Способ выявления ДНК микроорганизмов класса Mollicutes в крови и других биоматериалах методом ПЦР-РВ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение:

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики микроорганизмов класса Mollicutes в биологическом материале человека и животных. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК микроорганизмов класса Mollicutes. Праймеры объединены в набор реагентов для выявления ДНК микроорганизмов класса Mollicutes в крови и других биоматериалах методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет достоверно проводить обнаружение указанной группы микроорганизмов в исследуемом материале. Использование данного метода обеспечивает высокочувствительную качественную и количественную оценку присутствия микроорганизмов класса Mollicutes.

Область применения: набор реагентов может быть использован в научно-исследовательских лабораториях, клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений и на производстве высокотехнологичных лекарственных препаратов (в частности -биомедицинских клеточных продуктов).

Уровень техники:

Класс микроорганизмов Mollicutes (от лат. mollis - мягкий и cutis - кожа), выделенных в отдельную таксономическую группу, отличается от бактерий отсутствием жесткой клеточной стенки. К патогенным для человека и животных молликутам относятся Mycoplasma, Ureaplasma и Acholeplasma [1].

Молликуты являются внутриклеточными патогенами и часто контаминируют культуры клеток в лабораториях и на биомедицинских производствах. Патогенными и потенциально патогенными для человека считаются виды: Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma genitalium. Клиническое значение имеют следующие виды: Mycoplasma pneumoniae - является одним из основных возбудителей внебольничной пневмонии, бронхита и других респираторных заболеваний. Mycoplasma penetrans ассоциируют с саркомой Капоши и прогрессией СПИДа у ВИЧ-инфицированных. Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma genitaiium и Mycoplasma fermentans - урогенитальные микоплазмозы, ответственные за развитие негонококкового уретрита, эпидидимита, воспалительных заболеваний органов малого таза, патологий беременности и плода и некоторые случаи бесплодия [2].

Существует множество основанных на полимеразной цепной реакции тест-систем для выявления как отдельных видов Mycoplasma и Ureaplasma, так и суммарно представителей класса молликут в различных видах биоматериала, включая культуры клеток [3-7]. Чаще всего для этого используют высококонсервативный участок спейсерного региона рибосомальной РНК [8-10].

Из уровня техники известны следующие аналоги предлагаемого изобретения:

1. Патент №US 5693467 A (1995) Mycoplasma polymerase chain reaction testing system using a set of mixed and single sequence primers (Система тестирования микоплазм методом полимеразной цепной реакции с использованием вырожденного и уникального праймеров) [11].

Изобретение относится к усовершенствованной системе для специфичного, чувствительного и быстрого обнаружения присутствия и идентификации микоплазм, содержащихся в образце, путем амплификации с помощью гнездовой ПНР, в которой используется смесь первой стадии ПЦР и праймеры второй стадии ПЦР, каждый из которых содержит по меньшей мере одну невырожденную последовательность и по меньшей мере один праймер с вырожденной последовательностью.

2. Патент №ЕР 3450573 В1 (2009) COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING NUCLEIC ACID FROM MOLLICUTES (СОСТАВЫ И МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ МОЛЛИКУТОВ) [12].

Изобретение относится к композициям, реакционным смесям, наборам и способам, используемым для амплификации нуклеиновых кислот различных видов класса Mollicutes. Реакции амплификации представляют собой моноплексные реакции или, более предпочтительно, являются мультиплексными реакциями. В некоторых аспектах и вариантах реализации конкретные области 23S рРНК или гена, кодирующего указанную рРНК, были идентифицированы как предпочтительные мишени для реакций амплификации нуклеиновых кислот образца, предположительно содержащего по меньшей мере один вид Mollicutes. Целевая гибридизующаяся область имеет длину от 20 до 24 азотистых оснований. В другом аспекте указанная целевая гибридизующаяся область по меньшей мере на 95% идентична последовательности с SEQ ID NO:38. В другом аспекте указанная целевая гибридизующаяся область по меньшей мере на 95% идентична последовательности с SEQ ID NO:39.

3. Патент RU 2770204 С1 (2021) Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени [13].

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для выявления микроорганизма Ureaplasma diversum в различном биологическом материале. Способ включает подготовку образца, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных области гена 16 S рибосомальной РНК Ureaplasma diversum, содержащего прямой (Udv_F5'-CATTTACTTGCATGAGTGAATG-3') и обратный (Udv_R5'-AGCTACGCGTCAATGAC-3') праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (Udv_Z5'-(ROX)-TGGATGAGGGTGCGACGTATCATCC-(BHQ)-3'), и реакционную смеси. Амплификация проводится по следующей программе: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 55°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала на канале ROX/Orange). Результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией и диагностируют наличие генома бактерии Ureaplasma diversum. Изобретение позволяет выявить ДНК Ureaplasma diversum в спермопродукции, предназначенной для искусственного осеменения крупного рогатого скота, с высокой специфичностью и чувствительностью.

4. Патент №RU 2799416 С1 (2022) Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту ДНК гена 16S рибосомальной РНК рода Ureaplasma семейства Mycoplasmataceae порядка Mycoplasmatales (Ureaplasma spp.) класса Mollicutes для детекции патогенных уреаплазм кошек и собак [14].

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Представлен набор праймеров к фрагменту гена 16S рибосомальной РНК семейства рода Ureaplasma семейства Mycoplasmataceae порядка Mycoplasmatales класса Mollicutes (Ureaplasma spp.) для детекции патогенных уреаплазм кошек и собак в клинических образцах, секционных пробах, культуральных жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач свойств патогенных уреаплазм кошек и собак. Изобретение позволяет идентифицировать в реальном времени ДНК фрагмента гена 16S рибосомальной РНК рода Ureaplasma семейства Mycoplasmataceae порядка Mycoplasmatales класса Mollicutes (Ureaplasma spp.), обладающего более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время патогенным уреаплазмам кошек и собак, что повышает достоверность и надежность анализов.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является: 5. Патент №US 20080187916 A1 (2007) Identification of cell culture contaminants among Mollicutes species by a PCR based assay (Идентификация загрязнения клеточных культур видами Mollicutes с помощью ПЦР-анализа) [15].

Изобретение охватывает нуклеиновые кислоты, способы, композиции и наборы для чувствительного, быстрого и специфичного обнаружения видов Mycoplasma, Acholeplasma, Ureaplasma, Phytoplasma и Spiroplasma в образце. В изобретении используются специфичные праймеры и методы амплификации, позволяющие дифференцировать виды за счет специфичной амплификации целевых нуклеиновых кислот Mollicute. В одном варианте осуществления изобретение использует различные температуры плавления (Tm) различных потенциальных продуктов ПЦР для определения того, являются ли они продуктами специфичной целевой амплификации, неспецифичными продуктами амплификации, продуктами положительного контрольного образца или продуктами димера праймеров.

Настоящее изобретение относится к композициям, реакционным смесям, наборам и способам, используемым для моноплексной амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов класса Mollicutes для выявления возбудителей класса Mollicutes в биологическом материале человека и животных, в частности, в аутологичных и аллогенных биомедицинских клеточных продуктах (БМКП), отличающееся тем, что в качестве способа определения присутствия нуклеиновых кислот микроорганизмов класса Mollicutes в исследуемом образце при постановке ПЦР используют два синтетических олигонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый зонд, специфичные определенному участку гена 16SpPHK:

праймер 1: 5'-CGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3' праймер 2: 5'-CCATGCACCATCTGTCACTCTG-3' зонд: 5'-BHQ1-CCACCCCTTG(FAMdT)GCGGGTCCCCG-P-3' где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, FAMdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к внутреннему нуклеотиду Т, Р - присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду остаток фосфорной кислоты для блокирования удлинения зонда полимеразой.

На основании полученных пороговых циклов (Ср) можно оценить количество микроорганизмов в исследуемом материале.

Описание (раскрытие) изобретения:

Предложен способ выявления ДНК микроорганизмов класса Mollicutes методом ПЦР-РВ в биологическом материале человека и животных, в частности, в биомедицинских клеточных продуктах (БМКП).

Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с регистрацией результатов непосредственно во время реакции (ПЦР-РВ, ПЦР «в реальном времени») - это высокоспецифичный и высокочувствительный метод выявления примесей микробной ДНК в исследуемом образце. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного микроорганизма или группы микроорганизмов. Реакция ПЦР осуществляется ферментом Taq-полимеразой, которая умеет удлинять олигонуклеотидные затравки (праймеры) с быстрым накоплением специфичного продукта реакции.

Основным достоинством метода ПЦР как молекулярно-биологического исследования является его чрезвычайно высокая чувствительность. Используемые в медицинской практике тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать патогенные для человека микроорганизмы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим) их выявление невозможно. Система детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени», наряду с ответом на вопрос о наличии или отсутствии в исследуемом образце ДНК инфекционного возбудителя, позволяет оценить его количество.

Работа над созданием олигонуклеотидов, применяемых в подобных ПЦР-наборах, строится обычно следующим образом:

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов, либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма, путем выравнивания множества геномных последовательностей выбирается участок генома, специфичный для данного микроорганизма (или группы микроорганизмов). Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей геномов многих организмов друг с другом, поиск уникальных для интересующего микроорганизма участков генома, не имеющих аналогов у других организмов.

2) На основании выбранного участка генома подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР (как правило, это два праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в выборе участка последовательности, где есть группа-специфичные замены нуклеотидов, отличающие целевой микроорганизм от других, на которые и ориентируют праймеры и зонд.

3) Изготовление праймеров и зонда обычно заказывают в специальном сервисном центре.

4) С помощью практических экспериментов доказывают пригодность выбранных последовательностей олигонуклеотидов для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).

Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК микроорганизмов класса Mollicutes методом ПЦР-РВ в биологическом материале человека и животных, в частности, в биомедицинских клеточных продуктах (БМКП) с большей чувствительностью и специфичностью и за меньшее время, чем существующие аналогичные решения.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является быстрое достоверное высокочувствительное обнаружение микроорганизмов класса Mollicutes методом ПЦР-РВ в биологическом материале человека и животных, в частности, в биомедицинских клеточных продуктах (БМКП).

Указанный результат достигается путем использования при выполнении ПЦР набора следующих синтетических олигонуклеотидов:

где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, FAMdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к внутреннему нуклеотиду Т, Р - присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду остаток фосфорной кислоты для блокирования удлинения зонда полимеразой.

Указанные синтетические олигонуклеотиды являются составной частью набора следующих веществ: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (1 мМ каждого), реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0,8% Р40, 20 мМ MgCl2), фермент Taq-полимеразу (2,5 ед. на реакцию), масло минеральное.

И праймеры, и зонд представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома, вводят в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Зонд (специфичный к участку ДНК между праймерами) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образовавшегося продукта реакции, что, в свою очередь, зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Праймеры в реакции выступают в качестве компонентов, обеспечивающих прохождение реакции, а зонд - в качестве компонента, обеспечивающего наблюдение за ходом реакции и регистрацию результатов.

Осуществление (реализация) изобретения:

1) Биологический материал (цельная кровь, плазма крови, образцы тканей, клеточные культуры, среды после культивирования клеток) перед проведением ПЦР проводят через процедуру пробоподготовки с использованием любого стандартного способа или подходящего коммерческого набора реагентов (набор реагентов для пробоподготовки не является предметом данного патента); в ходе процедуры пробоподготовки из биологического материала экстрагируется суммарная ДНК, которую используют для последующей ПЦР;

2) Готовят смесь реагентов, содержащую синтетические олигонуклеотидные праймеры (5 мкМ) и флуоресцентно-меченый зонд (1 мкМ), специфичные к участку гена 16S рРНК, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (1 мМ), реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8,8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl2), фермент Taq-полимеразу (2,5 ед. на реакцию), масло минеральное.

3) В каждую пробирку с реакционной смесью вносят соответствующий очищенный образец исследуемой ДНК;

4) Все пробирки устанавливают в термоблок детектирующего амплификатора (например ДТлайт или ДТпрайм, ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) и проводят реакцию по следующей программе: 94°С - 10 сек, 68°С - 10 сек, 45 циклов, с регистрацией флуоресценции при 68°С. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором в автоматическом режиме. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к амплификатору.

В случае образования специфичного продукта ДНК зонд разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется детектирующим амплификатором.

Список использованных источников

1. Daniel R. Brown, Robert F. Whitcomb and Janet M. Bradbury Revised minimal standards for description of new species of the class Mollicutes (division Tenericutes). Int J Syst Evol Microbiol (2007) 57 2703-2719; doi:10.1099/ijs.0.64722-0

2. Kokkayil P, Dhawan B. Ureaplasma: current perspectives. Indian J Med Microbiol. 2015 Apr-Jun; 33(2):205-14. doi: 10.4103/0255-0857.154850. PMID: 25865969.

3. Spaepen M, Angulo AF, Marynen P, Cassiman JJ. Detection of bacterial and mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction. FEMS Microbiol Lett. 1992 Nov 15; 78(1):89-94. doi: 10.1016/0378-1097(92)90293-w. PMID: 1468621.

4. Razin S. DNA probes and PCR in diagnosis of mycoplasma infections. Mol Cell Probes. 1994 Dec; 8(6):497-511. doi: 10.1006/mcpr.1994.1071. PMID: 7700272.

5. Deutschmann SM, Kavermann H, Knack Y. Validation of a NAT-based Mycoplasma assay according European Pharmacopoiea. Biologicals. 2010 Mar; 38(2):238-48. doi: 10.1016/j.biologicals.2009.11.004. Epub 2010 Mar 6. PMID: 20207553.

6. Dobrovolny PL, Bess D. Optimized PCR-based detection of mycoplasma. J Vis Exp.2011 Jun 20; (52):3057. doi: 10.3791/3057. PMID: 21712802; PMCID: PMC3197068.

7. Sung J, Hawkins JR. A highly sensitive internally-controlled real-time PCR assay for mycoplasma detection in cell cultures. Biologicals. 2020 Mar; 64:58-72. doi: 10.1016/j.biologicals.2019.12.007. Epub 2020 Jan 16. PMID: 31956000.

8. Barry T, Colleran G, Glennon M, Dunican L K, Gannon F. The 16s/23s ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify eubacteria. PCR Methods Appl. 1991; 1:51-56.

9. Teyssou R, Poutiers F, Saillard C, Grau O, Laigret F, Bove JM, Bebear C. Detection of mollicute contamination in cell cultures by 16S rDNA amplification. Mol Cell Probes. 1993 Jun; 7(3):209-16. doi: 10.1006/mcpr. 1993.1030. PMID: 8366866.

10. Kong F, James G, Gordon S, Zelynski A, Gilbert GL. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture. Appl Environ Microbiol. 2001 Jul; 67(7):3195-200. doi: 10.1128/AEM.67.7.3195-3200.2001. PMID: 11425741; PMCID: PMC93000.

11. Патент №US5693467A (1995) Mycoplasma polymerase chain reaction testing system using a set of mixed and single sequence primers (Система тестирования микоплазм методом полимеразной цепной реакции с использованием вырожденного и уникального праймеров).

12. Патент №ЕР 3450573 В1 (2009) COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING NUCLEIC ACID FROM MOLLICUTES (СОСТАВЫ И МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ МОЛЛИКУТОВ).

13. Патент RU 2770204 С1 (2021) Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени.

14. Патент №RU 2799416 С1 (2022) Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту ДНК гена 16S рибосомальной РНК рода Ureaplasma семейства Mycoplasmataceae порядка Mycoplasmatales (Ureaplasma spp.) класса Mollicutes для детекции патогенных уреаплазм кошек и собак.

15. Патент №US 20080187916 А1 (2007) Identification of cell culture contaminants among Mollicutes species by a PCR based assay (Идентификация загрязнения клеточных культур видами Mollicutes с помощью ПЦР-анализа).

--->

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" fileName="Способ выявления

ДНК микроорганизмов класса Mollicutes в крови и других биоматериалах методом ПЦР-

РВ.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-

08-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023135384/10(077285)</ApplicationNumberText>

<FilingDate/>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText> 2023135384/10(077285)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-27</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства,

гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>

FSBI NATIONAL MEDICAL RESEARCH CENTER FOR OBSTETRICS, GYNECOLOGY

AND PERINATOLOGY NAMED AFTER ACADEMICIAN V.I.KULAKOV, MINISTRY

OF HEALTH OF THE RUSSIAN FEDERATION

</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Денис Владимирович Ребриков</InventorName>

<InventorNameLatin>Denis Rebrikov</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">

Способ выявления ДНК микроорганизмов класса Mollicutes в крови и других

биоматериалах методом ПЦР-РВ

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Ureaplasma diversum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgtggggagcaaacaggattag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Ureaplasma diversum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatgcaccatctgtcactctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Ureaplasma diversum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>BHQ1 dark fluorescence quencher</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>BHQ1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>

присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции

</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FAMdT</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>

флуоресцентный краситель FАМ, присоединенный к внутреннему нуклеотиду Т

</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>P</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>

присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду остаток фосфорной кислоты для блокирования удлинения зонда полимеразой

</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccaccccttgtgcgggtccccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу выявления ДНК микроорганизмов класса Mollicutes методом ПЦР-РВ в биологическом материале человека и животных. В указанном способе в качестве способа определения присутствия нуклеиновых кислот микроорганизмов класса Mollicutes в исследуемом образце при постановке ПЦР используют два синтетических олигонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый зонд, специфичные участку гена 16S рРНК. Настоящее изобретение обеспечивает быстрое достоверное высокочувствительное обнаружение микроорганизмов класса Mollicutes методом ПЦР-РВ в биологическом материале человека и животных. 1 табл.

Способ выявления ДНК микроорганизмов класса Mollicutes методом ПЦР-РВ в биологическом материале человека и животных, отличающийся тем, что в качестве способа определения присутствия нуклеиновых кислот микроорганизмов класса Mollicutes в исследуемом образце при постановке ПЦР используют два синтетических олигонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый зонд, специфичные участку гена 16S рРНК:

праймер 1: 5' - CGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3'

праймер 2: 5' - CCATGCACCATCTGTCACTCTG-3'

зонд: 5' - BHQ1-CCACCCCTTG(FAMdT)GCGGGTCCCCG-P-3'

где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, FAMdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к внутреннему нуклеотиду Т, Р - присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду остаток фосфорной кислоты для блокирования удлинения зонда полимеразой.