ШТАММ Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082 - ПРОДУЦЕНТ ЛИНКОМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИНКОМИЦИНА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента антибактериального антибиотика линкомицина и способа его получения.

Антибиотик линкомицин эффективен при лечении заболеваний, вызванных грамположительной микрофлорой и не поддающихся лечению другими антибиотиками. Особенно эффективен линкомицин при лечении остеомиелитов, поскольку антибиотик избирательно накапливается в костной ткани. Линкомицин эффективен в отношении метициллин-резистентных штаммов стафилококков и является ценным препаратом для лечения тяжелых травматических и гнойно-септических больных. Линкомицин является также сырьем для получения терапевтически более активного полусинтетического препарата клиндамицина.

Известен штамм №1146 Actinomyces roseolus - продуцент антибиотика линкомицина [1]. Недостатком данного штамма является фагочувствительность и низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент линкомицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей ⁶⁰Co на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин, рифамицин и блеомицин в качестве селективных агентов.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером S-1082.

Штамм 1082 обладает повышенной продуктивностью линкомицина (4800 мкг в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКПМ S-1082. Температура 28°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культуры штамма, выращенной на минеральном агаре №1 Гаузе. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица 1).

Морфологические признаки. Спороносцы прямые, цепочки спор прямые, споры овальные с гладкой поверхностью.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С, и в диапазонах значений pH (6,0-9,0) с оптимумом pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу, арабинозу, ксилозу, инозит; фруктозу, лактозу, галактозу, сахарозу, рамнозу; слабо использует маннит и рафинозу.

Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или в виде зрелой культуры на агаровой среде под вазелиновым маслом при (5-7)°С.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий Stapylococcus aureus INA 00985 (=209 P), Bacillus subtilis ATCC 6533, Bacillus mycoides 537, Micrococcus luteus ATCC 9341. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит. К вирулентному фагу штамма устойчив.

Штамм S-1082 поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces roseolus S-1082 выращивают в течение (7-10) суток при 37°С на агаровой среде №2 Гаузе следующего состава, %:

Триптон 0,3 Пептон 0,5 Глюкоза 1,0 Натрий хлористый 0,5 Агар 3,0 Вода Водопроводная рH до стерилизации 7,0-7,2

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,6 атм при 120°С.

Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на среду следующего состава, %:

Крахмал 1,0 Гороховая мука 1,5 Сульфат аммония 0,3 Кальция карбонат 6,5 Натрий хлористый 0,5 Вода Водопроводная pH до стерилизации 7,0-7,2

Посевной материал выращивают при 28°С в течение 48 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки (200-240) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - 5%.

Ферментация проводится на качалке при 28°С на среде (50 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:

Сахароза 5,0 Кукурузный экстракт 1,0 Соевая мука 2,0 K₂HPO₄ 0,1 NaCl 0,3 CaCO₃ 0,5 Вода Водопроводная pH до стерилизации 7,2

Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633.

Содержание линкомицина в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации (через 144 часа) составляет 4800 мкг/мл.

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является фагоустойчивость и более чем в 8 раз повышенная продуктивность, а именно - содержание линкомицина в культуральной жидкости штамма-прототипа - 558 мкг/мл, а в заявленном штамме - 4800 мкг/мл.

С целью выделения линкомицина проводят его экстракцию н-бутанолом из нативного раствора (обработанной щавелевой кислотой и отфильтрованной культуральной жидкости штамма-продуцента Streptomyces roseolus S-1082) с pH=10,0 с последующим переводом линкомицина в водный раствор соляной кислоты и реэкстракцией н-бутанолом. Бутанольный экстракт с добавлением 2 н. раствора хлористого водорода в ацетоне при pH=2,0 концентрируют и линкомицин кристаллизуют в форме гидрохлорида.

Линкомицина гидрохлорид, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptomyces roseolus S-1082, представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, метаноле, ограниченно - в этаноле и нерастворим в других органических растворителях. По физико-химическим свойствам, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует требованиям ВФС. Брутто-формула: C₁₈H₃₄N₂O₆S·HCl. Мол. масса 443.04 а.е.м.

Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=407(MH)⁺

ИК-спектр (KBr), λ_max, см^-1: 3440, 3330, 3280, 3040, 3015, 2940, 2910, 2860, 1672, 1657, 1566, 1475, 1459, 1445, 1409, 1358, 1263, 1230, 1207, 1143, 1107, 1092, 1078, 1044, 996, 963, 906, 871, 802, 738, 718;

Выход готового продукта - линкомицина гидрохлорида - составляет 42% от содержания линкомицина в культуральной жидкости продуцента.

Таким образом, создан новый мутантный штамм Streptomyces roseolus S-1082, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования, которая более чем в 8 раз превосходит активность штамма-прототипа №1146 Actinomyces roseolus. Антибиотическая активность нового штамма составляет 4800 мкг/мл. Использование нового штамма Streptomyces roseolus S-1082 как продуцента для биосинтеза линкомицина позволяет увеличить выход целевого продукта при выделении линкомицина из культуральной жидкости экстракцией н-бутанолом с последующим переводом в водную фазу, вторичной экстракцией н-бутанолом и кристаллизацией в форме гидрохлорида.

ЛИТЕРАТУРА

1. SU, авторское свидетельство СССР №287743 A1 от 1975 г.

Таблица 1. Культурально-морфологические признаки штамма Streptomyces roseolus S-1082 Агаровая среда Рост воздушного мицелия Цвет мицелия Растворимый пигмент Воздушного Субстратного №1 Гаузе +++ Белый (Д-1) Бесцветный Нет Овсяная +++ Белый (Д-1) Бесцветный Нет Чапека +++ Белый (Д-1) Бесцветный Желтоватый Глюкозо-аспарагиновая +++ От белого (Д-1) до желтоватого (Ж-1) Желтый (Ж-6) Желтоватый (Ж-6) Линденбайна (глицерин-нитратная) ++ Белый (Д-1) Бесцветный Желтоватый (Ж-6) Глюкозо-нитратная №2 Гаузе + Белый (Д-1) Бесцветный нет Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом) Меланоидные пигменты не образует */+++ - хороший; ++ - умеренный; + - слабый.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве антибактериального антибиотика линкомицина гидрохлорида, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми, и некоторыми анаэробами. Способ предусматривает культивирование штамма Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082, продуцента линкомицина на питательной среде заданного состава, экстракцию линкомицина органическими растворителями из нативного раствора, реэкстракцию линкомицина с последующим выделением. Полученный экстракт концентрируют и кристаллизуют с получением линкомицина в форме гидрохлорида. Изобретение позволяет повысить выход линкомицина. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082 - продуцент линкомицина.

2. Способ получения линкомицина, предусматривающий культивирование штамма Streptomyces roseolus ВКПМ S-1082, экстракцию линкомицина органическими растворителями из нативного раствора, реэкстракцию линкомицина с последующим его выделением, концентрацией и кристаллизацией в форме гидрохлорида.