СТРЕПТОМИЦИНУСТОЙЧИВЫЙ ШТАММ Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - ПРОДУЦЕНТ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ Российский патент 2010 года по МПК C12N9/22 C12N9/54 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, устойчивого к стрептомицину продуценту щелочной внеклеточной рибонуклеазы.

Бактериальная щелочная внеклеточная рибонуклеаза может быть использована в биоорганической химии и молекулярной биологии в качестве реактива для изучения структуры и функции белков, синтезе олигонуклеотидов, в генной инженерии при выделении плазмид и генов (1), а также в медицине как противовирусный (2-4) и противоопухолевый препарат (5).

Известно, что наиболее активными в отношении синтеза внеклеточной щелочной рибонуклеазы являются различные микроорганизмы из группы бацилл, в частности различные штаммы Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus. Bacillus asterosporus (6). Однако известные штаммы обладают недостаточно высокой активностью синтеза внеклеточной щелочной рибонуклеазы.

Ближайшим известным аналогом изобретения является штамм Bacillus intermedius 7p - продуцент щелочной внеклеточной рибонуклеазы (7). При культивировании на среде, содержащей 0,5% глюкозы, 2% пептона, 0,24% Трис, 0.3% NaCl, 0.03% MgSO₂*7H₂O, 0.01% CaCl₂*2Н₂О, 0.01% MnSO₄, pH 7.5, указанный штамм продуцирует внеклеточную щелочную рибонуклеазу с активностью 2000-2500 единиц.

Однако недостатком данного штамма является отсутствие устойчивости к антибиотикам, что значительно затрудняет хранение штамма и подготовку посевного материала для инокуляции в условиях производства.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является получение нового стрептомицинустойчивого штамма Bacillus, отличающегося устойчивостью к различным дозам стрептомицина (от 10 до 500 мкг/мл) и значительно повышенной по сравнению с аналогом рибонуклеолитической активностью.

Техническое решение, которое может быть получено при осуществлении изобретения, заключается в получении штамма, обладающего повышенной способностью синтеза внеклеточной щелочной рибонуклеазы, устойчивого к высоким дозам стрептомицина.

Сущность объекта изобретения - штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - устойчивый к стрептомицину продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика под номером В-9862.

Штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 был получен методом клонирования штамма Bacillus intermedius 7p на среде, содержащей стрептомицин, и последующего трехступенчатого отбора колоний с наибольшим уровнем устойчивости к стрептомицину и высокой продуктивностью в отношении рибонуклеазы.

Характеристика штамма

Морфологические признаки

Величина клеток односуточной культуры на мясо-пептонном бульоне 3-6*0,9 мкм. Клетки палочковидные, в основном одиночные, реже соединены в короткие цепочки, подвижные, перитрихи, грамположительные. Образуют овальные споры, не превышающие диаметра клеток.

Культуральные признаки

Мясо-пептонный агар (24 часа, 30°С). Блестящие, тестообразные полупрозрачные слегка выпуклые колонии с ровными краями, пигмента не образует.

Мясо-пептонный бульон (24 часа, 30°С). В процессе роста среда мутнеет, появляется осадок. Пленка на поверхности не образуется.

Физиологические признаки

Аэроб, оптимальная температура роста - 32-37°С, pH оптимум проста - 9.0-9.2. Молоко пептонизирует и свертывает. Желатин разжижает. Крахмал гидролизует. Глюкозу, сахарозу, лактозу усваивает с образованием кислоты без выделения газа. Слабо растет на синтетических средах. Восстанавливает нитраты. Активность внеклеточной фосфомоноэстеразы и фосфодиэстеразы остается на уровне родительского штамма, активность щелочной внеклеточной рибонуклеазы выше, чем у родительского штамма в 5-6 раз. Основной метод хранения штамма - метод лиофилизации. Штамм может храниться без потери полезных свойств при комнатной температуре на косяках с агаризованной средой, содержащей стрептомицин в концентрации 500 мкг/мл.

Активность внеклеточной щелочной рибонуклеазы определялась по кислоторастворимым продуктам гидролиза РНК (8). За единицу активности фермента принимали то количество, которое вызывает увеличение оптической плотности на единицу за 1 час инкубации в пересчете на 1 мл раствора фермента.

Изобретение иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ним.

Пример 1. Выделение штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862

Культуру 7р выращивают на среде 1 следующего содержания: 1% глюкозы, 2% пептона, 0.03% MgSO₄*7H₂O, 0.03% CaCl₂*2Н₂О, 0.01% MnSO₄, pH 8.5. Культивирование проводят на вибростенде (2-3 с^-1). При температуре 30+/-1°С. Соотношение среда в колбе : воздух - 1:7.5. Выращивание проводят в течение 24 часов. Инокулят центрифугируют, осадок клеток суспендируют в 1 мл свежей питательной среды и высевают на агаризованную среду 2 следующего состава: 2% агар-агар, 1% глюкозы, 2% пептона, 0.03% MgSO₄*7H₂O, 0.03% CaCl₂*2H₂O, 0.01% MnSO₄. Чашки с агаризованной средой инкубируют в термостате при температуре 30+/-1°С. Выросшие через 18 часов колонии проверяют на рибонуклеазную активность методом кислотной преципитации в агаре продуктов гидролиза рибонуклеиновой кислоты (8). С этой целью колонии со среды 2 методом реплик переносят на 2 чашки Петри: первая чашка содержит среду 2 с добавлением 2 мг/мл РНК, вторая - среду 2 с добавлением стрептомицина (10-500 мкг/мл). Через 18-24 часа инкубации чашек в термостате при температуре 30+/-1°С, чашку. Содержащую питательную среду с РНК заливают 1М раствором соляной кислоты. РНКазную активность определяют по величине зон просветления агара, содержащих кислоторастворимые продукты гидролиза РНК. Отбирают колонии, имеющие зоны просветления, большие, чем у исходного штамма, и выросшие на среде с антибиотиком.

Процедуру отбора устойчивых к стрептомицину клонов повторяют трижды на средах, содержащих 10, 250 и 500 мкг/мл стрептомицина соответственно.

После третьего этапа был выделен штамм, устойчивый к стрептомицину в концентрации 500 мкг/мл и обладающий рибонуклеолитической активностью в 6 раз выше, чем штамм 7р.

Пример 2. Использование штамма Bacillus sp. BKПM B-9862 в качестве устойчивого к стрептомицину продуцента рибонуклеазы.

Лиофильно высушенную культуру Bacillus sp. BKПM B-9862 высевают на среду 2, содержащую 500 мкг/мл стрептомицина и выращивают на вибростенде (2-3 с^-1) при температуре 30+/-1°С в течение 22-24 часов, соотношение среда в колбе:воздух - 1:7,5, исходный pH среды 8.5. Рибонуклеолитическую активность в культуральной жидкости определяют модифицированным методом Анфинсена по кислоторастворимым продуктам гидролиза РНК (8). Реакционную смесь из 0.1 мл культуральной жидкости, 0.5 мл раствора РНК (2 мг/мл) и 0.4 мл 0.25 М Трис-HCl буфера (pH 8.5) инкубируют 15 мин при температуре 37°С. Реакцию останавливают добавлением 0.2 мл охлажденного 0.75% раствора уранилацетата в 25% HCl. Выдерживают реакционную смесь на льду 10 минут и удаляют осадок центрифугированием. Параллельно ставят контрольные пробы на поглощение субстрата (вместо культуральной жидкости добавляют 0.1 мл дистиллированной воды) и поглощение фермента (вместо р-ра РНК добавляют 0.5 мл дистиллированной воды). Из надосадочной жидкости отбирают 0.2 мл раствора, разводят дистиллированной водой в 20 раз и спектрофотометрически измеряют оптическую плотность при длине волны 260 нм. Рибонуклеазную активность в пробах определяют по формуле:

А₂₆₀=(А_{260пробы}-∑А_{260контролей})*4*10*1.2*20,

где А₂₆₀ - активность РНКазы, выраженная в условных единицах, означающая прирост оптической плотности в опытных пробах за 1 час инкубации на 1 мл культуральной жидкости (опт.ед./мл*час);

А_{260пробы} - оптическое поглощение опытной пробы;

∑А_{260контролей} - сумма оптических плотностей контрольных проб;

4 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации;

10 - коэффициент пересчета на 1 мл культуральной жидкости;

1.2 - коэффициент разведения при осаждении проб осадителем;

20 - коэффициент разведения для измерения на спектрофотометре.

Результаты определения величины и стабильности рибонуклеазной активности штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862 по сравнению с родительским штаммом представлены в таблице.

  Стабильность штаммов Bacillus intermedius 7p и Bacillus sp. ВКПМ В-9862 по продукции внеклеточной рибонуклеазы Номер ферментации Рибонуклеазная активность, ед*10³/мл в час Bacillus intermedius 7p Bacillus sp.ВКПМ В-9862 1 36 200 2 32 190 3 30 170 4 24 180 5 28 200

Из данных таблицы видно, что активность щелочной внеклеточной рибонуклеазы штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862 в 6 раз выше, чем у штамма Bacillus intermedius 7p, и остается на таком уровне в течение 5 ферментаций (срок наблюдения). При этом рибонуклеазная активность в культуральной жидкости штамма варьирует от 170 до 200 тыс. единиц при культивировании в указанных условиях. Таким образом, предел активности штамма составляет 170 тыс. единиц, что в 4.6 раза выше, чем максимальная активность ближайшего аналога.

Таким образом, полученный штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 отличается от ближайшего аналога способностью расти на среде со стрептомицином и имеет колонии, отличающиеся по морфологии от исходного штамма - полупрозрачные.

Использование штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862 в качестве стрептомицин-устойчивого продуцента щелочной внеклеточной рибонуклеазы позволит устранить возможность загрязнения культуры посторонней микрофлорой в период хранения штамма и подготовки инокулята для ферментации в условиях производства. Возможность добавления антибиотика в питательные среды для хранения культур позволит получить однородную популяцию продуцента. Использование штамма Bacillus sp.ВКПМ В-9862 для получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы позволит увеличить активность получаемого за период одной ферментации фермента на 200-300% по сравнению с культивированием на той же среде штамма Bacillus intermedius 7p. Бациллярная рибонуклеаза является перспективным препаратом для терапии опухолевых заболеваний, поскольку она проявляет избирательную токсичность в отношении малигнизированных клеток, не обладает иммуногенностью и не подвержена инактивации в клетках млекопитающих (5, 9).

Литература

1. Castanotto D. Biological and functional aspects of catalytic RNAs. / D.Castanotto, J.J.Rossi, J.O.Deshler // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. - 1992. - V.2. - N.4. - P.331-357.

2. Алексеева И.И. Противовирусная активность модифицированных РНКаз / И.И.Алексеева, Б.М.Куриненко, Г.А.Пензикова, М.Г.Орешина // Антибиотики. - 1982. - Вып.4. - С.21-28.

3. Грибенча С.В. Противовирусная активность РНКазы Bacillus intermedius в экспериментах на мышах линии СВА, предварительно зараженных вирусом бешенства. / С.В.Грибенча, Л.А.Поцелуева, И.Ф.Баринский, Т.Г.Баландин, С.М.Деев, И.Б.Лещинская // Вопросы вирусологии. - 2004. - №6. - С.38-41.

4. Шнейдер М.А. / М.А.Шнейдер, Е.Б.Штильбанс, Э.Г.Куприянов и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. - Т.35. - Вып.3. - С.27-31.

5. Зеленихин П.В. Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой. / П.В.Зеленихин, А.И.Колпаков, Г.В.Черепнев, О.Н.Ильинская // Молекулярная биология. - 2005. - Т.39. - №3. - С.457-463.

6. Юсупова О.И. Ферменты микроорганизмов. / О.И.Юсупова // М.: Наука. - 1973. - 163 с.

7. Авторское свидетельство СССР 587156. Опубл. 11.01.1978.

8. Лещинская И.Б. Методы определения активности нуклеаз и родственных ферментов. / И.Б.Лещинская, Н.П.Балабан, М.Н.Капранова, И.А.Голубенко. // Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов. - Казань. - 1980. - С.53-60.

9. Зеленихин П.В. Биназа не индуцирует поликлональный Т-клеточный ответ. / П.В.Зеленихин, Г.В.Черепнев, Ф.Керн, О.Н.Ильинская // Доклады Академии Наук. - 2006. - Т.407. - №3.

Изобретение касается микробиологической промышленности и может быть использовано в биотехнологии, генетической инженерии и медицине. Штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - высокостабильный продуцент щелочной внеклеточной рибонуклеазы, обладающий высокой устойчивостью к стрептомицину, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика под номером В-9862. Изобретение позволяет избежать микробиологического загрязнения в период хранения и подготовки посевного материала для ферментации в условиях производства и повысить выход внеклеточной рибонуклеазы. 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - стрептомицинустойчивый продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы.