СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ Ku-АНТИГЕНА В ЭКСТРАКТАХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии; и может быть использовано в медицине для определения в опухолевых клетках статуса системы репарации ДНК, направленной на исправление повреждений, вызванных ионизирующим излучением и лекарствами-радиомиметиками, в противораковой терапии. Для онкологических больных мониторинг активности этих систем позволит выбрать оптимальную стратегию лечения и оценить его перспективность. Основной мишенью при использовании ионизирующего излучения и лекарств-радиомиметиков в противораковой терапии различных типов опухолей является ДНК. Системы репарации ДНК, исправляя повреждения, могут снижать эффективность терапии, поэтому определение статуса систем репарации ДНК и механизмов регуляции этих процессов в опухолевых клетках может быть использовано в качестве предсказательного фактора при определении целесообразности использования радиотерапии и повышения эффективности такого воздействия.

Из-за сложности и динамичности систем репарации ДНК метод аффинной модификации представляется одним из наиболее плодотворных в исследовании сложных ансамблей белков. В применении к репарации ДНК его можно в общем виде представить следующим образом. Сначала белки образуют специфические нековалентные комплексы с химически активными ДНК, структурные особенности которых, например, присутствие разрывов или брешей, характерны для той или иной стадии процессов репарации или репликации ДНК; затем под воздействием определенного фактора происходит образование ковалентных связей ДНК-белок и ДНК-белковые конъюгаты подвергаются анализу. В состав ДНК можно вводить радиоактивную метку, что облегчает анализ и существенно повышает чувствительность метода. В качестве химически активных функций, обеспечивающих образование ковалентных связей с белком, могут быть использованы различные группы. Например, дезоксирибоза в составе апуринового/апиримидинового (АП) сайта.

Остатки дезоксирибозы в АП-сайтах находятся в равновесии циклической фуранозной и ациклической альдегидной форм. Благодаря присутствию альдегидных групп ДНК, содержащие АП-сайты реагируют с первичными аминогруппами белков, образуя основания Шиффа. В частности, основание Шиффа с ε-аминогруппами лизинов является промежуточным соединением, которое образуют некоторые ферменты эксцизионной репарации оснований (ЭРО) в процессе катализа [Boiteux S., Guillet M., DNA Repair, 2004, 3, 1-12; Piersen C.E., McCullough A.K., Lloyd R.S., Mutat. Res., 2000, 459, 43-53]. Образование основания Шиффа - обратимый процесс, однако связь белка с ДНК можно стабилизировать за счет восстановления боргидридом натрия (NaBH₄) [Piersen C.E., McCullough A.K., Lloyd R.S., Mutat. Res., 2000, 459, 43-53; Левина Е., Бавыкин С., Шик В. и др., Биохимия, 1980, 45, 1133-1145]. Такой способ ковалентного присоединения белков к нуклеиновой кислоте приводит к формированию стабильных продуктов, устойчивых в условиях последующего анализа конъюгатов белок-нуклеиновая кислота, что позволяет использовать ДНК, содержащие АП-сайт, в качестве инструмента исследования.

Одним из основных факторов, отвечающим за радиорезистентность клеток, считается эффективность системы репарации двухцепочечных разрывов [Doherty A.J., Jackson S.P., Curr. Biol., 2001, 11, R920-R924; Downs J.A., Jackson S.P., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2004, 5, 367-378]. В клетках высших эукариот этот процесс осуществляется преимущественно за счет негомологичного соединения концов ДНК (nonhomologous end joining, NHEJ) [Doherty A.J., Jackson S.P., Curr. Biol., 2001, 11, R920-R924; Downs J.A., Jackson S.P., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2004, 5, 367-378]. Ключевым белком, без которого не может происходить этот процесс, является Ku-антиген.

Ku-антиген - эукариотический гетеродимерный ДНК-связывающий комплекс, состоящий из двух субъединиц с молекулярными массами около 70 кДа (Ku70) и 83 кДа (Ku80). Ku-антиген участвует во множестве клеточных процессов: сохранении целостности теломерных концов, обеспечении изменчивости генов (V(D)J-рекомбинация), регуляции апоптоза и транскрипции некоторых генов, ответе на тепловой шок и регуляции клеточного цикла [Gullo C., Au M., Feng G. et al., Biochim. et Biophys. Acta, 2006, 1765, 223-234; Downs J.A., Jackson S.P., Nat. Rev. Mol. and Cell. Biol., 2004, 5, 367-378; Dynan V.S., Yoo S., Nucleic Acids Res., 1998, 26, 1551-1559]. Однако основная функция этого белка связана с репарацией двухцепочечных разрывов ДНК путем негомологичного соединения концов ДНК. Ku-антиген, наряду с каталитической субъединицей, входит в состав ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК). Каталитическая субъединица (ДНК-ПКкс) способна связываться с концами ДНК, но основная ДНК-связывающая функция обеспечивается Ku-антигеном, который примерно в 100 раз увеличивает сродство ДНК-ПКкс к ДНК [Downs J.A., Jackson S.P., Nat. Rev. Mol. and Cell. Biol., 2004, 5, 367-378; Dynan V.S., Yoo S., Nucleic Acids Res., 1998, 26, 1551-1559]. Во время репарации ДНК Ku-антиген как тиски зажимает и удерживает рядом концы ДНК, помогая сборке комплекса, который осуществляет репарацию ДНК и содержит ДНК-лигазу IV, XRCC4 и другие белки [Gullo C., Au M., Feng G. et al., Biochim. et Biophys. Acta, 2006, 1765, 223-234; Downs J.A., Jackson S.P., Nat. Rev. Mol. and Cell. Biol., 2004, 5, 367-378; Dynan V.S., Yoo S., Nucleic Acids Res., 1998, 26, 1551-1559]. Клетки, лишенные Ku-антигена, проявляют повышенную чувствительность к действию ионизирующего излучения и лекарств-радиомиметиков [Gullo C., Au M., Feng G. et al., Biochim. et Biophys. Acta, 2006, 1765, 223-234].

Известные способы, применяемые для детекции Ku-антигена, основаны на иммунохимических подходах [Harima Y., Sawada S., Miyazaki Y. et al., Am. J. Clin. Oncol., 2003, 26, e80-e85; Komuro Y., Watanabe T., Hosoi Y. et al. Cancer, 2002, 95, 1199-1205; Mazzarelli P., Rabitti С., Parrella P. et al., J. Invest. Dermatol., 2003, 121, 628-633; Friesland S., Kanter-Lewensohn L., Tell R. et al., Head Neck, 2003, 25, 313-321], однако отличаются трудоемкостью и дороговизной, а также требуют специального оптического оборудования.

Наиболее близким к заявляемому способу-прототипу является способ детекции Ku-антигена путем задержки в геле нековалентных комплексов [³²Р]-меченый ДНК-дуплекс-Ku-антиген [Mazzarelli P., Rabitti C., Parrella P. et al., J. Invest Dermatol., 2003, 121, 628-633]. Для осуществления способа сначала готовят [³²Р]-меченый ДНК-дуплекс (56 п.о.), для чего вводят [³²P] в 5'-конец олигонуклеотида и получают ДНК-дуплекс, сплавляя радиоактивно меченый олигонуклеотид с комплементарным олигонуклеотидом.

Затем для детекции Ku-антигена белки клеточных экстрактов инкубируют 30 мин при комнатной температуре с [³²Р]-меченым ДНК-дуплексом (56 п.о.) в присутствии кольцевой плазмидной ДНК (pUC-19) для ингибирования связывания других клеточных белков с [³²Р]-меченым ДНК-дуплексом. Для подтверждения природы образовавшихся комплексов выполняют контрольный эксперимент. Перед проведением реакции связывания белки клеточных экстрактов инкубируют с антителами против Ku80 или Ku70 30 мин при комнатной температуре. Немедленно по окончании инкубации образцы подвергают анализу в неденатурирующем полиакриламидном геле. Гели высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой.

Недостатками прототипа являются:

1) образцы необходимо анализировать сразу после образования комплексов белков с ДНК из-за нестабильности комплексов;

2) высокая чувствительность к условиям проведения анализа образцов;

3) высокая стоимость эксперимента из-за необходимости каждый раз подтверждать природу образовавшихся комплексов с помощью антител и использования плазмидной ДНК.

Технической задачей изобретения является разработка способа, позволяющего детектировать Ku-антиген в экстрактах клеток различного происхождения, позволяющего проводить относительно дешевый анализ образцов через неограниченное время и нечувствительный к условиям проведения анализа.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем. Предварительно получают реагент, [³²Р]-меченый ДНК-дуплекс, содержащий АП-сайт, для чего осуществляют следующие стадии:

1) вводят [³²P] в 5'-конец олигонуклеотида (30-35 нт и содержащего dUMP в середине цепи) согласно [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., N.Y.: 2nd End. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989];

2) получают ДНК-дуплекс (30-35 н.п.), содержащий dUMP в середине одной из цепей, сплавляя радиоактивно меченый dUMP-содержащий олигонуклеотид с комплементарным олигонуклеотидом;

3) непосредственно перед детекцией удаляют остатки урацила с помощью урацил-ДНК-гликозилазы Е.coli.

Далее готовят реакционную смесь, включающую 0,05-0,2 мкМ [³²Р]-меченого ДНК-дуплекса (32 н.п.), содержащего АП-сайт и 5-25 мкг исследуемых белков экстракта из клеток человека и буферный раствор, содержащий 50 мМ трис-HCl (pH 7,5-8,0), 10-15 мМ ЭДТА, 40-60 мМ NaCl, 3-7% глицерин. Реакционную смесь инкубируют в течение 10-15 мин при температуре 35-37°С. Затем добавляют NaBH₄ до концентрации 20-30 мМ и проводят реакцию восстановления во льду 30-60 мин. Для разделения белковых компонентов проводят электрофорез в денатурирующих условиях в 10-15%-ном полиакриламидном геле согласно [Laemmli U.K., Nature, 1970, 277, 680-685]. Для оценки кажущейся молекулярной массы продуктов на том же геле определяют электрофоретическую подвижность маркерных белков известной молекулярной массы. После электрофореза гели экспонируют с рентгеновской пленкой. О присутствии Ku-антигена в исходных клетках человека судят по появлению на радиоавтографе геля полосы с кажущейся молекулярной массой около 95 кДа. Эта полоса соответствует продукту ковалентного присоединения ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, к Ku80-субъединице Ku-антигена.

Кажущаяся молекулярная масса продукта приблизительно соответствует сумме масс белка и ДНК [Левина Е., Бавыкин С., Шик В. и др., Биохимия, 1980, 45, 1133-1145; Khodyreva S.N., Lavrik O.I., Curr. Med. Chem., 2005, 12, 641-655]. Методом пептидного картирования на основе данных масс-спектрометрии было показано, что белок в составе основного продукта ковалентного присоединения ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, к белкам экстракта из клеток человека является Ku80-субъединицей Ku-антигена.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Введение [³²Р] в 5'-конец олигонуклеотида:

Реакцию проводили в буфере, содержащем 70 мМ трис-HCl (pH 7,6) 10 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтол. Кроме того, реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 100 пкмоль олигонуклеотида (5'-GGCGATTAAGTTGGGUAACGTCAGGGTCTTCC-3'), 25 мкМ γ-[³²P]-ATP с удельной активностью 3000 кюри/ммоль, и 10 ед. Т4 полинуклеотидкиназы.

Реакцию проводили при 37°С в течение 30 мин. Т4 полинуклеотидкиназу инактивировали нагреванием, 5 мин при 97°С.

Олигонуклеотид выделяли из реакционной смеси электрофорезом в 20% полиакриламидном геле (19:1) в денатурирующих условиях (7 М мочевина) с последующей радиоавтографией. Участок геля, содержащий фосфорилированный олигонуклеотид, вырезали и осуществляли электроперенос олигонуклеотида на DEAE-бумагу DE-81 в ячейке для электроэлюции. (Электродный буфер для электропереноса, 0,5-кратный - ТВЕ, pH 8,3 (50 мМ трис HCl, 50 мМ H₃BO₃, 0,5 мМ ЭДТА), напряженность поля ≈25 В/см). С DEAE-бумаги олигонуклеотид элюировали тремя порциями по 25 мкл горячего 2 М раствора LiClO₄ в Н₂О и осаждали реакционную смесь 10-ю объемами ацетона (выдерживали при -40°С в течение 40 мин). Осадок отделяли центрифугированием в центрифуге Mini Spin (Eppendorf) при 14000 об/мин, промывали ацетоном, высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли в ТЕ-буфере (10 мМ трис-HCl (pH 7,8), 1 мМ ЭДТА).

Получение [³²Р]-меченого ДНК-дуплекса, содержащего dUMP:

Для получения ДНК-дуплекса смешивали 5 мкМ 5'-[³²P]-меченый олигонуклеотид, содержащий dUMP и 7,5 мкМ олигонуклеотид (5'-GGAAGACCCTGACGTTACCCAACTTAATCGCC-3') в ТЕ-буфере. Конечный объем смеси составлял 20 мкл. Пробирку помещали в термостат с температурой 97°С и после 5-минутной инкубации при этой температуре отключали нагрев термостата, позволяя реакционной смеси медленно остыть до комнатной температуры.

Получение [³²Р]-меченого ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, с помощью урацил-ДНК-гликозилазы Е.coli:

ДНК-дуплексы, содержащие АП-сайты, получали непосредственно перед экспериментом за счет удаления остатков урацила под действием урацил-ДНК-гликозилазы. Реакционная смесь содержала 1 пкмоль [³²Р]-меченого ДНК-дуплекса, 5 единиц урацил-ДНК-гликозилазы, а также следующие стандартные компоненты: 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 0,25 мМ β-меркаптоэтанол. Реакцию выщепления проводили в течение 15 мин при 37°С.

Способ детекции Ku-антигена:

Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 0,2 мкМ [³²Р]-меченый ДНК-дуплекс, содержащий АП-сайт, 25 мкг исследуемых белков экстракта клеток человека (HeLa) и следующие стандартные компоненты: 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 15 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 7% глицерин. Экстракт из клеток человека получали согласно [Biade S., Sobol R.W., Wilson S.H. et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 898-902]. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при температуре 37°С. Затем добавляли NaBH₄ до концентрации 30 мМ и реакцию восстановления проводили во льду в течение 30 мин. После этого для разделения белковых компонентов пробы подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях в 10% полиакриламидном геле (30:0,4). Гель экспонировали с рентгеновской пленкой. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов присоединения ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, к белкам клеточного экстракта HeLa представлен на чертеже. Из данных, представленных на чертеже, следует, что Ku-антиген присутствует в исследуемом экстракте из клеток человека, а следовательно, и в исходных клетках человека (HeLa), поскольку на радиоавтографе геля после электрофореза имеется полоса, с кажущейся молекулярной массой около 95 кДа, соответствующая продукту ковалентного присоединения ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, к Ku80-субъединице Ku-антигена.

Пример 2.

Подготовительные операции по получению [³²Р]-меченого ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, осуществляли аналогично примеру 1. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 0,05 мкМ [³²Р]-меченый ДНК-дуплекс, содержащий АП-сайт, 5 мкг исследуемых белков экстракта клеток человека (К562) и следующие стандартные компоненты: 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 3% глицерин. Реакционную смесь инкубировали в течение 15 мин при температуре 35°С. Затем добавляли NaBH₄ до концентрации 20 мМ и реакцию восстановления проводили во льду в течение 60 мин. После этого для разделения белковых компонентов пробы подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях в 15% полиакриламидном геле (30:0,4). Гель экспонировали с рентгеновской пленкой. На радиоавтографе обнаружено наличие полосы с кажущейся молекулярной массой около 95 кДа, что свидетельствует о присутствии Ku-антигена в экстракте из клеток человека и в исходных клетках человека (К562).

Способ позволяет с высокой чувствительностью детектировать Ku-антиген в клетках различного происхождения. Отсутствие продуктов присоединения ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, к Ku80-субъединицы Ku-антигена свидетельствует об отсутствии Ku-антигена в экстракте из клеток человека, что приводит к нарушению функционирования одного из механизмов репарации двухцепочечных разрывов в ДНК путем негомологичного соединения концов ДНК в исходных клетках.

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии и представляет собой способ детекции Ku-антигена в экстрактах клеток человека. Способ включает получение

[³²P]-меченного ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт. Полученный ДНК-дуплекс добавляют в реакционную смесь, содержащую исследуемые белки экстракта из клеток человека и буферный раствор. Смесь инкубируют в течение 10-15 мин при температуре 35-37°С, добавляют NaBH₄ до концентрации 20-30 мМ и проводят реакцию восстановления во льду в течение 30-60 мин. Далее разделяют белковые компоненты электрофорезом. Гели экспонируют с рентгеновской пленкой и детектируют наличие Ku-антигена в исследуемых клетках человека по появлению на радиоавтографе геля после электрофореза полосы с кажущейся молекулярной массой около 95 кДа, соответствующей продукту ковалентного присоединения ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, к Ku80-субъединице Ku-антигена. Способ позволяет с высокой чувствительностью определять наличие Ku-антигена в клетках различного происхождения. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ детекции Ku-антигена в экстрактах клеток человека, включающий получение [³²Р]-меченого ДНК-дуплекса, инкубацию последнего с белками экстракта клеток человека с последующим разделением белковых компонентов электрофорезом в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что получают [³²P]-меченый ДНК-дуплекс, содержащий АП-сайт, добавляют последний в реакционную смесь, содержащую исследуемые белки экстракта из клеток человека и буферный раствор, смесь инкубируют в течение 10-15 мин при температуре 35-37°С, добавляют NaBH₄ до концентрации 20-30 мМ и проводят реакцию восстановления во льду в течение 30-60 мин, далее разделяют белковые компоненты электрофорезом, гели экспонируют с рентгеновской пленкой и по появлению на радиоавтографе геля после электрофореза полосы с кажущейся молекулярной массой около 95 кДа, соответствующей продукту ковалентного присоединения ДНК-дуплекса, содержащего АП-сайт, к Ku80-субъединице Ku-антигена, детектируют наличие Ku-антигена в исследуемых клетках человека.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что буферный раствор содержит 50 мМ трис-HCl (pH 7,5-8,0), 10-15 мМ ЭДТА, 40-60 мМ NaCl, 3-7% глицерин.