73,65% биомассы, 14,73% торфа (сорбент), 4,25% кислоты и 7,37% глюкозы.

Полученные таким образом препараты на основе грибов-антагонистов сохраняют биологическую активность не менее 6 месяцев при температуре +15-+30°С. Влияние компонентов препарата на сохранение биологической активности гриба приведено в таблице.

Для сравнения с препаратами, описанными выше, на основе биомассы грибов-антагонистов, полученной по примерам 2, 19 и 24, были приготовлены препараты, не содержащие веществ, способствующих переходу вегетативной формы грибов в споровые формы. Составы этих препаратов и результаты изменения их активности в процессе хранения приведены в таблице под номерами 29-34.

Пример 29. Испытания фунгицидной активности препаратов на основе грибов-антагонистов.

Фунгицидную активность препаратов определяли методом «встречных культур» (Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С.Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1976, 307 с.), который позволяет оценить гиперпаразитическую активность любого штамма микофильного гриба при культивировании анализируемого штамма совместно с индикаторным штаммом Fusarium graminearum, который является возбудителем фузариоза колоса зерновых культур.

Исследования проводили в чашках Петри с картофельно-декстрозным агаром (КДА). Для проведения исследования использовали стерильные чашки Петри, которые в асептических условиях заливали КДА по 15 см³ в каждую. Чашки с питательной средой проверяли на стерильность, выдерживая в термостате при (26±1)°C в течение (1÷2) суток. Чашки, где был обнаружен рост микрофлоры, выбраковывали.

Индикаторную культуру Fusarium graminearum хранили в пробирках со скошенным агаром на среде Чапека в течение 6 месяцев без пересева. В пробирку наливали

10-20 см³ физиологического раствора и смывали культуру с агара. По камере Горяева определяли титр спор в полученной суспензии и расчетным количеством физиологического раствора доводили титр суспензии до концентрации 10⁶ спор/см³.

Для исследования фунгицидной активности использовали суспензии препаратов в концентрации 1%. На поверхность питательной среды засевали суспензию исследуемого препарата и суспензию индикаторного штамма штрихом с помощью микробиологической петли. Посев осуществляли таким образом, что индикаторный штамм и исследуемый препарат находились напротив друг друга на расстоянии примерно 2 см от центра чашки каждый. Анализ проводили в 5-и повторностях. Засеянные чашки помещали в термостат и культивировали в течение 3 суток при температуре (28±2)°C. Затем чашки вынимали из термостата и еще 3 суток выдерживали при комнатной температуре (21±1,5)°C при рассеянном освещении для стимулирования спорообразования.

Через 6 суток с момента посева проводили анализ результатов. Для этого определяли площадь той части чашки Петри, где выросла культура гриба-антагониста. Фунгицидная активность исследуемого препарата, выраженная в процентах, определялась как среднее арифметическое величин площадей, занимаемых культурой гриба-антагониста, полученных в повторностях, по отношению к общей площади поверхности чашки Петри.

Таблица
Изменение фунгицидной активности препаратов на основе грибов-антагонистов в процессе хранения № пп. Состав препарата Фунгицидная активность по отношению к Fusarium graminearum, % Наличие споровых форм в препарате через 6 мес после хранения при +20°С исходная Через 6 мес хранения при +20°С 1 Культуральная жидкость по примеру 1 85 0 - 2 Биомасса по примеру 2 95 0 - 3 Препарат по примеру 3 95 75 Глубинные конидии 4 Препарат по примеру 4 75 60 Поверхностные конидии 5 Препарат по примеру 5 95 65 Хламидоспоры 6 Препарат по примеру 6 85 55 Хламидоспоры 7 Препарат по примеру 7 90 60 Хламидоспоры 8 Препарат по примеру 8 90 75 Глубинные конидии 9 Препарат по примеру 9 90 70 Хламидоспоры 10 Препарат по примеру 10 90 75 Глубинные конидии 11 Препарат по примеру 11 90 65 Хламидоспоры 12 Препарат по примеру 12 75 60 Поверхностные конидии 13 Препарат по примеру 13 90 75 Поверхностные конидии 14 Препарат по примеру 14 90 60 Поверхностные конидии 15 Препарат по примеру 15 90 70 Поверхностные конидии 16 Препарат по примеру 16 85 75 Поверхностные конидии 17 Препарат по примеру 17 90 80 Поверхностные конидии 18 Препарат по примеру 18 85 65 Поверхностные конидии 19 Биомасса по примеру 19 95 0 - 20 Препарат по примеру 20 95 55 Хламидоспоры 21 Препарат по примеру 21 95 60 Глубинные конидии 22 Препарат по примеру 22 85 70 Поверхностные конидии 23 Препарат по примеру 23 90 60 Поверхностные конидии 24 Биомасса по примеру 24 100 0 - 25 Препарат по примеру 25 95 55 Хламидоспоры 26 Препарат по примеру 26 90 70 Глубинные конидии 27 Препарат по примеру 27 85 65 Поверхностные конидии 28 Препарат по примеру 28 95 75 Поверхностные конидии 29 Биомасса по примеру 2+85% крахмала 80 0 - 30 Биомасса по примеру 2+85% крахмала + 1% NН₄Сl 80 0 - 31 Биомасса по примеру 2+79% крахмала + 1% NН₄NO₃ + 10% КМЦ 80 0   32 Биомасса по примеру 19+85% декстрана 80 0 - 33 Биомасса по примеру 19+70% сахарозы + 1% NH₄H₂PO₄ + 10% ПВС 85 0   34 Биомасса по примеру 24+79% муки + 1% КNO₃ + 10% твин 20 80 0  

Как следует из данных таблицы, предлагаемый комплекс компонентов способствует стабилизации биологической активности препаратов на основе грибов-антагонистов в процессе хранения за счет образования споровых форм. Если к биомассе не было добавлено никаких кислот или сорбентов (примеры 1-2, 19, 24, 29-34), то споровые формы в процессе хранения если и образовывались, то в незначительных количествах и быстро инактивировались.

Источники информации

1. Апсите А.Ф., Швинка Ю.Э., Стрикауска С.В., Виестурс У.Э., Лисовска А.Я., Бичевскис Е.Я., Свока И.М., Беника Р.Г. Использование триходермина для защиты растений от фитопатогенных микромицетов. Вест. с.-х. науки №9 (397), c.114-118, 1989.

2. Патент РФ №2186847, МПК A01N 63/04.

3. Патент РФ №2035145, МПК A01N 63/04.

4. Патент РФ №2170511, МПК A01N 63/04, C12N 01/14.

5. Патент РФ №2094991, МПК A01N 63/04, A01G 7/00.

6. Патент США №5968504, МПК A01N 25/00, A01N 63/00, С07С 1/2, C12N 01/00.

7. Патент США №5266316, МПК A01N 63/00, C12N 01/20.

8. Патент РФ №2127521, МПК A01N 63/04, C12N 01/14.

9. Патент США №6455036, МПК A01N 63/00, C12N 07/00, C12N 01/14, С12М 07/01.

10. Патент США №5068105, МПК А61К 35/70, C12N 01/14, A01N 63/04.

11. Г.Шлегель. Общая микробиология. М.: Мир, 1987, 566 с.

12. Патент РФ №2035144, МПК A01N 63/04.

13. Патент США №6280719, МПК A01N 25/00, A01N 65/00, C07G 17/00, C12N 01/00, C12N 01/20.

14. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С.Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1976, 307 с.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству средств защиты растений. Биопрепараты получены путем глубинного культивирования грибов-антагонистов родов Trichoderma или Gliocladium в течение 20-48 часов до получения биомассы в вегетативной форме с последующим добавлением вещества, способствующего спорообразованию. Непосредственно после приготовления препарат имеет следующий состав (мас.%): биомасса грибов-антагонистов - 10-99; источник углерода и энергии - не более 85; кислота до рН 2,0-5,0 - не более 5, ингибитор клеточного метаболизма - не более 0,05, прилипатель-диспергатор - не более 10 или биомасса грибов-антагонистов - 10-90; источник углерода и энергии - не более 50, источник азота - не более 1, сорбент - 10-90, кислота до рН 2,0-5,0 - не более 5, прилипатель-диспергатор - не более 10. В ходе хранения препарата биомасса грибов-антагонистов переходит из вегетативной в споровую форму, за счет чего происходит консервация препарата. Изобретения позволяют получить препараты, в процессе хранения которых при доступе воздуха активность препаратов сохраняется не менее 6 мес при температурах 15-30°С. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Самоконсервирующийся биопрепарат для защиты растений от болезней, содержащий биомассу грибов-антагонистов родов Trichoderma или Gliocladium, вещества, являющиеся источниками углерода и энергии, азота, и прилипатели-диспергаторы, отличающийся тем, что он получен с использованием грибов-антагонистов Trichoderma или Gliocladium в вегетативной форме и дополнительно содержит, по крайней мере, одно вещество, способствующее при хранении препарата переходу вегетативной формы грибов-антагонистов в споровую форму, в качестве которого используют органическую или неорганическую кислоту, создающую рН среды от 2,0 до 5,0.

2. Самоконсервирующийся биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что кислоту выбирают из следующего ряда: соляная, хлорная, азотная, муравьиная, уксусная, трихлоруксусная, лимонная или используют их смеси.

3. Самоконсервирующийся биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит второе вещество, способствующее спорообразованию грибов-антагонистов - ингибитор клеточного метаболизма в количестве не более 0,05 мас.%.

4. Самоконсервирующийся биопрепарат по п.3, отличающийся тем, что ингибитор клеточного метаболизма выбирают из ряда солей меди, серебра, ртути и других тяжелых металлов или используют их смеси.

5. Самоконсервирующийся биопрепарат по п.3, отличающийся тем, что непосредственно после приготовления он имеет следующее соотношение компонентов, мас.%:
биомасса грибов-антагонистов родов   Trichoderma, Gliocladium 10-99 источник углерода и энергии не более 85 кислота до рН 2,0-5,0 не более 5 ингибитор клеточного   метаболизма не более 0,05 прилипатели-диспергаторы не более 10

6. Самоконсервирующийся биопрепарат для защиты растений от болезней, содержащий биомассу грибов-антагонистов родов Trichoderma или Gliocladium, вещества, являющиеся источниками углерода и энергии, азота, и прилипатели-диспергаторы, отличающийся тем, что он получен с использованием грибов-антагонистов родов Trichoderma или Gliocladium в вегетативной форме и дополнительно содержит, по крайней мере, одно вещество, способствующее при хранении препарата переходу вегетативной формы грибов-антагонистов в споровую форму, в качестве которого используют сорбент.

7. Самоконсервирующийся биопрепарат по п.6, отличающийся тем, что сорбент выбирают из ряда: различные виды активированного угля, силикагель, вермикулит, торф, цеолит, лесорб или используют их смеси.

8. Самоконсервирующийся биопрепарат по п.6, отличающийся тем, что он дополнительно содержит не более 5 мас.% органической или неорганической кислоты.

9. Самоконсервирующийся биопрепарат по п.8, отличающийся тем, что непосредственно после приготовления он имеет следующее соотношение компонентов, мас.%:
биомасса грибов-антагонистов 10-90 источник углерода и энергии не более 50 источник азота не более 1,0 сорбент 10-90 кислота не более 5 прилипатель не более 10

10. Способ получения самоконсервирующегося биопрепарата для защиты растений от болезней по п.1, заключающийся в том, что культивируют штамм гриба-антагониста родов Trichoderma или Gliocladium в жидкой среде и концентрируют полученную биомассу, отличающийся тем, что культивирование проводят в течение 20-48 ч до получения биомассы гриба в вегетативной форме, к концентрированной биомассе добавляют, по крайней мере, одно вещество, способствующее спорообразованию и обеспечивающее переход вегетативной формы грибов-антагонистов в споровую форму, в качестве которого используют органическую или неорганическую кислоту, создающую рН среды от 2,0 до 5,0 в ходе хранения препарата, которое осуществляют при доступе воздуха.

11. Способ получения самоконсервирующегося биопрепарата по п.10, отличающийся тем, что кислоту выбирают из следующего ряда: соляная, хлорная, азотная, муравьиная, уксусная, трихлоруксусная, лимонная или используют их смеси.

12. Способ получения самоконсервирующегося биопрепарата по п.10, отличающийся тем, что в него дополнительно вводят второе вещество, способствующее спорообразованию грибов-антагонистов - ингибитор клеточного метаболизма в количестве не более 0,05 мас.%.

13. Способ получения самоконсервирующегося биопрепарата по п.12, отличающийся тем, что ингибитор клеточного метаболизма выбирают из ряда: соли меди, серебра, ртути и других тяжелых металлов или используют их смеси.

14. Способ получения самоконсервирующегося биопрепарата для защиты растений от болезней по п.6, заключающийся в том, что культивируют штамм гриба-антагониста родов Trichoderma или Gliocladium в жидкой среде, отличающийся тем, что культивирование проводят в течение 20-48 ч до получения биомассы гриба в вегетативной форме, к биомассе добавляют, по крайней мере, одно вещество, способствующее спорообразованию и обеспечивающее переход вегетативной формы грибов-антагонистов в споровую форму, в качестве которого используют сорбент, а хранение препарата осуществляют при доступе воздуха.

15. Способ получения самоконсервирующегося биопрепарата по п.14, отличающийся тем, что сорбент выбирают из ряда: различные виды активированного угля, лесорб, силикагель, вермикулит, торф, цеолит или используют их смеси.

16. Способ получения самоконсервирующегося биопрепарата по п.14, отличающийся тем, что в него дополнительно вводят второе вещество, способствующее спорообразованию грибов-антагонистов - органическую или неорганическую кислоту в количестве не более 5 мас.%.