СУБСТРАТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИНТЕГРАЗЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/68 C12N15/48 C12N9/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к энзимологии, и может быть использовано в вирусологии для выявления потенциальных ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека.

Вирус иммунодефицита человека, относящийся к семейству ретровирусов, вызывает хроническую инфекцию чувствительных клеток, используя при этом стратегию репликации, которая выделяет его среди других животных вирусов. После связывания вируса с клеткой-мишенью вирусный геном в виде одноцепочечной РНК высвобождается в цитоплазму хозяйской клетки. В ходе репликации в клетке вирусная РНК проходит стадию обратной транскрипции, которую осуществляет вирус специфичный фермент - обратная транскриптаза, с образованием двуцепочечной ДНК с длинными концевыми повторами (LTR) [1]. В процессе репродукции вируса иммунодефицита человека образуются по крайней мере три формы ДНК провируса: линейная копия вирусного генома, которая является субстратом для интеграции [2] и две кольцевые формы с одним или двумя LTR, функциональная роль которых до сих пор остается неясной [3]. Встраивание линейной формы ДНК провируса в геном клетки-хозяина осуществляется при помощи вирусного фермента - интегразы.

Вирусная интеграза (ИН) в несколько стадий осуществляет встраивание ДНК провируса в геном клетки-хозяина. На первой стадии удаляются два нуклеотида с 3’-концов LTR вновь синтезированной провирусной ДНК. Эта сайт-специфичная эндонуклеазная активность называется реакцией 3’-процессинга. Последующие стадии интеграции происходят после проникновения комплекса из цитоплазмы в ядро. Ядерный этап интегрирования включает образование одноцепочечных разрезов в хозяйской ДНК и лигирование с процессированными 3’-ОН LTR-концами - реакция встраивания.

До настоящего времени для определения активности интегразы ретровирусов in vitro используются различные радиоактивные двуцепочечные дуплексы длиной 20-26 нуклеотидов.

Известен радиоактивный дуплекс, используемый в способе определения активности интегразы [4].

Дуплекс получают синтезом комплементарных дезоксиолигонуклеотидов, конструированием из гибридизованных комплементарных олигонуклеотидов, мечением радиоактивными изотопами. Полученный радиоактивно меченный дуплекс инкубируют с препаратом очищенной интегразы и полученные продукты анализируют в полиакриламидном геле.

Известен флуоресцентно меченный дуплекс из метода измерения активности ретровирусной интегразы [5]. Измерение активности ретровирусной интегразы в реакции 3’-процессинга происходит по возрастанию интенсивности флуоресценции при отщеплении GT-динуклеотида.

К недостаткам данных субстратов можно отнести то, что при ингибиторном анализе результаты, полученные при помощи тест-системы оценки активности интегразы in vitro на основе олигонуклеотидных дуплексов, не коррелируют с результатами, полученными в культуре ВИЧ-инфицированных клеток [6]. Это ставит вопрос об адекватной интерпретации существующих на сегодняшний день данных о функциональной роли интегразы. Вследствие этого на сегодняшний день ведутся поиски тест-системы оценки активности интегразы, основанной на использовании протяженного ДНК-субстрата фланкированного LTR-фрагментами, которые узнаются интегразой вируса иммунодефицита человека.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является субстрат, полученный конструированием плазмиды, содержащей концевые последовательности провирусной ДНК, известный из способа определения активности интегразы ВИЧ [7, прототип]. Субстрат получают так: проводят амплификацию концов провирусной ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), в присутствии двух пар ВИЧ-специфических праймеров, клонируют в векторную плазмиду pBKRSV ("Stratagene", Канада), нарабатывают полученную плазмидную конструкцию, линеаризуют плазмиду при помощи рестриктазы, получают 5’-выступающий конец посредством нуклезы ExoIII и в дальнейшем достраивают Т7 ДНК-полимеразой с использованием радиоактивно меченных нуклеотидов. Полученный радиоактивно меченный субстрат используется для определения активности интегразы в реакции встраивания с последующим разделением продуктов реакции в полиакриламидном геле и радиоавтографированием. Для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга проводят рестрикцию полученной плазмидной конструкции для получения фрагмента 107 п.н. с последующим введением радиоактивной метки.

Основным недостатком данного субстрата является то, что он получается различный по длине и составу, что влияет на результаты определения активности интегразы в реакциях 3’-процессинга и встраивания. Применение данной системы для скриннинга ингибиторов интегразы для отбора потенциальных анти-ВИЧ препаратов затрудняется из-за многостадийности конструирования субстрата, использования дорогостоящих малодоступных ферментов, а также из-за дополнительной стадии наработки плазмиды в бактериальной системе Е.coli. Также из-за трудоемкости получения субстрата использование данного способа затрудняет конструирование субстратов, гомологичных различным штаммам вируса иммунодефицита человека, для исследования влияния природных нуклеотидных замен в субстрате на функциональную активность интегразы.

Технической задачей изобретения является конструирование субстрата, идентичного природному субстрату интегразы ВИЧ, позволяющего повысить быстроту проведения измерения активности интегразы in vitro и дающего возможность комплексного исследования функциональной активности интегразы в нескольких реакциях (3’-процессинга и встраивания) на одном субстрате.

Поставленная техническая задача изобретения решается выбором и синтезом олигонуклеотидных праймеров, таким образом, что амплифицируются только фрагменты ДНК, гомологичные кольцевым формам кДНК вируса иммунодефицита человека.

Субстрат для определения активности интегразы состоит из фрагмента 1200-1300 п.н. комплементарного интактным параллельно ориентированным длинным концевым повторам (LTR) ВИЧ. Субстрат является неинфекционной мини-копией вирусного генома, что позволяет изучать процесс интеграции в условиях, максимально приближенных к естественным.

Длинные концевые повторы (размер 600-650 п.н.) расположены на 5’ и 3’ концах провирусной ДНК, причем ориентация относительно друг друга параллельная. 5’ район LTR является промоторно-энхансерным районом вируса и состоит из множества функциональных элементов, осуществляющих базальную и регулируемую экспрессию вирусных генов. LTR ВИЧ делится на три области: U3, R и U5, которые содержат различные районы для связывания клеточных факторов транскрипции.

Первичная последовательность LTR играет важную роль в процессе интеграции. Оба 3’-ОН конца LTR играет важную роль в процессе интеграции. Оба 3’-ОН конца LTR несут консервативный СА-динуклеотид в позиции 3,4, с которым специфично связывается интеграза. После связывания с субстратом интеграза отщепляет два концевых динуклеотида GT с 3’-ОН конца. Полученный ДНК-продукт с гидролизованными 3’-ОН концами интеграза встраивает в геном хозяйской клетки. При использовании предлагаемого субстрата в качестве ДНК для встраивания используют избыток ДНК плазмиды.

Праймеры выбирают в консервативной области геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека так, что имеют 100% гомологию между различными штаммами вируса иммунодефицита человека, что позволяет амплифицировать субстрат для интегразы, гомологичный различным штаммам вируса, используя одни и те же праймеры. Первой парой праймеров амплифицируют последовательность, состоящую из двух параллельно ориентированных LTR-последовательностей, с 5’ конца части гена env и с 3’ конца части гена gag. Второй парой праймеров на внутреннюю область полученного фрагмента амплифицируется непосредственно субстрат для интегразы, содержащий на концах динуклеотид СА, в положениях 3, 4 3’-ОН конца, который специфически узнается интегразой. Далее полученный ДНК фрагмент радиоактивно метится с помощью фрагмента Кленова и используется для определения активности интегразы в реакциях 3’-процессинга и встраивания. О положительном результате реакции судили по появлению продукта, выявляемого электрофорезом в полиакриламидном геле.

Субстрат получают следующим образом.

На первом этапе выбираются и синтезируются две пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека 1-го типа. Причем ориентированность праймеров должна быть таким образом, что амплифицируется только фрагмент, комплементарный кольцевым формам ДНК (фиг.1). Например: S1–5’-GGGGTGGGAGCAGCATCTCG-3’ (на конец гена env) и S2–5’-TCTTGCCGTGCGCGCTTCAG-3’ (на начало гена gag). Затем повторным амплифицированием парой гнездовых праймеров непосредственно на концы LTR: N1-5’-ACTGGAAGGGCTAATTCACTCC-3’ и N2-5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3’; получают ДНК продукт, который содержит сайт - СА-динуклеотид на 3’-ОН конце для специфического узнавания интегразы и состоит из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длинной 1200-1300 п.н. Полученный ДНК продукт метится посредством фрагмента Кленова и [α-р³²]ТТР для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга и посредством фрагмента Кленова и набора [α-p³²]dNTP для определения активности интегразы в реакции встраивания.

Существенное отличие заявляемого субстрата от известного прототипа:

в качестве субстрата используется протяженная 1200-1300 п.н. последовательность ДНК, гомологичная кДНК вируса иммунодефицита человека, состоящая только из длинных концевых повторов, что дает возможность исследовать функциональную активность интегразы in vitro с использованием неинфекционной копии мини-генома ВИЧ.

Следовательно, можно считать заявляемое техническое решение соответствующим критерию "изобретательный уровень".

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Фиг.1 Схематическое изображение конструирования LTR-содержащего ДНК субстрата.

Фиг.2 Зависимость накопления продукта в реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой, от времени: 1 - Контроль; 2-5 мин; 3-15 мин; 5-45 мин; 6-90 мин.

Фиг.3 Активность рекомбинантной интегразы ВИЧ в реакции встраивания с использованием ЛТР-содержащего ДНК субстрата. Радиоавтограф с 4%-ного полиакриламидного геля.

Сущность технического решения раскрыта в конкретных примерах осуществления способа.

Пример 1. Конструирование LTR-содержащего субстрата для определения активности интегразы на основе кольцевых форм ДНК вируса.

Операция 1. Выделение провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека из лимфоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов.

Забор периферической крови пациентов для предотвращения образования тромба проводят в пробирки, содержащие 0,5 М ЭДТА рН 8,0, конечная концентрация ЭДТА - 4 мМ. Выделение лимфоцитов проводят разделением крови пациента в градиенте фиколл-верографин. Готовят 60 мл 15% раствора фиколла на деионизированной воде и при перемешивании приливают к нему 20 мл 76% раствора верографина ("Spofa", Чехословакия). Из этого раствора под контролем ареометра готовят растворы плотностью 1,097 г/мл и 1,075 г/мл. Приготовленные растворы стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 30 мин. На градиент, составленный из 5 мл раствора плотностью 1,097 г/мл и 5 мл раствора плотностью 1,075 г/мл, наслаивают 10 мл разведенной раствором Хенкса в соотношении 1:2 крови. Центрифугируют 40 мин при 400 g и температуре 22°С. Отбирают легкую фракцию, которая содержит лимфоциты и моноциты, отмывают, центрифугируя (2-3 мин при 400 g) раствором Хенкса.

Клетки ресуспендируют в лизирующем буфере (10 мМ трис рН 8,3; 1 мМ ЭДТА; 0,5% твин 20; 0,5% NP-40) с добавлением протеиназы К (концентрация 8 мг/мл) и инкубируют в термостате при 56°С в течение 3 часов. Затем проводят экстракцию фенолом и переосаждение ДНК этанолом.

Операция 2. Выделение суммарной клеточной ДНК из суспензии культуры клеток.

В работе используют высокочувствительную к вирусу иммунодефицита человека культуру клеток МТ-4, инфицированную штаммами ВИЧ-1/ГКВ4046, ВИЧ-1/Bru, с инфекционным титром 10⁴-10⁶ инфекционных единиц / мл и концентрацией 0,5×10⁶ клеток/мл.

Клетки, предварительно отмытые раствором Хенкса или DMEM(M), ресуспендируют в лизирующем буфере (10 мМ трис рН 8,3; 1 мМ ЭДТА; 0,5% твин 20; 0,5% NP-40) с добавлением протеиназы К (концентрация 8 мг/мл) и инкубируют в термостате при 56°С в течение 3 ч. Затем проводят экстракцию фенолом и переосаждение ДНК этанолом.

Операция 3. Полимеразная цепная реакция.

ПЦР проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 6,7 мМ трис НСl (рН 8,8), 1,5 мМ MgCl₂, 0,01% твин-20, по 0,1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2 единицы Tag-полимеразы, по 2 мкМ праймера S1 и S2 и добавляют 5 мкл выделенной ДНК из инфекционного материала. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 30 циклов: 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1,2 мин, 72°С в течение 1,5 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 72°С в течении 5 мин. После завершения ПЦР отбирают водную фазу и смешивают ее с равным объемом раствора, содержащего фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:25:1). После центрифугирования при 14000 об/мин в течение 30 с, водную фазу отбирают и осаждают ДНК этиловым спиртом с ацетатом натрия. Осадок растворяют в 20 мкл воды. ПЦР проводят в тех же условиях гнездовыми праймерами N1 и N2, добавляя 5 мкл раствора, полученного в результате амплификации праймерами S1 и S2.

Операция 4. Получение радиоактивно меченного ДНК субстрата для измерения активности интегразы в реакции 3’-процессинга.

Фрагмент ДНК с тупыми концами метят с помощью фрагмента Кленова путем замещения dTTP нуклеотида на 3’-гидроксильном конце.

Реакцию замещения проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис НСl (рН 7,5), 5 мМ MgCl₂, 7,5 мМ DTT, 33 мкМ [³²р]ТТР (50 мкКи), 1,2 единицы Большого (Кленов) фрагмента ДНК-полимеразы I и 1-3 мкг ДНК субстрата, синтезированного в полимеразной цепной реакции. Смесь инкубируют в течение 1 часа при 37°С. При завершении реакции добавляют 5 мкл раствора, содержащего 0,4 М ЭДТА, 60% глицерин, 0,1% бромфеноловый синий. Очистку радиоактивно меченного субстрата проводят препаративным электрофорезом в 4% полиакриламидном геле в нативных условиях с последующей радиоавтографией.

Операция 5. Получение радиоактивно меченного ДНК субстрата для измерения активности интегразы в реакции встраивания.

Фрагмент ДНК подвергают частичному гидролизу с 3’-ОН концов за счет 3’-5’ экзонуклеазной активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.coli. Затем после добавления dNTP выступающие 5’-концы достраивают за счет 5’-3’ полимеразной активности фрагмента Кленова.

Реакционная смесь содержит 10 мМ трис НСl (рН 7,5), 5 мМ MgCl₂, 7,5 мМ DTT, 1,2 единицы Большого (Кленов) фрагмента ДНК-полимеразы I и 1-3 мкг ДНК субстрата, синтезированного в полимеразной цепной реакции. Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, затем добавляют по 33 мкМ dATP, dGTP, dCTP и [³²p]TTP (50 мкКи). Инкубируют смесь 60 мин при 37°С. Очистку радиоактивно меченного субстрата проводят препаративным электрофорезом в 4% полиакриламидном геле в нативных условиях с последующей радиоавтографией.

Операция 6. Элюция радиоактивно меченного ДНК субстрата из полиакриламидного геля.

Полосу, соответствующую ДНК субстрату по данным радиоавтографии, вырезают из геля и добавляют к ней 1 объем элюирующего буфера, содержащего 0,5 М NН₄СН₃СO₂, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Инкубируют при вращении (100 rpm) в течение 12 ч при 37°С. Центрифугируют 10 мин при 10000 g. Собирают надосадочную жидкость и осаждают ДНК этиловым спиртом. Осадок растворяют в 50 мкл буфера 50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА (рН 8,0). Измеряют спектрофотометрически концентрацию полученного ДНК субстрата.

Пример 2. Определение скорости реакции 3’-процессинга, катализируемой ИН ВИЧ.

Активность интегразы измеряют по отщеплению радиоактивно меченного динуклеотида GT* с 3’ конца обеих цепей ДНК-субстрата. Реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ и 2 нМ радиоактивно меченного субстрата.

Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37°С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют электрофоретически, используя 20% ПААГ в денатурирующих условиях (7,5 М мочевина), с последующей радиоавтографией (фиг.2). Для количественного определения продукта реакции фрагменты геля, соответствующие продукту на радиоавтографе, вырезают и измеряют радиоактивность на счетчике (Mark-III).

Пример 3. Определение кинетических параметров реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой.

При определении кинетических параметров реакционная смесь (45-50 мкл) для реакции 3’-процессинга содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ и варьируемые концентрации радиоактивно меченного субстрата (10^-11-10^-8 М).

Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37°С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют, как в примере 2.

Km реакции 3’ процессинга находят по уравнению Михаэлиса-Ментен, используя программу Origin Professional 5.0 (Micrococal inc.). Все измерения проводят на линейных участках зависимостей накопления продуктов от времени и концентрации фермента. Ошибка определения констант не превышает 10-30%. Для используемой в работе рекомбинантной интегразы ВИЧ величины Км в реакции 3’-процессинга для радиоактивно меченного субстрата составляет (1,2±0,3)·10^-10 М. Все измерения проводят на линейных участках зависимостей накопления продуктов от времени и концентрации фермента. Ошибка определения констант не превышает 10-30%.

Пример 4. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ ауринтрикарбоновой кислотой в реакции 3’-процессинга с использованием ДНК субстрата.

При определении концентрации ауринтрикарбоновой кислоты, при которой относительная активность фермента составляет 50% ([I]₅₀); реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ, 2 нМ радиоактивно меченного ДНК субстрата и ауринтрикарбоновую кислоту в различных концентрациях (10^-7-10^-3 М)

Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37°С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют как, в примере 2.

[I]₅₀ ауринтрикарбоновой кислоты находят графически с помощью построения экспериментальных данных в координатах зависимости концентрации АТК от относительной скорости реакции 3’-процессинга. [I]₅₀ ауринтрикарбоновой кислоты в реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой, для данного ДНК-субстрата составляет (7,2±0,7)·10^-7 М.

Пример 5. Измерение активности интегразы ВИЧ в реакции встраивания.

Активность интегразы в реакции встраивания оценивают по количеству встраивания радиоактивно меченного ДНК субстрата в плазмиду pUC19 (фиг.3). Реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl₂, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 0,5 мкг pUC19, 70 нг интегразы и 1 нМ радиоактивно меченного субстрата. Реакцию поводят при 37°С в течение 30-90 мин. Продукты реакции анализируют электрофоретически, используя 4% ПААГ в нативных условиях с последующей радиоавтографией. Для количественного определения продукта реакции фрагменты геля, соответствующие продукту на радиоавтографе, вырезают и измеряют радиоактивность на счетчике (Mark-III).

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Fausi A.S. // Science. 1988. V.239. Р.617-622; Weiss R.A. // Science. 1993. V.260. Р.1273-1279; De Clercq E. // Clinical Microbiology Reviews V.8, №12, P.200-239.

2. Hindmarsh P., Leis J. // Microbiology and Molecular Biology Reviews, Dec. 1999, p.836-843.

3. Гашникова Н.М. и др. // ДАН, №4, 2001 г.

4. Chow S.A. (1997) In vitro assays for activities of retroviral integrase // Methods, 12, 306-317.

5. Патент США №5763181.

6. O’Brien С. //Science. 1994. V.266. Р.1946; Sourgen F. et all // Eur. J. Biochem. V.240. P.765-73.

7. Activity of recombinant HIV-1 integrase on mini-HIV DNA. Cherepanov P., Surratt D., Toelen J., Pluymers W., Griffith J., De Clercq E. and Debyser Z. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 2202-2210.

Субстрат предназначен для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека in vitro. Субстрат получают синтезом олигонуклеотидных праймеров комплементарных консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека, амплификацию последовательности ДНК, комплементарной ковалентно замкнутым кольцевым формам ДНК вируса иммунодефицита, полимеразной цепной реакцией. Затем повторной амплификацией парой гнездовых праймеров получают ДНК продукт, состоящий из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длиной 1200-1300 п.н. Полученный ДНК продукт метится посредством фрагмента Кленова и [α-р³²]ТТР для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга и посредством фрагмента Кленова и набора [α-p³²]dNTP для определения активности интегразы в реакции встраивания. Меченный ДНК продукт используют для определения активности интегразы in vitro с дальнейшим анализом продуктов реакции в полиакриламидном геле и радиоавтографированием. Предложенный субстрат повышает быстроту проведения измерения активности интегразы in vitro при сохранении специфичности и идентичности сконструированного субстрата природному субстрату интегразы вируса иммунодефицита человека. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека, содержащий концевые последовательности провирусной ДНК и меченный радиоактивной меткой, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют фрагмент провирусной ДНК ВИЧ-1, состоящий из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длиной 1200-1300 п.н.2. Субстрат по п.1, отличающийся тем, что длинные концевые повторы (размер 600-650 п.н.) расположены на 5’ и 3’ концах провирусной ДНК.3. Субстрат по п.1, отличающийся тем, что в качестве ДНК для встраивания используют избыток ДНК плазмиды.