СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АПУРИН/АПИРИМИДИН-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/573 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биохимии и касается способа определения активности фермента репарации, апурин/апиримидин-эндонуклеазы человека (АП-эндонуклеаза, фермент Apel).

Молекула ДНК, главный носитель генетической информации, может повреждаться под воздействием химических агентов, УФ- или ионизирующего излучения. Повреждения генетического аппарата обладают цитотоксическим и мутагенным эффектом и способны приводить к развитию сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и онкологических заболеваний. Показано, что уровень повреждений в ДНК возрастает при таких заболеваниях, как лейкемия, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, гепатит, рак груди, рак легких и многих других (Cooke M.S. et al. FASEB J. 2003, 17, 1195-1214; Evans M.D. et al. Mutat. Res. 2004, 567, 1-61).

Все живые организмы способны удалять повреждения и восстанавливать исходную структуру ДНК. Считается, что по пути эксцизионной репарации оснований (BER) удаляется большинство повреждений азотистых оснований ДНК и АР-сайты.

Общий механизм BER включает в себя удаление поврежденного азотистого основания, остатка дезоксирибозы и фосфата и последующее восстановление вырезанного нуклеотида репликативным аппаратом клетки. Удаление поврежденного или неправильно спаренного основания осуществляется ДНК-гликозилазами. Большинство из них могут удалять несколько различных модифицированных оснований. Затем апуриновые/апиримидиновые эндонуклеазы удаляют оставшийся дезоксирибофосфатный остаток. Образовавшийся пробел в один нуклеотид содержит на 3'-конце гидроксильную группу, а на 5'-конце остаток фосфорной кислоты. ДНК-полимераза присоединяет нужный нуклеотид, и ДНК-лигаза заканчивает процесс BER, восстанавливая целостность дезоксирибофосфатного остова.

Изучение этих ферментов в последнее время вызывает особый интерес. Знания о механизмах и особенностях действия ферментов репарации могут приблизить человечество к решению проблем раннего старения и лечения болезней, связанных с высоким уровнем генерации мутаций в геноме.

АП-эндонуклеазы обнаружены в клетках всех живых организмов. Субстратом для них являются АП-сайты, возникающие в ДНК как в результате спонтанных процессов, так и в процессе действия ДНК-гликозилаз. АП-эндонуклеазы вносят разрыв с 5'-стороны от повреждения, оставляя 3'-ОН группу, необходимую для последующей инициации синтеза ДНК-полимеразой.

Разработка новых способов определения активности АП-эндонуклеазы человека является актуальной задачей и чрезвычайно важна для определения уровня репарационной защиты людей, подверженных повышенным геномным нагрузкам (летчики и подводники, испытывающие окислительный стресс при дыхании кислородсодержащими смесями; работники и спортсмены, подверженные значительному УФ- и/или радиационному облучению и др.).

Активность фермента характеризуют величиной каталитической константы k_cat, равной числу оборотов фермента в единицу времени. За удельную активность (А) фермента принимают, как широко распространено в энзимологии (см. Биохимия, 2004, Т.69, Вып.1, С.134-144), количество мкмоль продукта, образующееся в минуту, в расчете на 1 мг фермента (мкмоль × мин^-1 × мг^-1).

Известен способ определения активности фермента Apel путем взаимодействия с субстратом, содержащим остаток 2-оксиметил-3-окси-тетрагидрофурана (F) (Т.Izumi, С.Н.Schein, N.Oezguen, Y.Feng and W.Braun. Biochemistry. 2004, 43, 684-689; A.K.Mantha, N.Oezguen, К.K.Bhakat, T.Izumi, W.Braun and S.Mitra J. Mol. Biol. 2008, 379, 28-37). В качестве субстрата используют ³²Р-меченный дуплекс длиной 43 нуклеотида.

Фермент Apel (22 пМ) инкубируют с субстратом (1-200 нМ) в течение 4 минут при температуре 37°C. Реакцию останавливают добавлением раствора, содержащего 10 мМ ЭДТА и 88% формамид. Анализ проводят электрофорезом в 8%-ом полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину. Гель сушат и проводят авторадиографию с помощью прибора фосфоимиджер (Storm, Molecular Dynamics). Строят зависимость скорости расщепления субстрата V₀ от концентрации субстрата S₀, которую обрабатывают по уравнению Михаэлиса (1) (Michaelis L., Menten M.L. Biochem. Z. 1913. 49. p.333) и определяют значения K_M и k_cat.

Наиболее ближайшим к заявленному способу прототипом является способ определения активности фермента Apel методом прерывания реакции (R.L.Maher and L.В.Bloom J.Biol. Chem. 2007, 282, 30577-30585). В основе метода лежит быстрое, в течение ≤1 мс, смешивание растворов фермента и субстрата с помощью прибора KinTek RQF-3 (KinTek). Фермент инкубируют с субстратом, состоящим из ³²Р-меченной цепи 5'-[³²P]-d(GCGTCAAAATGTFGGTATTTCCATG)-3' и комплементарной цепи 5'-d(CATGGAAATACCTACATTTTGACGC)-3'. Реакцию проводят в буферном растворе состава 50 мМ HEPES, pH 8,0, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 5% глицерин, 0,2 мг/мл БСА. Концентрация фермента составляет 0,2 мкМ, концентрация субстрата составляет 0,5, 1,0, 2,0 мкМ. Прерывание реакции происходит при быстром смешивании с 0,2 М раствором NaOH, затем в раствор добавляют 96% формамид, 20 мМ ЭДТА и нагревают до 95°C.

Проводят накопление 10 точек в интервале времени 0-100 мс. Анализ состава реакционной смеси в отобранных точках проводят методом гель-электорофореза в 20%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину. Проводят измерение профиля радиоактивности вдоль дорожки геля и строят кинетические зависимости накопления продукта реакции. Данные обрабатывают с использованием программы SigmaPlot (Systat Software) и получают значения K_M и k_cat.

Недостатками прототипа являются необходимость синтеза и анализа радиоактивного ДНК-субстрата, а также длительность и трудоемкость метода, связанные с использованием прибора KinTek RQF-3.

Технической задачей изобретения является упрощение известного способа, повышение точности и достоверности результатов определения активности АП-эндонуклеазы человека и стандартизация единиц измерения активности в соответствии с международной системой.

Способ заключается в регистрации во времени изменения интенсивности флуоресценции субстрата в реакционной смеси при взаимодействии с АП-эндонуклеазой человека.

Запускают реакцию путем смешивания растворов субстрата и фермента в соотношении 1:1 и регистрируют изменение интенсивности флуоресценции субстрата в интервале времени 1-2000 сек. Для этого в кювете флуориметра смешивают растворы субстрата (1,0×10^-6 М), буфера (50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреит, 9% глицерин) и образца АП-эндонуклеазы человека (1,0×10^-7 М, 1,0×10^-8 М, 1,0×10^-9 М, 1,0×10^-10 М).

В качестве субстрата используют двухспиральный комплекс комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов длиной 13 или более звеньев, содержащий в центральном положении остаток 2-оксиметил-3-окси-тетрагидрофурана (F), например

5'-FLU-С-С-Т-С-Т-C-F-С-С-Т-Т-С-С-3'

3'-DABCYL-G-G-A-G-A-G-C-G-G-A-A-G-G-5',

где FLU - остаток флуоресцеина, DABCYL - остаток дабцила.

Остаток 2-оксиметил-3-окси-тетрагидрофурана является специфическим сайтом узнавания фермента Apel. Один из олигодезоксирибонуклеотидов несет флуоресцентный краситель на 5'-конце, а комплементарный олигодезоксирибонуклеотид несет краситель на 3'-конце. Флуоресцентные красители подобраны таким образом, что спектр испускания флуоресценции одного красителя (флуоресцеин, FLU) перекрывается со спектром поглощения второго красителя (дабцил, DABCYL). Образование дуплекса приводит к пространственному сближению флуорофора FLU и тушителя флуоресценции DABCYL, в результате чего происходит эффективное тушение интенсивности флуоресценции (резонансный перенос энергии флуоресценции, FRET).

Взаимодействие субстрата и фермента Apel приводит к расщеплению рибозо-фосфатного остова ДНК по специфическому сайту F. В результате чего в продукте реакции цепи олигонуклеотидов расходятся, что приводит к пространственному разделению флуорофора и тушителя. Интенсивность флуоресценции увеличивается по мере накопления продукта реакции.

Регистрируют изменение интенсивности флуоресценции субстрата в реакционной смеси в спектральном диапазоне 500-550 нм, возбуждение флуоресценции проводят на длине волны 494 нм.

Кинетические кривые обрабатывают методом нелинейной регрессии с помощью программы DynaFit (Kuzmic P. Anal. Biochem. 1996. 237. p.260-273). Использование программы позволяет минимизировать математическую обработку данных и получить значения K_M и k_cat.

Отличиями заявленного способа от прототипа являются:

- использование нерадиоактивного дуплекса олигонуклеотидов длиной 13 или более звеньев, несущих комбинацию флуоресцентных красителей флуоресцеин и дабцил, причем один из олигодезоксирибонуклеотидов несет флуоресцентный краситель на 5'-конце, а комплементарный олигодезоксирибонуклеотид несет краситель на 3'-конце, что позволяет упростить способ определения активности (отказаться от использования радиоактивно-меченного субстрата, накладывающего жесткие ограничения по технике безопасности работы, и от трудоемкого анализа состава реакционной смеси методом гель-электорофореза);

- регистрацию интенсивности флуоресценции субстрата проводят в широком интервале времени 1-2000 секунд, что позволяет повысить точность и достоверность определения активности фермента (в прототипе измерение проводят в коротком интервале времени 0-100 мс);

- кинетические кривые обрабатывают методом нелинейной регрессии с помощью программы DynaFit, которая позволяет минимизировать время обработки кинетических кривых и достоверно рассчитать константы K_M и k_cat.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Пример

Определение активности фермента Apel с использованием заявленного способа.

Для определения активности фермента Apel готовят буфер следующего состава: 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреит, 9% глицерин. Приготавливают в буфере 1,0×10^-6 М раствор субстрата, представляющий собой дуплекс:

5'-FLU-С-С-Т-С-Т-C-F-С-С-Т-Т-С-С-3'

3'-DABCYL-G-G-A-G-A-G-C-G-G-A-A-G-G-5',

где FLU - остаток флуоресцеина, DABCYL - остаток дабцила, F - остаток 2-оксиметил-3-окси-тетрагидрофурана. Готовят растворы фермента Apel в буфере 1,0×10^-7 М, 1,0×10^-8 М, 1,0×10^-9 М, 1,0×10^-10 М.

Запускают реакцию путем смешивания растворов субстрата и фермента в соотношении 1:1 и регистрируют изменение интенсивности флуоресценции субстрата в интервале времени 1-2000 сек. Возбуждение флуоресценции проводят на длине волны 494 нм, регистрацию проводят в спектральном диапазоне 500-550 нм. На чертеже представлена зависимость интенсивности флуоресценции от времени реакции.

Кинетические кривые получены при взаимодействии 1,0×10^-6 М субстрата и 1,0×10^-7 М, 1,0×10^-8 М, 1,0×10^-9 М, 1,0×10^-10 М фермента Apel.

Для обработки данных используют схему Михаэлиса-Ментен (Michaelis L., Menten M.L. Biochem. Z. 1913. 49. p.333). Кинетические кривые анализируют с помощью программы DynaFit (Kuzmic P. Anal. Biochem. 1996. 237, p.260-273), которая позволяет проводить численное интегрирование и подгонку параметров методом нелинейной регрессии. В результате обработки получают значения K_M и k_cat. K_M=(1,1±0,4)×10^-7 М и k_cat=2,4±0,3 с^-1.

За удельную активность (А) фермента принимают количество мкмоль продукта, образующееся в минуту, в расчете на 1 мг фермента (мкмоль × мин^-1 × мг^-1), и рассчитывают по формуле:

где 2,8×10^-2 - пересчетный коэффициент, равный количеству мкмоль фермента Apel в 1 мг (молекулярная масса фермента Apel равна 35,5 кДа).

Получено, что k_cat=2,4±0,3 с^-1=144±18 мин^-1.

Активность А=2,8×10^-2×144=4,03 (мкмоль × мин^-1 × мг^-1).

Использование способа позволяет повысить точность и достоверность определения активности фермента Apel и наряду с этим отказаться от использования радиоактивно-меченного субстрата и стандартизовать единицы измерения активности в соответствии с международной системой.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии. Для осуществления способа определения активности апурин/апиримидин-эндонуклеазы человека запускают реакцию путем смешивания растворов субстрата и фермента в соотношении 1:1 и регистрируют изменение интенсивности флуоресценции субстрата в интервале времени 1-2000 сек. Для этого в кювете флуориметра смешивают растворы субстрата (1,0×10^-6 М), Tris-HCl буфера и образца АП-эндонуклеазы человека (1,0×10^-7 М, 1,0×10^-8 М, 1,0×10^-9 М, 1,0×10^-10 М). В качестве субстрата используют двухспиральный комплекс комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов длиной 13 или более звеньев, содержащий в центральном положении остаток 2-оксиметил-3-окси-тетрагидрофурана и несущий красители флуоресцеин и дабцил. Изменение интенсивности флуоресценции субстрата в реакционной смеси регистрируют в спектральном диапазоне 500-550 нм, возбуждение флуоресценции проводят на длине волны 494 нм. Кинетические кривые обрабатывают методом нелинейной регрессии с помощью программы DynaFit. Использование способа позволяет повысить точность и достоверность определения активности апурин/апиримидин-эндонуклеазы человека, а также отказаться от использования радиоактивно-меченного субстрата и стандартизовать единицы измерения активности в соответствии с международной системой. 1 ил.

1. Способ определения активности апурин/апиримидин-эндонуклеазы человека, включающий смешивание растворов фермента с ДНК-субстратом, содержащим остаток 2-оксиметил-3-окси-тетрагидрофурана, и вычисление значения каталитической константы (k_cat, мин^-1) по заданным уравнениям с использованием компьютерной программы, отличающийся тем, что в качестве ДНК-субстрата используют дуплекс олигонуклеотидов длиной 13 или более звеньев, несущих комбинацию флуоресцентных красителей флуоресцеин и дабцил, при этом один из олигодезоксирибонуклеотидов, содержащий в центральном положении остаток 2-оксиметил-3-окси-тетрагидрофурана (F) несет флуоресцентный краситель на 5'-конце, а комплементарный олигодезоксирибонуклеотид несет краситель на 3'-конце, при этом растворы фермента и субстрата смешивают в соотношении 1:1 с последующим измерением активности фермента путем регистрации изменения интенсивности флуоресценции субстрата в интервале времени 0-2000 с, причем возбуждение флуоресценции проводят на длине волны 494 нм, а изменение интенсивности флуоресценции субстрата регистрируют в спектральном диапазоне 500-550 нм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что субстрат используют в концентрации, равной 1,0·10^-6 М, а фермент в концентрациях 1,0·10^-7 М, 1,0·10^-8 M, 1,0·10^-9 M, 1,0·10^-10 M.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что значение каталитической константы получают методом нелинейной регрессии с помощью программы DynaFit.