Способ получения комплекса ферментов Советский патент 1984 года по МПК C12N9/00 C12N1/20 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической проhttOimeHHOCTjH, а именно к способам получения ферментов, и может быть .использовано в производстве ферментов, и может быть использовано в производстве ферментов и других биологически активных веществ, применяемых в винодельческой, консервной , фармацевтической, химической промышленно,сти, а также в сельском хозяйстве..

Известны способы -получения ферметов, в-частнЬсти целлюлоз, пектиназ монофенолмонооксигеназ и пероксидаэы, которые предусматривают культивирование их продуцентов, например плесневьгх грибов, дрожжей, высших базидиальных грибов и др.на питательной среде, содержащей воду, минеральные соли и органические добавки с, последующим отделением культуральной жидкости от мицелия и остатков твердого субстрата. Органические добавки.могут включать источники углерода, источники азота соединения, стимулирующие .биосинтез отдельных ферментов, например солому, опилки, хлопок, фильтровальную бумагу, мякоть свеклы, свекловичный жом, экстракты из свекловичного жома, виноградных выжимок, солодо-. вых ростков, и др. 1.

Недостатком известных способов является то, что они позволяютинтесифицировать биосинтез отдельных ферментов, однако для эффективного гидролиза сложных субстратов, например, в пищевой промышленности, при переработке отходов лесной, деревообрабатываюдей промышленности, сельского хозяйства и. др. требуется применение ферментньк комплексов, включающих одновременно высокоактивные целлюлозы, пектиназы, монофенолмонооксигеназы и пероксидазу.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является, способ получения комплекса ферментов путем культивирования высших базидиальных грибов на питательной среде, содержащей источник углерода, минеральные соли: однрзё1мещенный фосфат калия, двузаме,щенный фосфат калия, од незамещенный ;фосфат аммония, сульфат магния, и воду с последующи м отделением фильтрата культуральной жидкости от мицелия и остатков твердого субстрата, согласно которому, наряду с высшим базидиальным грибом, культивирует низший гриб, например Pleurotus astreatus И .Fusarium tulmorum 2.

Недостатками известного способа являются высокая стоимость и технологическая сложность выращивания

одновременно двух культур, отсюда большой расход посевного материала, а также недостаточно широкий ассортимент ферментов.

Целью изобретения является расширение. ассортимента ферментов в комплексе, повышение выхода целлюлоз, пекЧиназ, пероксидазы, монофенолмвнооксигена.зы и снижения себестоимости получаемого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения комплекса -ферментов путем культивирования высших базидиальных грибов на питательнойчереде, содержащей источннк углерода, минеральные соли однозамещенный фосфат аммония, однозамещенный фосфат калия, двуза.мёщенный фосфат калия, сульфат магния, и воду с последующим ртделениемЛфильтрата культуральной жидкости от мицелия и остатков твердог субстрата, применяют комплексную среду, в которой используют в качесве источников углерода целлюлозу в виде отходов .фильтровальной бумаги или соломы, .экстракт свекличного жома и гидрол, а также дополнительн вносят тиамин при следующем- соотношении компонентов, мас.%:

Целлюлоза 1,3-1,5

Экстракт из свекловичного жома 8,8-9,0

О , 4-0,5 Гидрол

Тиамин 0,00015-0,00020

Одн03амещенный

.0,17-0,20

фосфат аммония

Одно3амещенный О,05-0)06

фосф,ат калия

Двузамещенный

0,03-0,04

фосфат калия 0,04-0,05

Магний сернокислый До 100

вода водопроводная

После отделения культуральной жид ;ости от твердой фазы проводят дополнительную экстракцию ферментов иммобилизованных на твердых компонентах питательной среды 0,5 н,ацетатным буфером при рН 4,0 в течение часа при 10°С.

Пример 1. Использовали Coriolus hirsutus 0-69, который выращивали при 26-2ё С методом поверхностной пленки на комплексной питательной среде следующего состава, мае.%:

Среда 1

1,31

Фильтровальная бумага

Экстракт из свекло8,80 . вичного жома 0,43

Гидрол 0,00015

Тиамин 0,17

NH4HgP04 0,052

К Ilf04 0,035

0,043

MgS04 До 100

Вода водопроводная

В качестве контроля использовали также питательные среды, которые включают компоненты, стимулирующие биосинтез отдельных ферментов целлюлоза (среда 2-f, пектиназ (сре,да 3), монофеиолмонооксигеназ (среда 4) мае. % : . Среда 2

Фильтровальная бумага 1/47 Тиамин0,00015

ННдНгРО 0,19

КН2.р4 ,0,059

К2НР040,039

MgSOji0,049

Вода водопроводная До 100 Среда 3

Экстракт из свекловичного жома 9,0 Тиамин0,00015

NH4H2P040,18

КК2РО4-0,054

К2НРО4.0,036

. Mgs040,045

Вода водопроводная До 100 Среда 4

Гидрол0,49

Тиамин . 0,00015 KH4H2PQJ.0,20

КН2Р040,059

KjHPOjj . 0,039 MgSO40,049

Вода водопроводная До 100 , В процессе культивирования Corilus hirsutus на третьи, шестые и десятые сутки определяли способност к гидролизу нерастворимой целлюлозы а также активности эндo-l,4-J-глюкавазы, экзо-1,4-/ -глюкаиаэы, полигалактуррназы экзополигалактуровазы, пектинэкстеразы, монофеиолмонооксягеназы (полифенолоксидаза, лакказа) и пероксидазы в фильтратах культуральной жидкости, получаеких путем отделения мицелия и остатков твердого субстрата. Результаты измерений представлены в табл. 1, из которой следует, что использование комплексной среды, содержащей одновременио соединения, стимулиру цие биосинтез указанных ферментов, позволяет с 1,5г4,0 раза интенси дн цировать процесс и расширить ассортимент ферментов комплекса.

Экстрагирование О,5н.ацетатным буфером рН 4,О из остатков твердого Субстрат Фермент ФильтровальСпособность к гидролизу цел- ная бумага, люлозы мг% глюкозы Экзо-1,4-)3-{глю- Карбоксимеканаза) .тилцеллюлоза, мг% глюкозы

субстрата в течение 1 ч при 10С позволило дополнительно увеличить выход эндо-1,4- -глюканазы, экзо1,4-р-глюканазы, полигалактуроназы, экзополигалактуроназы и пектинэсктеразы (табл. 2).

Приме.р 2. В качестве продуцента использовали Coriolus versicolor.(Fr). Buel, nei 087

, Состав среды 1, мас.% Фильтровальная бумага 1,40 Экстракт из свекловичного жома . 9,00 Гидрол0,50

Тиамин0,00015

NHi H2P040,20

КН2Р040,06

. KjHPQ,О,.045

Вода . ,До 100

Полученные результаты представлены в табл. 3(уровни активностей внеклеточных ферментов при выращивании на комплексных средах с целлюлозой в виде отходов фильтровальной бумаги (1) или соломы (2). В контроле - среды, где в качестве единственного источника углерода использовали отходы фильтровальной бумаги (3), солому (4), экстракт из свекловичного жома (5) или гидрол ( (5-суточная культура).

.Пример 3. Состав сред и условия культивирования аналогичны примеру 1. Продуцент Pleurotus astreat ue (Fr) Kujnm ШТ. K-69, Время культивирования 10 сут. ,

В табл. 4 представлена активность Pleurotus astreatus K-69 на различных средах.

П р и м е р 4. CqcTaB сред аналогично примеру 1. Продуцент Irpex lacteus Fr. 0187.

Полученные результаты представлены в табл. 5.

Изобретение позволяет снизить себестоимость готового продукта примерно на 30%.

таким образом, реализация изобретения обеспечивает расширение ассортимента ферментов в комплексе, повышение выхода целлюзол, пектиназ, пероксидазы, моиофенолмонооксигеназы, и снизить себестоимость получаемого , продукта. Таблица 1 очная культура |6-суточная культура Варианты питательной среды г-г-л-гт 1Т1:г зТ : О 56,7 56,7 25,2- 83,7 О 34,5

Продолжение табл.1

КарбоксимеЭндо-1,4-/ тилцеллюлоглюканаэаза, % депо10,6 4,6 лимеризации ПолигалактуПектин свекроназаловичный, 31,221, ед/мл Пектовая Экзополигалак туррназа кислота, 5.61, ВысокометокПектинэкстесилированразаный пектин, 0,10, ед/мл Монрфенол- Бенэидин, 1.70 монооксигенаэа ед/мл 0,6О Конофенол- Пирокатехин, монбоксигенаэа ед/мл Пероксидаза Бензидин, 1,4О

Способность к гидролизу целлюлозы

Экзо-1,4-$глюканаза

59,0

Эндо-1,4-/ глюканаза

4,0

Полигалактуроназа

500,0

Экзополигалактуроназа

7,2

Продолжение Табл. 1

102,0

5,7

2,7

37,0

208,3

125,0200,0

4,1

6,2

3,4 6,8 2,6 13,4 7,7 6,8 4,9 7,0 33,3 250,0 100,0 142,8 111,1 3,7 3,0 1,5 1,0 1,5 2,6 0,1 0,3 0,1 0/2 0,1 О 0О6,1 О0,7 6,0 О О 1,0 ОО0,6 ОО5,4 0,6 0,9 5,6

Пектинэкстераза

Монофенолмонооксигеназа

МонофенолмонооксигеназаПёроксидаза

П р И н .е ч а н и е, Примечание.

Продолжение табл,

0,1

0,1 4,2

о

1,3 0,6

3,7 0,3

комплексная питательная среда согласно изобретению О - среда с фильтро.вгшьной бумагой t Ж - среда с экстрактом из стекповичного жома; W - среда с гидролом.,

Т а б л и ц а 2 - комплекснея питательная среда согласно изобретению; {} - среда с фильтровальной бумагой.

ПектинэксВысокометоксилированныйтераэа

пектин, ед/мл 0,27

Бензидии,

Пероксидаза

ед/мл 0,27

МонофенолБензидин,

ед/мл 25,4

монооксигеназа

Эк 30-1,4-: Кар боксимет илцеллюлоз а , глюканаза мг %

Эндо-1,4-0

Карбоксиметилцел;псшо; а, глюканаза% деполимеризации

Пектин свекЭндопйлиловичный,

галактуроед/мл

наза

Пектовая

Экзополи

г.алактурокислота, ед/мл

наза

ПероксиБензидин, ед/мл даза

Бензидин,

Монофенолед/млмонорксиганаза

Продолжение табл.4

Следы

О 18,0

0,9

Следы

Т д 6 л н ц а 5

322,3

35,5

О

87,7

51,1

48,7 250,0

0,92

2,64

2Д 0,6 9,2

Следы