БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕНОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ TRICHODERMA, ШТАММЫ TRICHODERMA ДЛЯ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ТАКИХ ШТАММОВ Российский патент 2017 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 C12R1/885 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, микробиологической промышленности и растениеводству.

В промышленной микробиологии и биотехнологии известны способы отбора штаммов микромицетов рода Trichoderma и использования штаммов микроскопических грибов рода Trichoderma для решения различных задач: производства биопрепаратов для защиты растений от болезней, стимуляции роста растений как источника гликозил-гидролаз (карбогидразы, гликозидазы), как источника антибактериальных соединений.

Известен способ отбора штаммов грибов Trichoderma - анатагонистов фитопатогенных грибов - путем посева встречных колоний на поверхность плотной питательной среды и отбора гриба-антагониста по характеру роста (Патент SU №1671684 кл. C12N 1/14; A01N 63/04, опубл. 23.08.1991).

Известен штамм Trichoderma longibrachiatum TW-1 ВКМ F-3634 D -продуцент комплекса карбогидраз (гликозил-гидролаз), содержащего целлюлазы, бетаглюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы. Штамм получен с помощью классического многоступенчатого мутагенеза и селекции. Для штамма оптимизировано глубинное культивирование, позволяющее получать культуральную жидкость с активностью целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ от 0,5 до 470 ед./мл (Патент RU №2195490, кл. C12N 1/14; C12N 9/42, опубл. 27.12.2002).

Известен препарат для стимуляции роста и защиты растений пшеницы от болезней (Патент RU №2305405, кл. A01N 63/04; C12N 1/14; C12R 1/885, опубл. 10.09.2007). Препарат содержит конидии микромицета-антагониста Trichoderma viride 81/17, гуматы и микроэлементы. Предлагаемый препарат снижает пораженность растений фитопатогенными грибами, ускоряет прорастание семян и увеличивает урожайность сельскохозяйственных культур.

Известен штамм гриба Trichoderma lignorum полученный путем ступенчатого отбора по признакам антибиотической, ферментативной активности и продуктивности. Штамм депонирован в НИИ коллекций культуры клеток Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» под номером F5. Штамм обладает антагонистической активностью против грибов Fusarium, Botrytis cinerea и Pseudomonas corrugata. Применение штамма для обработки овощных культур - огурцов и томатов - позволяет снизить заболевание овощных культур и повысить продуктивность растений (Патент RU №2121793, кл. A01N 63/04, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R 1:885, опубл. 20.11.1998).

Известен способ получения самоконсервирующегося биопрепарата для защиты растений на основе Trichoderma viride №4097 и Trichoderma viride штамм 30 (см. патент RU №2380906, кл. A01N 63/04, C12N 1/14, опубл. 10.02.2010). Препарат содержит биомассу грибов-антагонистов Trichoderma, источники углерода и энергии, источник азота, прилипатели-диспергаторы, а также кислоту и/или ингибитор клеточного метаболизма.

Задачей настоящего изобретения является получение средства защиты растений на основе штаммов Trichoderma в виде биопрепарата, содержащего конидии, хламидоспоры и фрагменты мицелия.

Решение поставленной задачи достигается благодаря предложенному способу производства биопрепарата для защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста на основе трех штаммов Trichoderma: Trichoderma longibrachiatum: Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325.

Биопрепарат получают совместным двухстадийным культивированием указанных штаммов на питательной среде следующего состава (г/дм³ среды): K₂HPO₄ - 0,9, KH₂PO₄ - 0,6, NH₄Cl - 1,25, NaCl - 0,1, сахароза - 1,0, меласса - 40,0, MgSO₄ - 0,1, раствор микроэлементов по Федорову - 4 см³, а затем следующего состава (г/дм³ среды): NH₄Cl - 1,5; KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄ - 2,0, NaCl - 1,0 CaCl₂ - 10,0, раствор микроэлементов по Федорову - 1,0 см³, меласса - 40,0.

Штаммы Trichoderma longibrachiatum: Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325, ранее в литературе не описаны.

Пример 1. Штамм гриба Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324 для производства биопрепарата защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста

Штамм характеризуется следующими признаками:

Морфолого-культуральные признаки

При культивировании на питательной среде Чапека (температура культивирования 28°С, рН до автоклавирования 5,0) признаки роста появляются через 20-24 часа культивирования в виде войлочных, просвечивающихся колоний диаметром 2,5-3,0 см. На вторые сутки (48 часов) культивирования на поверхности среды формируются распростертые, войлочно-бархатистые прижатые дерновинки 5,0-5,5 см диаметром, беловатого или светло-зеленого цвета. На третьи сутки (72 часа) культивирования колонии бархатистые, светло-зеленые, диаметром 8,5-9,0 см. Обратная сторона колоний (реверс) вначале (48-72 часа культивирования) беловатая, позже светло-зеленая. Пигмент при выращивании в чашках не выделяет, но при выращивании на среде Кинг А выделяет желтый пигмент.

Конидиеносцы в виде боковых ответвлений гиф воздушного мицелия (75,0-80,1×2,0-2,4 мкм). Фиалиды бутылевидные, расположены одиночно, редко по 2-3 (7,2-10,0×2,5-3,2 мкм). Конидии верхушечные овальные (3,0-3,3×2,1-2,2 мкм), одинокие или в сферических скоплениях. Обладает характерным «грибным» ароматом.

Растет при температуре 4-40°С, оптимум - 28-30°С; рН питательной среды 4,0-8,5, оптимум - 5,5-6,5.

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к источникам углерода: активно усваивает целлюлозу, трегалозу. Хорошо - глюкозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу, фруктозу, иннозитол, сукцинат, гликолат, формиат, ацетат. Умеренно - галактозу, лактозу, декстрин, крахмал, маннит, дульцит, кальций-Д-сахарат, лактат. Слабо - рамнозу, арабинозу, ксилозу, сорбит, глицерин, малат. Очень слабо - фумарат, левулинат. Цитрат, оксалат и бензоат - ингибируют рост.

Отношение к источникам азота: активно усваивает пептон, хлорид и сульфат аммония. Хорошо - аммоний азотнокислый, мочевину. Умеренно - азотнокислый калий, азотнокислый натрий. Слабо - азотнокислый кальций.

Амилолитическая активность слабовыраженная. Желатин не гидролизует. Способен к деструкции клетчатки и целлюлозосодержащих материалов. Устойчив к действию нистатина, тетрациклинов, хлорамфеникола, пенициллинов. Проявляет фунгистатический алиментарный анатагонизм в отношении Fusarium avenaceum, Phoma sp., Alternaria sp., Cladosporium cucumerinum.

Пример 2. Штамм гриба Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 для производства биопрепарата защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста

Морфолого-культуральные признаки

При культивировании на питательной среде Чапека (температура культивирования 28°С, рН до автоклавирования 5,0) признаки роста появляются через 20-24 часа культивирования в виде войлочных, просвечивающихся колоний диаметром 2,7-3,4 см. На вторые сутки (48 часов) культивирования на поверхности среды формируются распростертые, войлочно-бархатистые прижатые дерновинки 5,6-5,8 см диаметром, беловатого или желтоватого цвета. На третьи сутки (72 часа) культивирования колонии бархатистые, беловатые или желтоватые, диаметром 8,8-9,1 см. Обратная сторона колоний (реверс) вначале (48-72 часа культивирования) беловатая, позже светло-желтая. Пигмент при выращивании в чашках не выделяет, но при выращивании на среде Кинг А выделяет желтый пигмент.

Конидиеносцы в виде боковых ответвлений гиф воздушного мицелия (77,0-82,0×2,2-2,6 мкм). Фиалиды бутылевидные, расположены одиночно, редко по 2-3 (7,0-11,2×2,2-3,0 мкм). Конидии верхушечные овальные (3,1-3,4×2,1-2,5 мкм), одинокие или в сферических скоплениях. Обладает характерным "грибным" ароматом.

Растет при температуре 4-40°С, оптимум - 28-30°С; рН питательной среды 4,0-8,5, оптимум - 5,5-6,5.

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к источникам углерода: активно усваивает целлюлозу, трегалозу. Хорошо - глюкозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу, фруктозу, иннозитол, сукцинат, гликолат, формиат, ацетат. Умеренно - галактозу, лактозу, декстрин, крахмал, маннит, дульцит, кальций-Д-сахарат, лактат. Слабо - рамнозу, арабинозу, ксилозу, сорбит, глицерин, малат. Очень слабо - фумарат, левулинат. Цитрат, оксалат и бензоат - ингибируют рост.

Отношение к источникам азота: активно усваивает пептон, хлорид и сульфат аммония. Хорошо - аммоний азотнокислый, мочевину. Умеренно - азотнокислый калий, азотнокислый натрий. Слабо - азотнокислый кальций.

Амилолитическая активность слабовыраженная. Желатин не гидролизует. Способен к деструкции клетчатки и целлюлозосодержащих материалов. Устойчив к действию нистатина, тетрациклинов, хлорамфеникола, пенициллинов. Проявляет фунгистатический алиментарный анатагонизм в отношении Fusarium sporotrichioides, Phytophthora infestans, Peronospora sp., Botrytis cinerea, Ascochyta sp.

Пример 3. Штамм гриба Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325 для производства защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста

Морфолого-культуральные признаки

При культивировании на питательной среде Чапека (температура культивирования 28°С, рН до автоклавирования 5,0) признаки роста появляются через 20-24 часа культивирования в виде войлочных, просвечивающихся колоний диаметром 3,0-3,4 см. На вторые сутки (48 часов) культивирования на поверхности среды формируются распростертые, войлочно-бархатистые прижатые дерновинки 5,6-5,7 см диаметром, беловатого или зеленоватого цвета. На третьи сутки (72 часа) культивирования колонии бархатистые, зеленоватые, или зеленые, диаметром 9,0-9,1 см. Обратная сторона колоний (реверс) вначале (48-72 часа культивирования) беловатая, позже светло-зеленая. Пигмент при выращивании в чашках не выделяет, но при выращивании на среде Кинг А выделяет желтый пигмент.

Конидиеносцы в виде боковых ответвлений гиф воздушного мицелия (70,0-82,0×2,2-2,4 мкм). Фиалиды бутылевидные, расположены одиночно, редко по 2-3 (7,0-11,5×2,5-3,0 мкм). Конидии верхушечные овальные (3,0-3,4×2,1-2,5 мкм), одинокие или в сферических скоплениях. Обладает характерным "грибным" ароматом.

Растет при температуре 4-40°С, оптимум - 28-30°С; рН питательной среды 4,0-8,5, оптимум - 5,5-6,5.

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к источникам углерода: активно усваивает целлюлозу, трегалозу. Хорошо - глюкозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу, фруктозу, иннозитол, сукцинат, гликолат, формиат, ацетат. Умеренно - галактозу, лактозу, декстрин, крахмал, маннит, дульцит, кальций-Д-сахарат, лактат. Слабо - рамнозу, арабинозу, ксилозу, сорбит, глицерин, малат. Очень слабо - фумарат, левулинат. Цитрат, оксалат и бензоат - ингибируют рост.

Отношение к источникам азота: активно усваивает пептон, хлорид и сульфат аммония. Хорошо - аммоний азотнокислый, мочевину. Умеренно - азотнокислый калий, азотнокислый натрий. Слабо - азотнокислый кальций.

Амилолитическая активность слабовыраженная. Желатин не гидролизует. Способен к деструкции клетчатки и целлюлозосодержащих материалов. Устойчив к действию нистатина, тетрациклинов, хлорамфеникола, пенициллинов. Проявляет фунгистатический алиментарный анатагонизм в отношении Helminthosporium sp., Rhisoctonia sp., Pythium sp., Sclerotinia sp.

Пример 4. Биопрепарат для защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста на основе трех штаммов Trichoderma longibrachiatum: Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325, содержащий споры и фрагменты мицелия в готовом биопрепарате от 2×10⁹ до 4×10⁹ КОЕ/см³

Процесс получения биопрепарата состоит из следующих стадий:

- выращивание маточной культуры на агаризованной среде в пробирках;

- получение посевного материала (выращивание в колбах первой генерации);

- получение биопрепарата (выращивание в колбах второй генерации).

Маточные культуры получают выращиванием исходных штаммов (Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325), в пробирках на скошенном солодовом агаре при температуре 28°С в течение 4-7 суток.

Для получения посевного материала суспензию спор указанных штаммов, смытую физиологическим раствором с поверхности скошенного солодового агара, засевают в количественном соотношении 1:1:1, в колбы со стерильной средой следующего состава (г/дм³ среды): K₂HPO₄ - 0,9, KH₂PO₄ - 0,6, NH₄Cl - 1,25, NaCl - 0,1, сахароза - 1,0, меласса - 40,0, MgSO₄ - 0,1, раствор микроэлементов по Федорову - 4 см³. Засевают с таким расчетом, чтобы получить не менее 1×10⁶ спор в 1 см³. Плотность засева определяют по камере Горяева. Первую генерацию культивируют на шейкере в течение 3 суток при температуре 28°С и 200-220 об/мин.

Биопрепарат получают путем засева колб с питательной средой следующего состава (г/дм³ среды): NH₄Cl - 1,5; KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄ - 2,0, NaCl - 1,0 CaCl₂ - 10,0, раствор микроэлементов по Федорову- 1,0 см³, меласса - 40,0. Посев, не менее 10% от объема среды, производят в асептических условиях, используя в качестве посевного материала препарат, выращенный в колбах первой генерации. Культивируют при 28°С на шейкере при 180-200 об/мин в течение 4-5 суток. Указанный способ позволяет получать биопрепарат, содержащий суспензию спор и фрагментов мицелия Trichoderma с концентрацией 2-4×10⁹ КОЕ/см³.

Пример 5. Использование биопрепарата для стимуляции роста растений и их защиты от фитопатогенов

Определение стимулирующих и защитных свойств биопрепарата, полученного по примеру 4, проводили в модельных опытах по изучению его воздействия на всхожесть семян огурцов, томатов и пшеницы, а также рост и развитие их проростков на искусственном фитопатогенном фоне (Методы экспериментальной микологии (справочник) / [И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А Эланская и др. под ред. В.И. Билай]. – Киев, Наукова думка. - 1982. - 551 с.). Для этого семена огурцов сорта Феникс 640, пшеницы сорта Заграва и томатов сорта Агата, предварительно простерилизованные раствором формалина и отмытые от стерилента (Практикум по агрохимии: учебное пособие. - 2-е изд., перераб. и доп. Под. ред. акад. РАСХН В.Г.Минеева. - М.: МГУ, 2001 г. - С. 248-258.), раскладывали в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу и обрабатывали 10 мл суспензии спор фитопатогенных грибов с таким расчетом, чтобы создать концентрацию спор не менее 1×10⁶ КОЕ/чашку

Семена в чашках обрабатывали согласно схеме опыта:

- контроль - отстоянная водопроводная вода;

- биопрепарат по примеру 4;

- суспензия спор Fusarium avenaceum;

- суспензия спор Fusarium sporotrichioides;

- суспензия спор Cladosporium cucumerinum;

- суспензия спор Fusarium ауепасеит + 1 мл/чашку биопрепарата, полученного по примеру 4;

- суспензия спор Fusarium sporotrichioides + 1 мл/чашку биопрепарата полученного по примеру 4;

- суспензия спор Cladosporium cucumerinum + 1 мл/чашку биопрепарата полученного по примеру 4;

Исследование всхожести проводили в трехкратной биологической повторности при средней выборке сто семян. Результаты представлены в таблице 1.

Изучение стимулирующего действия на рост и развитие растений исследовали методом, описанным в работе (Методы экспериментальной микологии (справочник) / [И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А Эланская и др. Под ред. В.И. Билай]. – Киев, Наукова думка. - 1982. - 551 с.). Для этого в простерилизованную почву, согласно представленной выше схеме вносили суспензию спор фитопатогенов (до титра 0,5×10⁶ КОЕ/г почвы) и высаживали 3-суточные проростки огурцов сорта Феникс 640, пшеницы сорта Заграва и томатов сорта Агата, корневую систему которых предварительно обрабатывали выдерживанием в течение 6 часов в биопрепарате, полученном по примеру 4 (опыт), или отстоянной водопроводной воде (контроль). Опыт проводили в трехкратной биологической повторности по 30 растений в каждой группе. Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Как видно из данных таблиц 1 и 2, биопрепарат, полученный по примеру 4 и содержащий споры и фрагменты мицелия Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325, по сравнению с контролем, оказывал стимулирующее действие на всхожесть семян и рост растений различных сельскохозяйственных культур. Стимулирующий эффект заключался в увеличении процента всхожести семян и увеличении линейных размеров растений различных сельскохозяйственных культур по сравнению с контролем - семенами и растениями, обработанными водой. Как следует из данных таблиц 1 и 2, биопрепарат, приготовленный по примеру 4, кроме стимулирующего действия оказывал также защитное действие при проращивании семян на фоне действия фитопатогенных грибов рода Fusarium и Cladosporium (всхожесть возрастала на 4-15% по сравнению с необработанными биопрепаратом семенами). Обработка корневой системы проростков, перед высадкой их в почву, содержащую споры фитопатогенных грибов, также оказывала защитное действие - высота обработанных биопрепаратом растений возрастала на 0,5-24%.

Биопрепарат обладает антагонистической активностью против грибов рода Fusarium, Phoma, Alternaria, Cladosporium, Phytophthora, Peronospora, Botrytis, Ascochyta, Helminthosporium, Rhisoctonia, Pythium, Sclerotinia и др. Применение биопрепарата для обработки семян на искусственном фитопатогенном фоне повышает всхожесть семян, а также ускоряет рост проростков, положительно влияет на высоту надземной части растений различных сельскохозяйственных культур. Предлагаемый способ совместного культивирования трех штаммов Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325 позволяет получать биопрепарат для стимуляции роста растений и их защиты от фитопатогенов с концентрацией спор и фрагментов мицелия Trichoderma longibrachiatum в пределах от 2×10⁹ до 4×10⁹ КОЕ/см³.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для создания биозащиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста. Группа изобретений включает: штаммы гриба вида Trichoderma longibrachiatum (3 варианта); биопрепарат для стимулирования роста растений и их защиты от фитопатогенов на основе этих штаммов и способ получения этого биопрепарата. Штаммы гриба Trichoderma longibrachiatum депонированы в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационными номерами: RCAM 03324, RCAM 03323, RCAM 03325 соответственно. Биопрепарат содержит споры и фрагменты мицелия указанных штаммов от 2×10⁹ до 4×10⁹ КОЕ/см³; обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium и Cladosporium. Способ получения биопрепарата предусматривает двухстадийное совместное культивирование штаммов в количественном соотношении 1:1:1 последовательно на двух питательных средах в течение 4-5 суток. Данная группа изобретений обеспечивает увеличение всхожести семян на 4-15% и увеличение линейных размеров растений на 0,5-24%. 5 н.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

1. Штамм гриба Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324 для производства биопрепарата защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста.

2. Штамм гриба Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 для производства биопрепарата защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста.

3. Штамм гриба Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325 для производства биопрепарата защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста.

4. Биопрепарат для защиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста на основе трех штаммов Trichoderma longibrachiatum: Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325, содержащий споры и фрагменты мицелия в готовом биопрепарате от 2×10⁹ до 4×10⁹ КОЕ/см³.

5. Способ получения биопрепарата на основе штаммов Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03324, Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03323 и Trichoderma longibrachiatum ФГБНУ ВНИИСХМ RCAM 03325, отличающийся тем, что биопрепарат получают двухстадийным совместным культивированием штаммов в количественном соотношении 1:1:1 на питательных средах следующего состава:

первая стадия (среда 1, г/дм³ среды): K₂HPO₄ - 0,9, KH₂PO₄ - 0,6, NH₄Cl - 1,25, NaCl - 0,1, сахароза - 1,0, меласса - 40,0, MgSO₄ - 0,1, раствор микроэлементов по Федорову - 4 см³, в течение 3 суток;

вторая стадия (среда 2, г/дм³ среды): NH₄Cl - 1,5; KH₂PO₄ - 2,0, MgSO₄ - 2,0, NaCl - 1,0, CaCl₂ - 10,0, раствор микроэлементов по Федорову - 1,0 см³, меласса - 40,0, в течение 4-5 суток.