Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с отложениями амилоида, которые включают болезнь Альцгеймера.
Уровень техники
Определенные факты известны о биохимических и метаболических феноменах, связанных с наличием болезни Альцгеймера (AD). Два структурных и гистопатологических изменения, наблюдаемых в мозге заболевших AD, представляют собой нейрофибриллярные пучки (NFT) и отложения амилоида. Внутринейрональные нейрофибриллярные пучки присутствуют также при других нейродегенеративных заболеваниях, но наличие отложений амилоида как во внутринейрональном пространстве (нейритные бляшки), так и в непосредственной близости к микрососудам (сосудистые бляшки), как представляется, является характерной чертой AD. Из них нейритные бляшки кажутся наиболее распространенными (Price, D.L., and co-workers. Drug Development Research (1985) 5:59-68).
Главным компонентом данных амилоидных бляшек является пептид из 40-42 аминокислот, называемый амилоидным пептидом Аβ4.
Амилоидный пептид Аβ4 представляет собой полипептид, который образуется в результате протеолиза мембранных гликопротеинов, обозначаемых белками-предшественниками амилоидного пептида Аβ4 (рарр). Данные белки - предшественники амилоидного пептида, состоят из от 695 до 770 аминокислот, причем все они кодируются одним и тем же геном.
Идентифицировано два главных варианта амилоидного пептида Аβ4, пептид Аβ40 и Аβ42, содержащих 40 и 42 аминокислоты, соответственно, которые характеризуются различным тканевым распределением как в физиологических, так и в патологических условиях. Вариант из 42 аминокислот является преобладающей формой в амилоидных бляшках, локализованных в мозге больных AD.
До настоящего времени предлагались различные возможные решения для обеспечения возможной вакциной против AD.
В европейском патенте ЕР 526511 предлагается введение гомеопатических доз Аβ больным с предварительно установленной AD. Однако из-за применяемых доз уровни циркулирующего эндогенного Аβ в плазме существенно варьируются и, таким образом, преимущества в такой терапии не ожидается.
Schenk et al. (Nature, 1999; 400: 173-177) описывают иммунизацию Аβ42 трансгенных мышей PDAPP, которые гиперэкспрессируют мутантный АРР человека, предотвращая, таким образом, образование амилоидных бляшек, дистрофию нейритов и астроглиоз.
В заявке WO 9927944 (Schenk D.) описано лечение AD путем введения больному Аβ42.
Фаза III клинических испытаний у 360 больных с диагнозом средней и умеренной AD в 4 европейских странах и в Соединенных Штатах, при которых амилоидный пептид Аβ42 был использован в качестве антигена, была прекращена после сообщения об энцефалите у некоторых больных (Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16[7]:22, April 1, 2002).
Среди некоторых из возможных проблем, которые при использовании в качестве вакцины эндогенного белка (или белка, естественно присутствующего у животного, которого вакцинируют), как в случае пептида Аβ42, когда организм отвечает путем выработки антител против Аβ42 и против более мелких фракций, которые могут иметь также еще не известные физиологические функции, можно отметить проблему возможного развития аутоиммунных заболеваний, обусловленных выработкой антител против эндогенного белка, трудность в выработке иммунного ответа из-за неспособности иммунной системы узнавать эндогенные антигены и возможное развитие острого воспалительного ответа.
Задачей настоящего изобретения является лечение болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний посредством введения пептида, С-концевой части Аβ, конъюгированного с белком, где в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения указанный белок представляет собой гемоцианин моллюска фиссуреллии.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к вакцине для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и других родственных амилоидных заболеваний.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения предлагается вакцина для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и других родственных заболеваний, которая преодолевает недостатки, связанные с пептидами, белками или эндогенными иммуногенами.
Примерами других заболеваний, характеризуемых амилоидными отложениями, являются исландский наследуемый синдром, множественная миелома и губчатый энцефалит, включая болезнь Крейтцфельда-Якоба.
Индукция иммунного ответа может быть активной, например, когда иммуноген вводят для выработки антител, которые взаимодействуют с Аβ у больного, или пассивной, например, когда вводят антитело, которое само взаимодействует с Аβ у больного.
Для задач настоящего изобретения последующие термины определяются следующим образом.
Термин “родственные амилоидные заболевания” включает заболевания, связанные с аккумуляцией амилоида, которые могут быть ограничены одним органом, местный амилоидоз, или распространяться на несколько органов, системный амилоидоз. Вторичный амилоидоз может быть связан с хроническими инфекциями (такими как, например, туберкулез), семейная средиземноморская лихорадка (FMF) и другие типы системного амилоидоза, найденного у больных с длительным лечением с помощью гемодиализа. Местные формы амилоидоза включают, но не ограничиваются перечисленными, диабет типа II и любое другое, относящееся к этому заболевание, нейродегенеративные заболевания с губчатым энцефалитом, коровий губчатый энцефалит, болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера, церебральную амилоидную ангиопатию.
Термин “пассивная иммунизация” применяют в отношении введения антител или их фрагментов индивидууму с целью создания иммунитета у данного индивидуума.
В первом аспекте изобретение включает применение пептида, который действует или в качестве иммуногена, или в качестве антитела, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризуемого накоплением отложений амилоида. Указанные способы состоят в индукции иммунного ответа против пептидного компонента амилоидных отложений у больного. Указанная индукция может быть активной при введении иммуногена или пассивной при введении антитела или активного фрагмента, или производного антитела.
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
Полученное лекарство может быть использовано как у бессимптомных пациентов, так и у пациентов, проявляющих симптомы заболевания.
В соответствии с настоящим изобретением, композиции, способные вызывать иммунный ответ, направленный против определенных компонентов амилоидных бляшек, эффективны при лечении или профилактике заболеваний, связанных с амилоидными отложениями. В частности, в соответствии с аспектом настоящего изобретения, возможно предотвратить прогрессирование или снизить симптомы и/или снизить процесс отложения амилоида у индивидуума при введении больному иммуностимулирующей дозы пептида или антитела, полученного против него.
В соответствии с аспектом настоящего изобретения, антитела получают иммунизацией млекопитающих или птиц посредством использования в качестве иммуногена пептида, конъюгированного с белком.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, млекопитающие, используемые для иммунизации, могут представлять собой жвачных животных, лошадей, зайцеобразных, плотоядных животных, приматов или любое другое животное, у которого можно получить адекватные количества сыворотки для выделения из нее антитела. Среди птиц, используемых для иммунизации, заявители могут отметить, но не в плане ограничения, среди других Galliformes, Anseriformes и Columbiformes.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, предложено применение пептида, конъюгированного с белком, который действует в качестве иммуногена для продукции антител, способных специфически узнавать любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 или Аβ42, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризуемого накоплением амилоидных отложений в мозге больного.
В соответствии с наиболее предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, белок, применяемый для конъюгации с пептидом, представляет собой белок моллюска фиссуреллии.
В соответствии с более предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, пептид выбран из группы, состоящей из пептида SEQ ID No 1, пептида SEQ ID No 2, пептида SEQ ID No 3, пептида SEQ ID No 4, пептидов, полученных в результате укорочения с помощью удаления аминокислотных остатков с N-концов и/или С-концов SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3 или SEQ ID No 4, и пептидов, полученных в результате удлинения путем добавления остатков к любому из пептидов SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3 или SEQ ID No 4.
В соответствии с другим предпочтительным осуществлением, пептид выбран из группы, которая включает пептид SEQ ID No 1, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 1, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 2, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 2, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 3, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 3, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения пептид выбран из группы, которая состоит из пептида SEQ ID No 4, пептидов с последовательностью, полученной в результате удаления остатков N-концевых и/или С-концевых аминокислот из SEQ ID No 4, и пептидов, полученных в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В соответствии с другим осуществлением настоящего изобретения, предложено применение антитела или активного фрагмента, или производного антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 или Аβ42, в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента.
В соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения, антитело или активный фрагмент, или производное антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов пептида Аβ, получают против пептида, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, необязательно укороченных в результате удаления аминокислотных остатков с N-концов и/или С-концов, и необязательно удлиненных в результате добавления аминокислотных остатков, подходящих для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 1, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 1, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 2, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 2, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 3, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 3, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В другом более предпочтительном осуществлении указанное антитело или активный фрагмент, или производное антитела получают путем иммунизации млекопитающих или птиц пептидами, выбранными из группы, которая включает пептид SEQ ID No 4, пептиды с последовательностью, полученной в результате удаления N-концевых и С-концевых аминокислотных остатков SEQ ID No 4, и пептиды, полученные в результате добавления к любой из предшествующих последовательностей аминокислотных остатков, необходимых для конъюгации с белком.
В данном описании аминокислоты сокращают с применением однобуквенных кодов, применяемых в данной области, как указано ниже:
А=Ala = аланин
С=Cys = цистеин
D=Asp = аспарагиновая кислота
Е=Glu = глутаминовая кислота
F=Phe = фенилаланин
G=Gly = глицин
Н=His = гистидин
I=Ile = изолейцин
К=Lys = лизин
L=Leu = лейцин
М=Met = метионин
N=Asn = аспарагин
Р=Pro = пролин
Q=Gin = глутамин
R=Arg = аргинин
S=Ser = серин
Т=Thr = треонин
V=Val = валин
W=Trp = триптофан
Y=Tyr = тирозин
Последовательности, описанные ранее в настоящем изобретении и идентифицированные как SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, соответствуют следующим аминокислотным последовательностям:
SEQ ID NO 1 LVFFAEDV
SEQ ID NO 2 GLMVGGVV
SEQ ID NO 3 GLMVGGVVIA
SEQ ID NO 4 RHDSGYEVHHQK
Антителам, полученным против указанных пептидов, даны коды SAR-1, SAR-2, SAR-3 и SAR-4 в соответствии с тем, что указано ниже:
SEQ ID NO 1 SAR-2
SEQ ID NO 2 SAR-3
SEQ ID NO 3 SAR-4
SEQ ID NO 4 SAR-l
Информация, относящаяся к идентификации пептидных последовательностей, описанных в настоящем изобретении, которая приложена к настоящему документу в формате для компьютерного прочтения, представляет собой перечень последовательностей, которые присутствуют в данном документе.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих примеров.
Пример 1. Получение поликлональных антител
Путем иммунизации Новозеландских белых кроликов было получено четыре поликлональных антитела против четырех пептидов, конъюгированных с KLH, которые были использованы в качестве иммуногена.
Каждый иммуноген инъецировали двум кроликам, по пять инъекций каждому кролику: первая внутрикожная инъекция конъюгата пептид-KLH в ЗФР, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда, и четыре дополнительные внутримышечные инъекции в качестве поддерживающей дозы на 14, 28, 49 и 80 дни того же конъюгата пептид-KLH в ЗФР, но на этот раз эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда, при отборе крови на 90 день для определения наличия антител.
После сбора крови отделяли сыворотку и производили предварительную очистку обессоливанием, после чего антитела очищали по сродству на матриксе, включающем 1,5 мл активированного вещества EMD-Epoxy (Merck), к которому добавляли 5 мг соответствующего пептида. Очищенные фракции консервировали в 0,1% БСА (Sigma) и хранили при 4°С, а в качестве криопротектора можно было добавить 20-50% глицерина.
Пример 2. Иммуноблоттинг для Аβ
1. Электрофорез
Применяли способ Леммли, описанный в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1998, модифицированный для улучшения разделения небольших пептидов.
Применяли прибор Miniprotean 3 от Bio-Rad.
Применяли 15% акриламидный гель, смешанный со следующими компонентами:
Применяли исходные растворы пептидов Аβ40 и 42 с концентрацией 1 мг/мл (растворенных в ЗФР). Отбирали необходимый объем данных растворов для каждого из образцов и доводили до 20 мкл с помощью SBLT (SBL + трис-основание 2 М). Образцы затем кипятили в течение 5 минут для денатурации пептидов и удаления возможных протеаз.
Середину кюветы наполняли катодным буфером, а окружение - анодным буфером, причем состав данных буферов был следующим:
Анодный буфер
24,2 г трис-основания (конечная концентрация 0,2 М)
Разбавить до 1 л Н2О
Довести рН до 8,9 концентрированной НС1
Хранить при 4°С на протяжении до 1 месяца.
Катодный буфер
12,11 г трис-основания (конечная концентрация 0,1 М)
17,92 г трицина (конечная концентрация 0,1 М)
1 г ДДС-Na (конечная концентрация 0,1%)
Разбавить до 1 л H2O
Не доводить рН
Хранить при 4°С на протяжении до 1 месяца.
Наконец, образцы вносили в лунки: 20 мкл/лунку. С применением Polypeptide Standard Kaleidoscope от Bio-Rad в качестве маркера перемещение начинали при низком напряжении (30 В) и затем приблизительно через 1 час электрофореза напряжение увеличивали до 100 В.
2. Перенос на мембрану
Разделенные в геле белки переносили на мембрану PVDF с помощью электроблоттинга. В буклеты для переноса помещали следующее.
Тыльная сторона - губка - 3 листа ватманской бумаги (или фильтровальной бумаги - гель - мембрана - 3 листа ватманской бумаги - губка - сторона отпечатка.
После этого кювету наполняли буфером для электроблоттинга:
Глицин 38 нМ
Трис-основание 50 мМ
Метанол 40%
Перенос производили в течение 2 часов при 200 мА. Во время переноса буфер перемешивали с помощью магнитной мешалки.
3. Инкубация с антителами
Антитела и порошковое молоко растворяли в ЗФР-t (ЗФР+0,5% твин 20), промывку также производили с помощью ЗФР-Т.
После переноса поверхность мембраны блокировали 5% раствором порошкового молока в течение 1 часа при перемешивании при комнатной температуре (RT).
После этого мембрану промывали 2х5 минут при RT.
Затем ее инкубировали с первичным антителом (SAR-1, SAR-2, SAR-3 или SAR-4) в течение 1 часа при RT в разведении, по меньшей мере 1:500 в ЗФР-Т.
Мембрану промывали 3х10 минут при RT. Затем ее инкубировали со вторичным антителом: козьим-HRP против кролика в течение 1 часа при RT (1:10000 во всех случаях).
Вновь повторяли промывку мембраны: 3×10 минут при RT.
4. Окраска
После последней промывки мембрану инкубировали с раствором хемолюминесцентного набора с применением ECL kit+Plus от Pharmacia.
Мембрану заворачивали в целлофан и экспонировали с пленкой с двойной эмульсией (Hyperfilm МР от Amersham) на протяжении различных периодов времени от 30 секунд до 2 минут.
Пример 3. Иммуногистохимия с антителами SAR-1, SAR-2, SAR-3 и SAR-4 ткани мозга человека
Срезы ткани фиксировали в парафине в соответствии со следующими стадиями:
a) фиксации в нейтральном 10% формальдегиде;
b) дегидратации с помощью последовательных стадий с возрастающими концентрациями спирта;
c) проводки через ксилол и парафин, причем последнюю стадию осуществляют в печи при 60-62°С;
d) получения парафиновых блоков, из которых получали срезы 4 микрона, которые монтировали на стеклах.
Срезы затем депарафинизировали проводкой через следующие растворы:
Ксилол 100% 10 минут
Ксилол 100% 10 минут
Этанол 100% 5 минут
Этанол 100% 5 минут
Этанол 96% 5 минут
Этанол 90% 5 минут
Этанол 70% 5 минут
ЗФР 5 минут ×3 раза
Затем их обрабатывали следующим образом:
a) 96% муравьиной кислотой в течение 3 минут в вытяжном шкафу при перемешивании;
b) быстрой промывкой водой;
c) промывкой ЗФР 2×5 минут;
d) блокированием эндогенных пероксидаз в течение 15 минут в растворе, составленном из 70 мл ЗФР, 30 мл метанола и 1 мл H2O г;
e) промывкой ЗФР 3×5 минут;
f) промывкой ЗФР/Т (0,5% тритон или твин-20 в ЗФР) 3×5 минут;
g) блокированием неспецифического связывания сывороткой козы (нормальной сывороткой козы), разведенной 10:100 в ЗФР/Т, в течение 2 часов;
h) инкубацией с первичными антителами в течение ночи при 4°С во влажной камере:
Sar-1… Разведение 1:150 в ЗФР
Sar-2… Разведение 1:1500 в ЗФР
Sar-3… Разведение 1:1500 в ЗФР
Sar-4… Разведение 1:2000 в ЗФР;
i) промывкой ЗФР/Т 3×5 минут;
j) инкубацией со вторичным антителом (козьим против кролика), разведенным 1:200 ЗФР, в течение 45 минут;
k) промывкой ЗФР 4×5 минут;
l) инкубацией АВС (авидин-биотинового комплекса) Vector Labs в разведении 1:100 в ЗФР/Т в течение 45 минут в темноте при сохранении данных условий до завершения развития окраски;
m) промывкой ЗФР 3×5 минут;
n) проявлением в диаминобензидине (DAB).
Время контролировали эмпирически под стереоскопическим микроскопом. Для этого, во-первых, производили промывку в 0,5 М растворе трис-HCl в течение 10 минут при перемешивании с последующей инкубацией с диаминобензидиновым субстратом (DAB), разведенным в 0,05 М трис-HCl, и к которому добавляли 0,5 мкл/мл Н2О2 при 4°С. После окончания реакции производили три промывки в ЗФР при 4°С в течение 5 минут каждая и затем производили обезвоживание в этаноле при 70%, 90% и 100% в течение 2 минут каждый раз, проводку через ксилол в течение 4 минут и затем проводку через ксилол в течение 2 минут, после чего срезы монтировали с помощью Eukitt для исследования под микроскопом.
Перечень последовательностей
Количество последовательностей: 4
Информация о последовательности 1:
Свойства последовательности:
Длина: 8
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 1
Информация о последовательности 2:
Свойства последовательности:
Длина: 8
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 2
Информация о последовательности 3:
Свойства последовательности:
Длина: 10
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 3
Информация о последовательности 4:
Свойства последовательности:
Длина: 12
Тип: аминокислотная
Тип молекулы: пептид
Источник: Химический синтез
Описание последовательности:
SEQ ID NO 4
Изобретение относится к медицине и касается применения антител, специфически узнающих любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида, Аβ40 и Aβ42, в приготовлении лекарственного средства, которое применяют для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера. Изобретение обеспечивает предотвращение прогрессирования или снижение симптомов, и/или снижение процесса отложения амилоида у индивидуума при введении больному иммуностимулирующей дозы пептида или антитела, полученного против него. 2 н. и 5 з.п. ф-лы.
1. Применение пептида, конъюгированного с белком, который действует в качестве иммуногена для получения антител, способных специфически узнавать любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 и Аβ42, в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента, страдающего любым из заболеваний, выбранных из болезни Альцгеймера и церебральной амилоидной ангиопатии, характеризующееся тем, что пептид представляет собой SEQ ID No 2.
2. Применение по п.1, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
3. Применение по п.1, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой церебральную амилоидную ангиопатию.
4. Применение по любому из предыдущих пунктов, характеризующееся тем, что белок представляет собой белок моллюска фиссуреллии (KLH).
5. Применение антитела, или активного фрагмента, или производного антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида Аβ40 и Aβ42, в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения заболевания, характеризующегося накоплением амилоидных отложений в мозге пациента, страдающего любым из заболеваний, выбранных из болезни Альцгеймера и церебральной амилоидной ангиопатии, при этом антитело, или его активный фрагмент, или производное антитела, которое специфически узнает любой из преобладающих вариантов пептида Аβ, получено посредством иммунизации млекопитающих или птиц пептидом SEQ ID No 2.
6. Применение по п.5, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
7. Применение по п.5, характеризующееся тем, что заболевание представляет собой церебральную амилоидную ангиопатию.
| Способ осветления мыла из контакта Петрова | 1947 |
|
SU72880A1 |
| WO 9927944 A, 10.06.1999 | |||
| US 5750349 A, 12.05.1998 | |||
| NEZLIN R.S | |||
| Structure and biosynthesis of antibodies | |||
| - Moscow: Nauka,p.156-159, 1972. | |||
