СПОСОБ ОЦЕНКИ ГИПОКСИИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относиться к области медицины, например к кардиологии, онкологии.

Известен тест с нагрузкой для изучения сердечный недостаточности, включающий оценку мышечного, почечного кровотока (окислительных и гликолитических функций), выполняемые в эксперименте на красах (Ekiund К.Е., Hageman K.S., Poole D.C., Musch T.I. Impact of aging on muscle blood flow in chronic heart failure. // J. Appi Physiol. 2005 Mar 31; [Ерub ahead of print]. Существенным недостатком этого метода является: 1) низкая производительность и высокие материальные затраты, т.к. тот метод 1) осуществляется в эксперименте на крысах, но не на людях, 2) применяются радиоактивные микросферы и регистрационное оборудование, 3) не учитываются изменения иммунной системы. 4. Тест проводится в условиях только хронической сердечной недостаточности.

Известен метод изучения сердечной недостаточности, включающий оценку фактора некроза опухоли альфа (ФНО) и белок МСР (monocyte chetmoattraction protein) - 1 в сыворотке крови, которые могут влиять на мышечную металлопротеиназу. Этот метод выполняется в эксперименте на крысах. Метод учитывает изменения со стороны иммунной системы, но существенным недостатком является 1) низкая производительность и высокие материальные затраты, высокая стоимость, 2) метод применяется на лабораторных животных, но не на людях, 3) не учитывает непосредственно клетки органа иммунитета (лимфоидного органа), небных миндалин (Thorud H.M., Stranda A., Birkeland J.A., Lunde P.K., Sjaastad I., Sejersted О.М., Iversen P.O. Enhance matrix metalloproteinase activity in skeletal muscles of rat with congestive heart failure. // Am J Physiol Regul Interg Comp Physiol. 2005. Mar 31 [Epub ahead of print]. Гипоксия возникает, например, при сердечной недостаточности. Гипоксия играет основную роль в патогенезе кардиологической дисфункции (Ciardano F.J. Oxigen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure. // J Clin Invest. 2005; 115 (3): 500-508).

Для изучения сердечной недостаточности у людей применяются тесты с нагрузкой (велэргометрия): Niebauer J., Dark A.L., Webb-Peploe K.M., Boger R., Coats A.J. Home-based exercise training modulates pro-oxidant substrates in patent with chronic heart failure. / Eur J. Heart Fail. 2005; 7 (2): 183-188; Комаров Ф.И., Ольбинский Л.И. НАЧАЛЬНАЯ СТАДИЯ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ. - М.: Медицина, 1978, стр.67). Для этой пробы применяется велосипедный эргометр с прогрессивным непрерывным или поэтапным увеличением дозированных нагрузок. Рекомендуются следующие параметры для оценки максимальной нагрузки: 1) максимальная чистота пульса, 2) кислородный пульс, увеличиваясь параллельно увеличению мощности нагрузки, образует плато на высоте максимальной нагрузки. Перечисленные показатели основываются на динамике частоты пульс, потребления кислорода и состояния органов дыхания (выраженности гипоксии). Существенные недостатки этого метода являются 1) низкая производительность, 2) трудоемкость, 3) высокие материальные затраты. Их причины следующие: 1) у больных с поражением сердца максимальная нагрузка невыполнима (стр.69), т.к. низкий коронарный резерв у больных с ишемической болезнью сердца заставляет прекращать работу уже на первой ступени нагрузки (стр.72), 2) проба с нагрузкой предусматривает определенный медицинский риск и поэтому ее должен проводить специально подготовленный персонал в специально оборудованных кабинетах (стр.75), 3) эти тесты многоэтапные, занимают много времени, 3) также не учитываются изменения иммунной системы. Этот метод считается прототипом.

Конечный технический результат предлагаемого решения (СОГ) заключается: 1. Повысить производительность как минимум 10 раз за счет снижения материальных затрат (для СОГ не требуется специально оснащенной комнаты и дорогостоящего оборудования, например, как велэргометра, монитора и др.) и расширения показаний к СОГ (с инфарктами и лежачими пациентами СОГ показаны). 2. Повысить экономичность в 10 раз за счет не дорогостоящего оборудования и сокращения времени для проведения СОГ. 3) Повысить достоверность на 3 порядка за счет исследования клеток органа иммунитета - небных миндалин, в которых при сердечной недостаточности обнаруживается и определяется степень пролиферации эпителия небных миндалин и снижения числа лимфоцитов.

Способ оценки гипоксии (СОГ) выполняется в положении пациента сидя или лежа, в зависимости от его состояния. Пациент открывает рот и производится соскоб с небных миндалин под визуальным контролем с помощью, например, кюретки стоматологической. Клеточный материал переносится на предметное стекло и окрашивается по Романовскому-Гимзе или Гимзе. Клетки изучают с помощью светового микроскопа: 1) обнаруживают пролиферацию эпителия, 2) определяют степень пролиферации эпителия (учитывают количество этих участков и морфологические особенности клеток в них и 3) существенное уменьшение количества лимфоцитов. При тяжелой степени гипоксии пролиферация выраженная, количество участков (островков) пролиферации увеличивается, в них появляются клетки с признаками дискариоза и атипии. Такой реакции не выявляется у людей практически здоровых и у пациентов, которые успешно прошли курс лечения по поводу, например, I и II А стадии сердечной недостаточности.

Для достижения конечного технического результата решались следующие задачи. При этом оценка гипоксии осуществляется, с помощью изучения степени реакции клеток небных миндалин: 1) реакция эпителия небных миндалин в виде появления участков (островков) пролиферации, 2) изменение количества участков пролиферации и морфологии пролиферирующих клеток, 3) существенное снижение количества лимфоцитов. При этом также учитывалось следующее. Пролиферация - размножение клеток. Образование новых клеток на базе уже существующих клеток называется также и гиперплазией (А.И.Струков, В.В.Серов. Патологическая анатомия. - М.: Медицина, 1979, стр.99). Акцент на значимость этого критерия (показателя) также делается также и в книге Н.Н.Шиллер-Волковой «Цитологической диагностики злокачественных новообразований». - М.: Медицина, 1964, на стр.105: «Основываясь на изучении этих изменений с учетом расположения клеток в препарате, можно правильно определить степень выраженности пролиферации и даже отметить ее биологическую направленность…». Этот тезис фундаментальный и потому не потерял своего значения в современных условиях. Там же: «…для клинициста может представлять определенную ценность и характеристика пролиферативных процессов…»; приводятся виды пролиферации эпителия: а) без атипии клеток; б) с атипией отдельных клеток или ядер. Дискариоз - морфологические описательные и связаны с появлением определенных морфологических признаков в измененной клетке: 1) непропорциональное увеличение ядра, 2) неправильная форма и контуры ядра, 3) гиперхромия, 4) неравномерная конденсация хроматина и утолщение мембраны, 5) аномалии в числе, размере и форме ядрышек, 6) многоядерность в сочетании с любым из перечисленных признаков.

Были сформированы следующие группы пациентов (таблица): 1. Практически здоровые пациенты. 2. Пациенты с хронической сердечной недостаточности (ХСН) I, II А стадия. 3. Пациенты с ХСН 2-3 стадия (тяжелая степень). 4. Прошедшие курс лечения с ХСН I и IIА стадия. Все обследуемые пациенты были лица пожилого возраста 60 лет и старше (см. таблицу). Диагноз ХСН ставился или исключался согласно показаниям методов исследования, проводимых согласно следующей схемы: стандартный опрос, физический осмотр, проведение теста 6-минутной ходьбы, запись ЭКГ покоя в 12 стандартных отведениях, определение биохимических показателей крови - общего холестерина, ТГ, альфа-холестерина, АЛТ, общего билирубина, электролитов, фибриногена и глюкозы крови н/т, определение ФВ ЛЖ с помощью ЭхоКГ, кардиоторакального индекса по обзорной рентгенограмме (или ФЛК) органов грудной клетки. В схемы терапии включались и АПФ, дигиталис, периферические вазодилятаторы, мочегонные препараты, антогонисты альдостерона. Результаты исследований обработаны с использованием пакета прикладных программ, версия 13,0. Достоверность различий оценивалась по критерию Wilcoxon, уровень значимости считали достоверным при р<0,005. Соскоб с небных миндалин (НМ) производился у пациентов всех названных групп согласно описанию в заявке (стр.2.). С НМ одного пациента изготовляли 5 мазков. В каждом мазке подсчитывалось количество пролиферирующих участков (островков) и их диаметр с помощью микрометрической линейки и окуляр микрометра (Г.Г.Автандилов. Морфометрия в патологии. // М.: Медицина, 1973; М.Р.Сапин с соавт. Лимфатический узел. // М.: Медицина, 1978, стр.231) и др.). В островках пролиферации подсчитывалось количество пролиферирующих клеток общепринятым методом «сплошного прохождения мазка». При идентификации клеток учитывались рекомендации М.Г.Абрамова (Гематологический атлас. // М.: Медицина, 1985). Количество лимфоцитов подсчитывалось не менее чем на 5 мазках соскобов небных миндалин от одного пациента. В каждом мазке дифференцировалось 500 всех типов клеток. Затем вычислялось среднее процентное содержание лимфоцитов. Статистическая обработка цифрового материала производилась методом математической статистики (А.А.Гуцол с соавт., 1988). По набору отдельных измерений определялась средняя величина параметров. Для оценки получаемых значений определялся коэффициент вариации. Статистическая достоверность измерений определялась с помощью смещенной оценки среднего квадратического отклонения. Достоверность различий между средними величинами оценивалась согласно критерия Стьюдента при Р<0,05.

Из приведенных в таблице данных видно, что количественные показания представленных параметров в группах 2 и 3 достоверно отличаются от количественных показаний параметров, приведенных в группах 1 и 4, как достоверно отличаются количественные показатели приведенных параметров в группе 2 в сравнении с группами 1, 3 и 4, соответственно тяжести процесса.

СОГ выполняется посредством микроскопического анализа клеточного материала небных миндалин, который получают посредством соскоба с небных миндалин с помощью кюретки, при этом пациент находится в положении лежа или сидя, рот открыт, язык высовывается из полости рта. Пролиферация эпителия (учитываются также количество участков пролиферации, их морфологические особенности и уменьшение количества лимфоцитов) выявляется у пациентов, страдающих сердечной недостаточностью. Степень гипоксии связана со степенью тяжести сердечной недостаточности. В этой связи изменяются соответственно и степень пролиферации клеток эпителия небных миндалин (изменение количества участков пролиферации, изменение морфологии клеток в этих участках, появление признаков дискариоза и атипии) и существенное уменьшение количества лимфоцитов (от 80±0,5% в контроле, до 18±0,15% при ХСН II-III стадии). Эти реакции зависят от степени тяжести гипоксии и являются обратимыми при эффективном лечении сердечной недостаточности.

Существенные преимущества СОГ.

1. СОГ противопоказаний не имеет. - Прототип не всегда до конца выполняется у пациентов с ишемической болезнью сердца, а больным стенокардией и низким болевым порогом нагрузки противопоказан. 3. СОГ проводится без осложнений. - Прототип, наоборот, всегда предполагает осложнения и врач всегда должен быть готов к ним и специально обучен. 4. СОГ учитывает изменения органа иммунитета, которые должны корректироваться. - Прототип не учитывает изменений иммунной системы в виде клеточной реакции небных миндалин. 5. СОГ недорогой. - Прототип использует дорогостоящую аппаратуру как велэргометр др. 6. СОГ выполняется без нагрузки на миокард. - Прототип выполняется с нагрузкой на миокард. 7. СОГ позволяет выявлять начальную стадию сердечной недостаточности без дополнительных нагрузок на сердце, не надо крутить педали. - Прототип выявляет начальную стадию сердечной недостаточности только при дополнительных нагрузках на сердце, необходимо крутить педали велэргометра.

Существенные отличия СОГ от прототипа.

1. В СОГ производится соскоб. - В прототипе - соскоб не производится. 2. СОГ не имеет противопоказаний. Прототип противопоказан у пациентов с инфарктом миокарда и тяжелой степенью сердечной недостаточности. 3. В СОГ анализируется клеточный состав небных миндалин. - В прототипе - электрокардиограмма. 4. В СОГ применяется кюретка, микроскоп, предметное стекло, окраска по Гимзе. В прототипе - велэргометр, монитор. 5. Б СОГ учитывается реакция гиперплазии эпителия и изменения количества лимфоцитов. - В прототипе - изменения кардиограммы, или величина потребления кислорода. Эти параметры зависят также от уровня гипоксии. 6. В СОГ пациент открывает рот.- В прототипе - крутит педали велэргометра. 7. В СОГ учитывается состояние клеток органа иммунитета - небных миндалин. - В прототипе учитываются параметры электрических сигналов миокарда. 8. СОГ проводится в условиях стационара, амбулаторий и у постели больного на дому в любом его положении. В прототипе только в специально оборудованных помещениях, в положении сидя, вращая педали. 9. СОГ позволяет выявлять начальную стадию сердечной недостаточности без дополнительных нагрузок на сердце. - Порототип выявляет начальную стадию сердечной недостаточности только при дополнительных нагрузках на сердце. 10. СОГ выявляет участки пролиферации клеток небных миндалин. - В прототипе этого приема нет. 11. В СОГ подсчитывается количество участков пролиферации, учитываются морфологические особенности клеток в них. - В прототипе этого приема нет. 12. В СОГ подсчитывают количество лимфоцитов небных миндалин. - В прототипе этого приема нет.

Предложен способ оценки гипоксии у пациентов при заболеваниях, которые сопровождаются гипоксией, например, при сердечной недостаточности. Способ основан на оценке клеточной реакции органа иммунитета небных миндалин: степени пролиферации эпителия, количества участков пролиферации и уменьшении количества лимфоцитов. Клеточный состав получают с помощью соскоба с небных миндалин, делают мазок и окрашивают по Гимзе или Романовскому-Гимзе с последующим контролем с помощью светового микроскопа. Реакция клеток зависит от степени гипоксии при сердечной недостаточности, чем тяжелее гипоксия, тем существеннее степень изменения клеточных реакций небных миндалин. Пролиферация эпителия и уменьшение количества лимфоцитов небных миндалин не выявляются у здоровых людей, и существенно изменяются у пациентов, прошедших курс лечения по поводу сердечной недостаточности I и II A стадии. Пролиферация эпителия небных миндалин и указанные количественные показатели могут применяться как маркер качественного лечения заболевания, индуцировавшего гипоксию. 1 табл.

Способ оценки тяжести хронической сердечной недостаточности (ХСН), отличающийся тем, что выявляют и оценивают диаметр участков пролиферирующих клеток и относительное количество лимфоцитов в соскобе с небных миндалин, при этом величина диаметра участков пролиферации до (9±0,27) мкм и количество лимфоцитов (40±0,3)% соответствуют ХСН - I-IIA стадии, диаметр участков пролиферации (20±0,8) мкм и количество лимфоцитов (18±0,15)% соответствуют ХСН 2, 3 стадии, отсутствие островков пролиферации и количество лимфоцитов (75±0,6)% соответствуют контрольным величинам практически здоровых людей и после проведенной успешной терапии ХСН - I-IIA стадии.