Способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы @ @ @ Советский патент 1985 года по МПК C12N9/22 

&9 00 U

Изобретение относится к ферментной промьшшенности и касается получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы.

Известен способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы, пре- 5 дусматривающий культивирование щтаммапродуцента Bacillus intermedius 7р

Известен способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы из культуральной жидкости Bacillus interme- О dius 7р в присутствии стимуляторов роста бактерий-дрожжевого экстракта или кислотного экстракта витамина В, кормового 2.

Однако известные способы характе- 15 ризуются невысоким .выходом фермента, при этом активность рибонуклеазы в культуральной жидкости за счет, увеличения урожая клеток повышается всего на 33-44% и достигает 5,0x10 20 условных единиц.

Наиболее близким к изобретению техническим решением является способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы Bacillus intermedius 7р пу- 25 тем культивирования продуцента на пительной среде, содержащей пептон,глюкозу и минеральные соли, стимуляции актиномицином Д синтеза внеклеточной рибонуклеазы Bacillus subtil is

Однако известный способ связан лишь со снятием репрессирующего дей- ствия фосфора на синтез рибонуклеазы. В среде без фосфатов стимуляция синтеза фермента не наблюдается. 35

Цель изобретения - увеличение активности фермента в культуральной жидкости.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения ще- 0 очной внеклеточной рибонуклеазы acillus intermedius 7р , предусмативающему культивирование продуцента на питательной среде, содержащей пептон, глюкозу и минеральной соли, в 5 культурапьную жидкость вносят дактиноицин в количестве 0,075-0,125 мкг/мл через 6-7 ч от начала культивирования в фазе замедления роста микробной популяции.5®

Сущность изобретения состоит в том, что активный синтез щелочной внеклеточной рибонуклеазы Bacillus inermedius Jp начинается по окончании экспериментального роста культуры, 55 т.е. в начальной стадии фазы замедления роста, а внесение дактиномицина менно в этот период .будет существенно стимулировать синтез фермента. Фаза замедления ростахарактеризуется падением удельной скорости роста при продолжающемся увеличении биомассы культуры (исследовано влияние внесения дактиномицина в дозах от 0,025 до 0,15 мкг/мл на 4,6 и 8 ч культизирования; 4-й час культивирования соответствует станции экспоненциального роста культуры, 6-й и 8-й часыфазе замедления роста).

Влияние концентрации дактиномицина и времени его внесения на биосинтез РНКазы Bacillus intermedius 7р приведено в табл. 1.

Как видно из табл. 1, наибольший стимулирующий эффект для всех доз датиномицина наблюдается при внесении его на шестой час культивирования. Максимальная стимуляция наблюдается при внесении 0,1 мкг/мл дактиномицина на 6-й час культивирования. При уменьшении и увеличении дозы антибиотика, а также при внесении его на более ранние или более поздние сроки стимулирующий эффект снижается.

На чертеже представлен график покзателей роста и накопления рибонуклеазной активности на контрольной среде.

, На графике обозначено биомасса .1, активность рибонуклеазы в культуральной жидкости 2, удельная скорость роста бактерий 3, удельная скорость накопления фермента 4.

На чертеже приведены показатели роста Bacillus intermedius 7р и накопления рибонуклеазной активности в культуральной жидкости на контрольной среде (не содержащей дактиномицина), а также кривые удельной скорости роста культуры ( /и.) и удельной скорости накопления фермента (б).

Для уточнения координат оптимальной (наиболее эффективной) зоны действия дактиномицина (т.е. концентрации и времени внесения антибиотика) были поставлены эксперименты по полному факторному плану ПФЭ 3 с центром в точке с наилучшим выходом РНКазы (0,1 мкг/мл дактиномицина, время внесения - 6-й час культивирования) с суженными по сравнению с предьщущими экспериментами интервалами как по времени внесения, так и по концентрации. Эти результаты представлены в табл. 2. На основании только экспериментальных данных и результатов обсчета таблиц можно утверждать, что внесение дактиномицина в дозах от 0,075 до 0,125 мкг/мл в интервале от 6 до 7,5 ч позволяет получить РНКазную активность в культуральной жидкости не менее 200% от контроля. Пример 1. Среду, содержащую г/л: пептон 20,0; глюкоза 10,0, CaC 0,1; 7Н20 0,3j NaCl 3,0 MnSO 0,1} рН перед стерилизацией 8,3-8,4 засевают 1% 24-х часового инокулята полученного при выращивании Bacillus intermedius Jp на среде того же состава. По мере культивирования определяют урожай клетоки активность рибонуклеазы в среде. По этим данным рассчитывают удельную скорость роста ((JL) и удельную скорость накопления рибонуклеазы (Е). По дости жении стадии замедленного роста (6 ч вносят дактиномицин в количестве 0,075 мкг/мл. Пример 2. Культивирование введут аналогично примеру 1, но дак тиномицин вносят в концентрации 0,1 мкг/мл. Пример 3. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактин мицин вносят в количестве 0,125 мкг/мл Пример 4. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактиномицин в количестве 0,1 мкг/мл вн сят не на 6-йi а на 4,5-й ч культивирования. Пример 5. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактиномицин в количестве 0,1 мкг/мл вносят на 7,5 ч культивирования. В табл. 2 представлены значения рибонуклеазной активности при введе нии дактиномицина в культуральную жидкость в разное время. 1 14 Как видно из данных табл. 2, оптимальным сроком внесения всех доз дактиномицина является 6-й час культивирования. Максимальная активность достигается при внесении дактиномицина в количестве 0,1 мкг/мл. Оптимальное время внесения дактиномицина (6-й час культивирования) характеризуется замедлением, удельной скорости роста культуры (т.е. начинается стадия замедления роста) и возрастанием удельной скорости синтеза рибонуклеазы. Внесение дактиномицина в более ранний срок не приводит к стимуляции синтеза рибонуклеазы, а в более поздний приводит к меньшей стимуляции синтеза фермента. Рост культуры дактиномицином подавляется . Ингибиторный зффект увеличивается с увеличением дозы антибиотика и уменьшением срока культивации бактерий. Таким образом, можно утверждать (с надежностью 95Z), что уровень , активности более 300% от контроля достигается при внесении дактиномицина в дозе Оу1 мкг/мл в интервале времени культивирования 5,5-7 ч, более 250% - в дозах 0,075-0,125 мкг/мп от 5 ч. 40 мин до 6 ч 40 мин, более 200% - в тех же дозах от 5 ч 15 мин до 7ч 10 мин, т.е. внесение дактиномицина на 4,5 ч культивирования во время экспоненциального роста культуры, не вызывает заметной стимуляции активности, а даже снижает ее при внесении дактиномицина в дозе 0,10,125 мкг/мл. Внесение дактиномицина в дозе 0,1-0,125 мкг/мл в начале стадии замедления роста (между 6 и 7,5 ч культивирования), т.е. до достижения максимального значения удельной скорости синтеза фермента, приводит к стимуляции синтеза РНКазы не менее, чем в два раза.

Время внесения,

Доза дактиноиицина, мкг/мл ч

4 6 8 4 6 8 4 6 8 4 6 8

РНКазная активность, 24-часовorо культивирования , V , %

1,2

7,9

11,8

3,9

10,1

9,6

10,6

0,2

3,4

4,3

0,3

3,3

2,7

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ВНЕ1ШЕТОЧНОЙ РИБОНУКПЕАЗЫ BACILLUS INTEIttffiDIUS 7P, предусматривающий культивйрование продуцента на среде, содержащей пептон, глюкозу и минеральные соли,, о т л и чаю щи йс я тем, что, с целью увеличения активности фермента, в культуральную жидкость вносят дактиномицин в количестве 0,075-0,125 мкг/мл через 67,5 ч от начала культивирования в фазе замедления роста микробной популяции.