Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы @ @ @ Советский патент 1983 года по МПК C12N9/22 C12N1/20 

Изобретение относится к получению ферментов, в частности внеклеточной щелочной рибонуклеааы микробиологическимпутем, и может найти применение в меди цине, пищевой прсмышленности и производ ,стве реактивов для мапекул5фной биологии и биоорганической химии. Известен штамм BttciPBus intermedins 7р продуцент щелочной внеклеточной рибонуклеаэы, обладающий активностью 2ООО-2500 ел. полученной культивированием продуцента на среде определенного состава, Рибонуклеазная активность в заводских условиях после 20 ч 15ультивирования 10000 ед. t. Известен способ пол чения г могегшой щелочной внеклеточной рибонуклеазы Boici US tntertnedlms 7р включающий глубинное культивирование продуцента на ереде, содержащей источник углерода - глюкозу, источник азота - пептон и минераль ные соли, коагуляцию биомассы и кислых белков подкислением до рН 2,5-3,О, осаж дение белка сульфатом аммония при рН 8,5, фракционирование фермента на катио.ните, например, карбоксиметилцеллюлоза 21 Однако выход препарата фермента явля ется недостаточно высоким и составляет 6-7 мг на литр культуральной жидкости. Цель изобретения - повышение активности рибонуклеаз|.1 в культуральной жидкости и выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы 5aciB2u5 intermeiSins Ip включающий глубинное культвирование продуцента на питательной среде содержащей источники углерода, азота, минеральные сопи, биостимулятор, коагуляцию биомассы и кислых белков подкисутением до рН 2,6-3,0, осаждение белка сульфатом аммония и фракционирование фермента .на фосфоцеллкиозе, в качестве биостимулятора исрользуют дрожжевой экстракт илИ кислотный экстракт продукта Витамин В-„кормовой в коли.чествах, соответственно равных 0,05 и 0,3 вес.% от среды. Сущность изобретения состоит в том, что из перечня известных биостимуляторов биосинтеза ферментов установлено .опытным путем, что единственными для данного продуцента, повышающими, активность щелочной внеклеточной рибонуклеазы, являются дрожжевой экстракт и кислотный экстракт витамина кормового в строго установленных количествах, В табл. 1 показана зависимость активности РНКазы и выхода биомассы от различнь Х биостимуляторов. Та.блица 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ШЕЛОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ BdciKPus interrned-lns IP, включающий глубинное культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, биостимулятор, коагуляцию биомассы и кислых белков подкисяением до рН 2,6-3,0, осаждение белка сульфатом аммония и фракционирование фермента на фосфоцеллюлозе, отличающийся тем, что, с цепью повышения активности рибонуклеаа в культурапьной жидкости и ВЫХОДИ целевого продукта, в качестве биостимулятора используют дрожжевой экстракт или кислотный экс-г тракт продукта Витамин кормовой (Л в количествах,, соответственно равных 0,05 и 0,3 вес.% от среды.

Контроль (среда с 2% семипалского пептона)

Кукурузный экстракт 1%

Кукурузный экстракт 3%

Тунгопептон 2%

Исходная среда + дрожжевой

экстракт 0,01%

0,05%

0,1%

Исходная среда + кислотный экстракт Витамин В.., кормовой 0,075%

0,15%

.100+ 1 144+ 2 230+ 1 2501 1

1331 2 1921 2 245± 3

1001 1 133 1 1 Как видно из табл. 1 использование кукурузного экстракта, который является комплексным источником органического азота, витаминов, минеральных элементов тов и пр. и широко используется для интенсификации процессов в кимробиоло- гической промышленности, а также тунгопептона - пептона растительного происхождения - приводит к увеличению урожая биомассы более чем в два раза) но резко снижает количество РНКазы в культуральной жидкости. И тоьлко введение дрожжевого экстракта и кислотного экстракта витамина В кормового (ГОСТ 18666-73) в указанных концентрациях {0,О5 и О,3 вес.%. соответственно) при водит к увеличению количества РНКазы в культуральной жидкости на 33-44%. Пример 1. В 150-литровый ферментер загружают 10О л среды следующего состава, %: глюкоза 1,0; пептон 2,0; СаСЙз 0,01; McgSO4-7H20 0,03; NaCP 0,3; Мп504 0,О1, рН 8,3 (до стерилизации). Среду засевают 2 4-часовым инокулятом (1%) полученным при выращивании BoDiKBus intermedins 7р на среде того же состава. Процесс ферментации ведется в течение 24 ч при 29°С. Выделение и очистку фермента ведут известным спо собом. Результаты представлены в табл.

Культурная жидкость

Фильтрат после подкисления и удаления осадка

Концентрат I (концентрирование на ротационном испарителе при 37 С)

10101254

Продолжение табл. 1

.щЗ

1003,6

1,3-10

993,5

1,3-101,3-10943,4 Пример 2. Культивирование и очистку фермента ведут аналогично примеру 1 с добавлением в среду 0,05 вес,% дрожжевого экскгракта. Результаты представлены в табл. 3, Пример 3, Культивирование и очистку фермента ведут аналогично при меру 1 с добавлением в среду 0,3 вес.% кислотного гидролизата витамина В KOf мового. Результаты представлены в табл,4. При культивировании BaciEPus interrriedins IP на средах с добавлением биостимуляторов наблюдается увеличение урожая клеток на 90% при добавлении в ере- ;ДУ дрожжевого экстрата и на 50% при добавлении в среду кислотного экстракта витамина . кормового, что приводит к повышению концентрации рибонуклеазы в среде на ЗО-40% или до 48-58 мг/л против 32-38 мг/л в контроле ( 1). При более высокой активности рибонуклеазы в культуральной жидкости процесс последующей очистки фермента происходит эффективнее, с меньшими потерями и выход готового продукта увеличивается в 2 раза. В табл. 2 представлены результаты выделения и очистки рибонуклеазы при культивировании Вас. intcrmedins 1р на контрольной среле (пример 1). Таблица 2

Сульфат -аммонвАная

12 ,0-Ю

(| а1шия (САФ)2,0

,91О

Диализат САФ4,5

После хроматографии на

ДЭА Э-иаолюпозе

23-10 9,4-10

Reanae 7,3

КониентратП(см. кон53-10 9,5-1О центрат J )3,0

Лиофилизированный про12-10 9,5-1О дукт 1130,0

После хроматографии на

27-10 2,6-10 фосфоцеллюлозе ReoinalE 4,0

После рехроматографии на фосфоцеллюпозе В табл. 3 показано вьщеление и очистка рибонуклеазы при культивировании Вас.

15-10 1,8-1О 28,О

Продолжение табл. 2

2,4 1,8

88

4,2 intermedln 1р на среде, содержащей дрожжевой экстракт (пример 2). Таблица 3

Сульфат-аммонийная фракция (САФ)1|8

4,-6

Диализат САФ

После хроматографии на ДЭАЭ-целлюпозе ReanotC

Концентрат И (см. кок. центрах I )

Лиофилизированнь1й продукт

После хроматографии на

|фосфоцеллюпозе(геап«е 9,0

I

После рехроматографии

В табл. 4 показано выделение, и очистка рибонуклеааы при культивировании ВЛС Itvkf.WlfC H .р

Культуральная жидкость

Фильтрат после подкисления и удаления осадка

Концентрат I (концентрирование на ротационном испарителе при )

8 , Продолжение га6л« 3

3,3-10

83 67

7,4-103 3.2

1,8-104

3,2

66 65 64

1,9-10 3.1

1,9-10 2,9

.1п5

4,9-10

48

на среде, содержащей кислотныйэкстракт витамина В ,г. кормового{пример 3). .. Таблица4

52-10 1,8-10 1005

50-10 1.8.10 97

5,0

16-io 1.8-10 95