ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ЛАККАЗА III ГРИБА Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАККАЗ Российский патент 2010 года по МПК C12N9/08 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к микробиологическому получению ферментных препаратов - лакказ, и может найти применение в ряде промышленных биотехнологических процессов, таких как модификация лигниносодержащих материалов и получение из них промышленно ценных соединений, отбеливание бумажной массы и текстильных материалов, очистка сточных вод и почвы от целого ряда ксенобиотиков, полимеризация фенолов и ряда других ароматических соединений, получение косметических препаратов для отбеливания кожи и окрашивания волос и т.д.

Лакказы (ЕС 1.10.3.2) - полифенолоксидазы из семейства медьсодержащих оксидаз, осуществляющих одно- и двухэлектронное окисление широкого ряда фенольных и нефенольных соединений с сопутствующим четырехэлектронным восстановлением кислорода до молекулы воды. Они обнаружены у растений, бактерий и грибов. Однако среди всех организмов большинство известных лакказ найдено в грибах белой гнили.

Основной проблемой, возникающей при использовании лакказ в биотехнологических процессах, протекающих при повышенных температурах, является низкая стабильность лакказ.

Температурные и рН оптимумы лакказ, выделенных из различных организмов, значительно отличаются.

Максимальная активность известных грибных лакказ лежит в диапазоне температур от 25°С до 80°С (Baldrian P., FEMS Microbiol Rev, 2006, V.30, Р.215-242), но большинство лакказ имеют температурный оптимум в области 50-60°С.

Известная лакказа из гриба Marasmius quercophilus (Dedeyan et al., Appl Environ Microbiol, 2000, V.66, P.925-929) стабильна больше, чем 1 час при инкубации при 60°С, 10 минут - при инкубации при 75°С и полностью инактивируется в течение 15 минут при 80-90°С.

Известная лакказа из гриба Pycnoporus cinnabarinus (Eggert et al., Appl Environ Microbiol, 1996, V.62, P.1151-115 8) теряла 50% активности после 1 часа инкубации при 70°С и после 5 минут инкубации при 80°С.

Известная лакказа из гриба Physisporinus rivulosus (Hilden et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2007, V.77, P.301-309) теряла 50% активности после 30-60 минут инкубации при 70°С и после 5-8 минут инкубации при 80°С.

Известная лакказа из аскомицета Chaetomium thermophilum (Chefetz et al., Appl Environ Microbiol, 1998, V.64, P.3175-3179) стабильна в течение 1 часа при 70°С и теряла 50% активности после 8 минут инкубации при 80°С.

Однако все эти ферменты обладают недостаточно высокой термостабильностью, что осложняет их использование в промышленных условиях.

Наиболее близкой к предлагаемым объектам является лакказа гриба Melanocarpus albomyces штамм IMI 255989 (патент США, US 7183090, Laccase enzyme and the gene encoding the enzyme, C12N 9/02, 2007 г.).

Она имеет температурный оптимум при 70°С и сохраняет 50% активности при инкубации при 60°С в течение 1 часа, 30% активности при инкубации при 70°С в течение 15 мин, 10% активности при инкубации при 70°С в течение 30 мин и выдерживает инкубацию при 80°С в течение 5 мин.

рН стабильность: после 22 часов инкубации остаточной активность составляет при рН 4-65%, при рН 5-80%, при рН 6-85%, при рН 7-90%, при рН 8-92%.

Однако следует отметить недостаточно высокую термостабильность и рН стабильность этой известной лакказы.

Задача предлагаемого изобретения - получение новых ферментных препаратов, обладающих лакказной активностью.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является повышенная термостабильность и ацидофильность новых ферментных препаратов, обладающих лакказной активностью.

Указанный технический результат достигается тем, что из культуральной жидкости базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D выделены три фермента: лакказа I, лакказа II и лакказа III.

Штамм базидиального гриба Steccherinum ochraceum (Pers.: Fr.) Gray, LE (BIN)-1833 был описан ранее как Steccherinum ochraceum 1833 (Мясоедова и соавт., Прикл. Биохим. Микробиол., 2008, Т.44, С.84-89).

Указанный штамм был депонирован и хранится в Коллекции культур базидиомицетов Ботанического института им. В.Л.Комарова РАН, ЛЕ (БИН) под номером LE (BIN) 1833 D.

Предлагается способ получения термостабильных лакказ гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, характеризующийся тем, что штамм гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D выращивают на глюкозопептонной среде, культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрацией и последующим центрифугированием, супернатант наносят на колонку с DE52 целлюлозой в качестве носителя, уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буфером (буфер А), элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А, фракции с лакказной активностью объединяют, концентрируют и обессоливают и наносят на колонку с ионообменным носителем Q-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером А, элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А, затем полученные две активные фракции с лакказной активностью концентрируют и обессоливают,

полученную первую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75, элюируют 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных активных фракций с лакказной активностью получают лакказу I, полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Q-Sepharose вторую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку с ионообменным носителем Resource Q, элюцию проводят ломаным градиентом 1 М NaCl в буфере А, полученные две активные фракции концентрируют и обессоливают,

первую фракцию с лакказной активностью полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Resource Q наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75, элюцию проводят 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных фракций с лакказной активностью получают лакказу II,

вторую фракцию с лакказной активностью, полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Resource Q, наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75 и элюируют 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных фракций с лакказной активностью получают лакказу III.

Для получения лакказ инокулят жидкой культуры гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D выращивают в течение 14 суток без перемешивания на глюкозопептонной среде, содержащей (г/л): KH₂PO₄ - 0.6, K₂HPO₄ - 0.4, MgSO₄×7H₂O - 0.5, CaCl - 0.05, ZnSO₄ - 0.01, FeSO₄ -0.005, пептон - 3.0, глюкоза - 10, рН 5.0.

Первые пять дней культивирование проводят без перемешивания, после чего - с перемешиванием при 160 оборотов в минуту при температуре 29°С. На 7 день культивирования вносят 2,4-диметилфенол до конечной концентрации 1 мМ и CuSO₄ до конечной концентрации 2 мМ.

Активность лакказы определяют спектрофотометрически по скорости окисления 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС), ε₄₃₆=29300 М^-1·см^-1 при 25°С (Perez et al., Appl Environ Microbiol, 1990,V.56, P.1806-1812).

Реакционная смесь содержит 1 mM АБТС, 20 mM Na-ацетатный буфер (рН 5,0), ферментный препарат. Спектрофотометрически определяют увеличение поглощения при 436 нм. За одну единицу активности лакказы принимают скорость превращения 1 мкМ субстрата 1 мл культуральной жидкости за 1 мин.

Культивирование прекращают при достижении максимума лакказной активности в культуральной жидкости штамма гриба Steccherinum ochraceum LE(BIN)1833D.

Культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрацией и последующим центрифугированием.

Обессоливание в предлагаемом способе может проводиться ультрафильтрацией, в частности на 10-30 кДа мембране или диализом.

Для ионообменной хроматографии используют колонку Resource Q (объем колонки 6 мл) промышленной набивки (Cat. No. 17-1179-01, Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden).

Схема очистки трех лакказ из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D представлена в Таблице 1.

Концентрацию белка в пробах определяют с помощью метода Лоури (Lowry et al., J Biol Chem, 1951, V.193, P.265-275).

Степень чистоты полученных препаратов оценивают по результатам электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) (Laemmli, Nature, V.227, Р.680-685).

Лакказа I, выделенная из культуральной жидкости штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, обладает следующими свойствами:

субстратная специфичность: окисляет ряд субстратов, в частности 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту) (АБТС), катехол, 2,4-диметилфенол, 2,6-диметилфенол, 2,6-диметоксифенол, пирогаллол, гваякол, сирингальдазин, конифериловый спирт;

молекулярная масса: 57500±500 дальтон (при определении методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДСН и методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75) (фиг.1);

коэффициент экстинкции при 611 нм (ε₆₁₁): 7300 М^-1·см^-1 (фиг.4);

рН оптимум:

- 2,06 (в Britton and Robinson буфере [Xu et al., Appl Environ Microbiol 2000, V.66, P.2052-2056] при 25°С, субстрат АБТС);

- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат сирингальдазин);

- 4,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат 2,6-диметоксифенол);

- 4,50 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат 2,6-диметилфенол);

диапазон рН стабильности: лакказа стабильна в течение одной недели при хранении в Britton and Robinson буфере в диапазоне рН от 2 до 6 и температуре 25°С;

температурный оптимум: 70°С (фиг.2);

термостабильность: в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, субстрат АБТС (фиг.3),

- после 8 часов инкубации при 60°С остается 20% активности;

- после 2 часов инкубации при 70°С остается 35% активности;

- после 30 минут инкубации при 80°С остается 15% активности;

кинетические константы в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (табл. 2):

K_m=114,9 мкМ, V_max=25,6 ед/мг, k_cat=24,6 с^-1 субстрат - АБТС;

K_m=2 мкМ, V_max=12,2 ед/мг, k_cat=11,7 с^-1, субстрат - сирингальдазин;

K_m=63,3 мкМ, V_max=17,2 ед/мг, k_cat=16,4 с^-1, субстрат - 2,6-диметоксифенол;

K_m=400 мкМ, V_max=16,9 ед/мг, k_cat=16,2 с^-1, субстрат - 2,6-диметилфенол;

K_m=78,7 мкМ, V_max=16,9 ед/мг, k_cat=16,2 с^-1, субстрат - пирогаллол;

K_m=90,9 мкМ, V_max=44,8 ед/мг, k_cat=42,9 с^-1, субстрат - конифериловый спирт;

K_m=1333,3 мкМ, V_max=27,3 ед/мг, k_cat=26,1 с^-1, субстрат - гваякол;

K_m=500 мкМ, V_max=23,5 ед/мг, k_cat=22,5 с^-1, субстрат - катехол.

Лакказа II, выделенная из культуральной жидкости штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, обладает следующими свойствами:

субстратная специфичность: окисляет ряд субстратов, в частности АБТС, катехол, 2,4-диметилфенол, 2,6-диметилфенол, 2,6-диметоксифенол, пирогаллол, гваякол, сирингальдазин, конифериловый спирт;

молекулярная масса: 59500±500 дальтон (при определении методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДСН и методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75) (фиг.1);

коэффициент экстинкции при 611 нм (ε₆₁₁): 7800 М^-1см^-1 (фиг.4);

рН оптимум:

-1,25 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - АБТС);

- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - сирингальдазин);

- 4,50 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметоксифенол);

- 5,20 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметилфенол);

диапазон рН-стабильности: лакказа стабильна в течение одной недели при хранении в Britton and Robinson буфере в диапазоне рН от 2 до 6 и температуре 25°С;

температурный оптимум: 75°С (фиг.2);

термостабильность в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, субстрат - АБТС (фиг.3):

- после 8 часов инкубации при 60°С остается 40% активности;

- после 2 часов инкубации при 70°С остается 41% активности;

- после 30 минут инкубации при 80°С остается 35% активности;

кинетические константы в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (табл. 2):

K_m=900 мкМ, V_max=359 ед/мг, k_cat=356 с^-1, субстрат - АБТС;

K_m=1,7 мкМ, V_max=23 ед/мг, k_cat=22,8 с^-1, субстрат - сирингальдазин;

K_m=26,3 мкМ, V_max=194,4 ед/мг, k_cat=192,8 с^-1, субстрат - 2,6-диметоксифенол;

K_m=667 мкМ, M_max=31,2 ед/мг, k_cat=30,9 с^-1, субстрат - 2,6-диметилфенол;

K_m=47,6 мкМ, V_max=7,2 ед/мг, k_cat=7,1 с^-1, субстрат - пирогаллол;

K_m=17,9 мкМ, V_max=89 ед/мг, k_cat ⁼88,3 с^-1, субстрат - конифериловый спирт;

K_m=90,9 мкМ, V_max=13,3 ед/мг, k_cat=13,2 с^-1, субстрат - гваякол;

K_m=1667 мкМ, V_max=52,3 ед/мг, k_cat=51,9 с^-1, субстрат - катехол.

Лакказа III, выделенная из культуральной жидкости штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, обладает следующими свойствами:

субстратная специфичность: окисляет ряд субстратов, в частности АБТС, катехол, 2,4-диметилфенол, 2,6-диметилфенол, 2,6-диметоксифенол, пирогаллол, гваякол, сирингальдазин, конифериловый спирт;

молекулярная масса: 63000±500 дальтон (при определении методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДСН и методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75) (фиг.1);

коэффициент экстинкции при 611 нм (ε₆₁₁): 7200 М^-1см^-1 (фиг.4);

рН оптимум:

- <1,2 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат АБТС);

- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат сирингальдазин);

- 4,50 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат 2,6-диметоксифенол);

- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат 2,6-диметилфенол);

диапазон рН стабильности: лакказа стабильна в течение одной недели при хранении в Britton and Robinson буфере в диапазоне рН от 2 до 6 и температуре 25°С;

температурный оптимум - 80°С (фиг.2);

термостабильность в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, субстрат - АБТС (фиг.3):

- после 8 часов инкубации при 60°С остается 36% активности;

- после 2 часов инкубации при 70°С остается 35% активности;

- после 30 минут инкубации при 80°С остается 65% активности.

Кинетические константы в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (табл. 2):

K_m=60,6 мкМ, V_max=12,7 ед/мг, k_cat=13,4 с^-1, субстрат - АБТС;

K_m=7,1 мкМ, V_max=3,2 ед/мг, k_cat=3,3 с^-1, субстрат - сирингальдазин;

K_m=40 мкМ, V_max=33 ед/мг, k_cat=34,7 с^-1, субстрат - 2,6-диметоксифенол;

K_m=625 мкМ, V_max=3,3 ед/мг, k_cat=3,4 с^-1, субстрат - 2,6-диметилфенол;

K_m=400 мкМ, V_max=40,8 ед/мг, k_cat=42,8 с^-1, субстрат - пирогаллол;

K_m=10,5 мкМ, V_max=7,7 ед/мг, k_cat=8,1 с^-1, субстрат - конифериловый спирт;

K_m=1250 мкМ, V_max=2,1 ед/мг, k_cat=2,2, с^-1, субстрат - гваякол;

K_m=250 мкМ, V_max =1,7 ед/мг, k_cat ⁼1,8 с^-1, субстрат - катехол.

Основным преимуществом лакказ из гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D является их более высокая термостабильность по сравнению со всеми известными на сегодняшний день базидиальными грибными лакказами. Кроме того, в отличие, например, от лакказы гриба Melanocarpus albomyces, которая стабильна и проявляет максимум активности при нейтральных значениях рН, предлагаемые лакказы базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D имеют высокую стабильность не только при нейтральном, но и при кислых значениях рН с максимумом активности в кислой области.

Все перечисленные выше свойства позволяют использовать лакказы из гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D в биотехнологических процессах, протекающих при высоких температурах и/или при низких значениях рН.

На фиг.1 показаны результаты SDS-электрофореза (12%-гель) лакказ, выделенных из гриба S. ochraceum LE (BIN) 1833 D согласно описанной схеме, с указанием молекулярного веса белка (1 - лакказа I, 2 - лакказа II, 3 - лакказа III, 4 - маркеры молекулярного веса). В качестве маркеров молекулярного веса используют маркеры SigmaMarker Low Molecular Weight Range No M-3 913.

На фиг.2 показана зависимость от температуры активностей лакказ, выделенных из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D (1 - лакказа 1,2 - лакказа II, 3 - лакказа III).

На фиг.3 представлена стабильность лакказ, выделенных из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, в зависимости от времени инкубации при различных температурах (● - лакказа I, ▲ - лакказа II, ■ - лакказа III),

На фиг.4 показаны спектры поглощения трех лакказ, выделенных из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D (Сплошная линия - лакказа I, штриховая линия - лакказа II, пунктирная линия - лакказа III).

В таблице 1 представлена схема очистки лакказ из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D.

В таблице 2 показана субстратная специфичность лакказ, выделенных из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Культивирование штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D.

Инокулят жидкой культуры гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D выращивают в течение 14 суток на глюкозопептонной среде без перемешивания.

Среда содержит (г/л): KH₂PO₄ - 0.6, K₂HPO₄ - 0.4, MgSO₄×7H₂O - 0.5, CaCl - 0.05,

ZnSO₄ - 0.01, FeSO₄ - 0.005, пептон - 3.0, глюкоза - 10, рН 5.0. Полученный инокулят гомогенизируют перемешиванием с фарфоровыми бусами и добавляют по 10 мл на колбу. Культивирование проводят в колбах объемом 750 мл с 100 мл глюкозопептонной среды.

Первые пять дней культивирование проводят без перемешивания, после чего - с перемешиванием при 160 оборотов в минуту при температуре 29°С.

На 7 день культивирования вносят 2,4-диметилфенол до конечной концентрации 1 мМ и CuSO₄ до конечной концентрации 2 мМ.

Лакказную активность определяют измерением окисления 200 мкМ АБТС в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, при 25°С, используя коэффициент молярной экстинкции ε₄₃₆=29.3 мМ^-1см^-1.

Культивирование прекращают при достижении максимума лакказной активности в культуральной жидкости штамма гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D - 33,6 ед/мл.

Пример 2. Получение суммарного препарата лакказ из культуральной жидкости штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833D.

Культуральную жидкость базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D с лакказной активностью, полученную как описано в Примере 1, отделяют от мицелия фильтрацией и последующим центрифугированием.

Супернатант наносят на колонку (объем носителя - 280 мл) с DE52 целлюлозой (Whatman, Великобритания), уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буфером (буфер А). Элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в 1600 мл буфера А.

Активные фракции объединяют, концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации на 10 кДа мембране (Millipore, США). Получают очищенный препарат лакказ с удельной активностью 6,01 ед/мг (табл. 1).

Пример 3. Получение термостабильной лакказы I штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D.

Фракцию с лакказной активностью, полученную, как описано в Примере 2, наносят на колонку Q-Sepharose (объем носителя - 30 мл), предварительно уравновешенную буфером А. Элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в 300 мл буфера А. Две активные фракции концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации.

Концентрированную первую фракцию (1 мл) с лакказной активностью наносят на колонку Superdex 75 (объем носителя - 110 мл) и элюируют 0,1 М Nad в буфере А при скорости потока 0,8 мл/мин. Объединенные активные фракции концентрируют.

Степень чистоты препарата оценивают по результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН.

Получают очищенный препарат лакказы I с удельной активностью 19 ед/мг, имеющий характеристики, указанные выше (фиг.1, табл. 1).

Пример 4. Получение термостабильной лакказы II штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D.

Концентрированную вторую фракцию с лакказной активностью, полученную после хроматографии на колонке Q-Sepharose, как описано в Примере 3, наносят на колонку Resource Q (объем носителя 6 мл) и элюируют ломаным градиентом 1 М NaCl в буфере А: 0-7,8%, 7,8-30%, 30-100%.

После этого получают две активные фракции, которые концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации. Полученную концентрированную первую фракцию с лакказной активностью затем наносят на колонку Superdex 75 (объем носителя - 110 мл) и элюируют 0,1 М NaCl в буфере А при скорости потока 0,8 мл/мин. Объединенные активные фракции концентрируют с помощью ультрафильтрации на 10 кДа мембране (Millipore, США).

Степень чистоты препарата оценивают по результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСП.

Получают очищенный препарат лакказы II с удельной активностью 18 ед/мг, имеющий характеристики, указанные выше (фиг.1, табл. 1).

Пример 5. Получение термостабильной лакказы III из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D.

Концентрированную вторую фракцию с лакказной активностью, полученную после хроматографии на колонке Resource Q, как описано в Примере 4, наносят на колонку Superdex 75 и элюируют 0,1 М NaCl в буфере А при скорости потока 0,8 мл/мин. Объединенные активные фракции концентрируют с помощью ультрафильтрации.

Степень чистоты препарата оценивают по результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН.

Получают очищенный препарат лакказы III с удельной активностью 9,5 ед/мг, имеющий характеристики, указанные выше (фиг.1, табл. 1).

Предлагаемые лакказы по сравнению с известной термостабильной лакказой гриба Melanocarpus albomyces штамм IMI 255989 (патент США) обладают лучшими характеристиками, в частности время полужизни лакказы из Melanocarpus albomyces при 60 и 70°С составляет 5 часов и 12 минут соответственно, в то время как для лакказ из Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D при 60 и 70°С время полужизни составляет 6-7 часов и 1,7 часа соответственно, а при 80°С время полужизни - 20-45 минут.

Более того, в отличие от лакказы гриба Melanocarpus albomyces, предлагаемые лакказы базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D имеют высокую стабильность не только при нейтральном, но и при кислых значениях рН с максимумом активности в кислой области.

Таким образом, по предлагаемому способу получены термостабильные лакказы базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, которые могут быть использованы в ряде промышленных биотехнологических процессов, проводимых при повышенных температурах и при низких значениях рН.

Таблица 1. Схема очистки лакказ из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D. Стадия очистки Общий белок, мг Удельная активность, ед/мг Общая активность, ед. Степень очистки, раз Выход, % Культуральная жидкость 2705 0.43 1163.2 1 100 DE52 cellulose 95.38 6.01 573.2 13.98 49.3 Q-Sepharose (фракция I) 3.3 12.06 39.8 28.1 3.4 Q-Sepharose (фракция II) 18.6 10.06 187.1 23.4 16.1 Superdex 75 (лакказа I) 1.03 19 19.6 44.2 1.7 Resource Q (фракция II) 4.87 22.3 108.6 51.9 9.3 Resource Q (фракция III) 3.1 20.47 61,41 47.6 5.3 Superdex 75 (лакказа II) 4.6 18 82.8 - - Superdex 75 (лакказа III) 2 9.5 19 - -

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к микробиологическому получению ферментных препаратов - лакказ, и может быть использовано при модификации лигниносодержащих материалов и получении из них промышленно ценных соединений, отбеливании бумажной массы и текстильных материалов, очистке сточных вод и почвы от целого ряда ксенобиотиков, полимеризации фенолов и ряда других ароматических соединений, получении косметических препаратов для отбеливания кожи и окрашивания волос. Способ предусматривает выращивание гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D на глюкозопептонной среде. Полученную культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрацией и центрифугируют. Полученный супернатант наносят на колонку с DE52 целлюлозой, уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буфером (буфер А). Элюируют линейный градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А. Полученные фракции с лакказной активностью объединяют. Концентрируют. Обессоливают и наносят на колонку с ионообменным носителем Q-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером А. Элюируют линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А. Полученные две фракции с лакказной активностью концентрируют и обессоливают. Полученную первую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку Superdex 75. Элюируют 0,1 М NaCl в буфере А. Полученные фракции с лакказной активностью объединяют и концентрируют с получением лакказы I. Полученную после хроматографии на колонке с Q-Sepharose вторую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку с ионообменным носителем Resource Q. Элюируют линейным градиентом 1М NaCl в буфере А. Полученные две фракции с лакказной активностью концентрируют и обессоливают. Полученную после хроматографии на колонке с Resource Q первую фракцию с лакказной активностью наносят на колонку с Superdex 75. Элюируют 0,1 М NaCl в буфере А. Полученные фракции с лакказной активностью объединяют и концентрируют с получением лакказы II. Полученную после хроматографии на колонке с Resource Q вторую фракцию с лакказной активностью наносят на колонку с Superdex 75 и элюируют 0,1 М NaCl в буфере А. Полученные фракции с лакказной активностью объединяют и концентрируют с получением лакказы III. Изобретение позволяет повысить стабильность лакказы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

1. Термостабильная лакказа III, выделенная из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D и имеющая следующие свойства:
субстратная специфичность: окисляет ряд субстратов, в частности, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту), катехол, 2,4-диметилфенол, 2,6-диметилфенол, 2,6-диметоксифенол, пирогаллол, гваякол, сирингальдазин, конифериловый спирт;
молекулярная масса: (63000±500) Да (при определении методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДСН и методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75);
коэффициент экстинкции при 611 нм (ε₆₁₁): 7200 М^-1см^-1;
рН оптимум:
<1,2 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - АБТС);
5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат-сирингальдазин);
4,50 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметоксифенол);
5,00 (в Button and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметилфенол);
диапазон рН-стабильности: лакказа стабильна в течение одной недели при хранении в Britton and Robinson буфере в диапазоне рН от 2 до 6 и температуре 25°С; температурный оптимум - 80°С;
термостабильность в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, субстрат - АБТС:
после 8 часов инкубации при 60°С остается 36% активности;
после 2 часов инкубации при 70°С остается 35% активности;
после 30 минут инкубации при 80°С остается 65% активности;
кинетические константы в натрий-ацетатном буфере, рН 5,0:
K_m=60,6 мкМ, V_max=12,7 ед/мг, k_cat=13,4 с^-1, субстрат - АБТС;
K_m=7,1 мкМ, V_max=3,2 ед/мг, k_cat=3,3 с^-1, субстрат - сирингальдазин;
K_m=40 мкМ, V_max=33 ед/мг, k_cat=34,7 с^-1, субстрат - 2,6-диметоксифенол;
K_m=625 мкМ, V_max=3,3 ед/мг, k_cat=3,4 с^-1, субстрат - 2,6-диметилфенол;
K_m=400 мкМ, V_max=40,8 ед/мг, k_cat=42,8 с^-1, субстрат - пирогаллол;
K_m=10,5 мкМ, V_max=7,7 ед/мг, k_cat=8,1 с^-1, субстрат - конифериловый спирт;
K_m=1250 мкМ, V_max=2,1 ед/мг, k_cat=2,2, с^-1, субстрат - гваякол;
K_m=250 мкМ, V_max=1,7 ед/мг, k_cat=1,8 с^-1, субстрат - катехол.

2. Способ получения термостабильных лакказ гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, характеризующийся тем, что штамм гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D выращивают на глюкозопептонной среде, культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрацией и последующим центрифугированием, супернатант наносят на колонку с DE52 целлюлозой в качестве носителя, уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буфером (буфер А), элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А, фракции с лакказной активностью объединяют, концентрируют и обессоливают и наносят на колонку с ионообменным носителем Q-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером А, элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А, затем полученные две активные фракции с лакказной активностью концентрируют и обессоливают,
полученную первую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75, элюируют 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных активных фракций с лакказной активностью получают лакказу I, полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Q-Sepharose вторую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку с ионообменным носителем Resource Q, элюцию проводят ломанным градиентом 1 М NaCl в буфере А, полученные две активные фракции концентрируют и обессоливают,
первую фракцию с лакказной активностью, полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Resource Q, наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75, элюцию проводят 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных фракций с лакказной активностью получают лакказу II,
вторую фракцию с лакказной активностью, полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Resource Q, наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75 и элюируют 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных фракций с лакказной активностью получают лакказу III.