СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УПЛОТНЕННЫХ БЕЛКОВО-ЛИПИДНЫХ УЧАСТКОВ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ С ПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ BIO VISION Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Клеточная мембрана, в том числе и мембрана эритроцитов, по своему строению представляет белково-липидную мозаику, в которой в среднем 50% от общей массы мембраны приходится на белки. Между белковыми молекулами и липидами в клеточной мембране устанавливается тесное взаимодействие [5, 6]. Полипептидные цепи мембран свертываются в трехмерные структуры, подчиняясь термодинамическим законам, которые управляют функциональной трехмерной конформацией белков. Свертывание линейного полимера аминокислот в крупную трехмерную структуру обусловлено энергией, в результате чего происходит размещение гидрофобных групп в гидрофильной среде.

Липиды и белковые молекулы мембран изучаются разными методами: гель-электрофорезом, тонкослойной хроматографией и т.д. Однако получить визуально представление о конформационном состоянии белково-липидного комплекса биофизически, т.е. в условиях, когда мембрана частично или полностью теряет свое морфофункциональное активное состояние и эти участки уплотняются, до настоящего времени не удавалось. Так, эритроциты периферической крови, исчерпывая свое жизненно активное состояние, начинают приобретать различные переходные формы. Дискоциты могут принимать форму эхиноцитов, мишенеобразную и форму дегенератов и других переходящих форм.

Цель изобретения - разделить эритроциты здоровых лиц, не имевших никаких заболеваний в течение 6 предыдущих месяцев, с помощью компьютерной программы «Mekos» на группы по морфологическому принципу: дискоциты, эхиноциты, мишеневидные, дегенеративные формы. Каждую группу при помощи установки «Mekos» выделить в виде галереи. С помощью компьютерной программы Bio Vision в мембранах отдельных эритроцитов, составляющих ту или иную галерею, выделить участки высокой конденсации белково-липидных комплексов по биофизико-морфологическому принципу.

Недостатки известных способов.

1. Эритроциты периферической крови разделялись на различные морфологические формы на мазках, окрашенных по общепринятым методам, чаще азурэозином либо с помощью растровой микроскопии [1, 2, 3, 4].

2. Во всех ранее известных случаях изучения различных морфологических форм эритроцитов не удавалось выделить в мембранах участки биофизической плотности и классифицировать их по этому принципу.

Первый этап работы.

Предложенный способ осуществлялся следующим образом.

- Кровь забиралась у пациента после прокола кожи безымянного пальца.

- Капля свежей крови помещалась на стекла StatSpin (Product Number SL72), которые размещались в центрифуге DiffSpin Slide Spinner модели М700-10 (США).

- Мазок изготовляется в течение 3 сек после запуска центрифуги. Это дает возможность получить на стекле монослой эритроцитов.

Второй этап работы.

Неокрашенные мазки помещаются под микроскоп установки «Аппаратно-программного определения фотоморфометрических параметров клеток для диагностики заболеваний МекосЦ» - ТУ 9443-001-27543786-97. Регистрационное удостоверение МЗ РФ 29/10010198/128-01. Изделия не подлежат обязательной сертификации.

С помощью этой установки автоматически (из 1500 клеток) составляется таблица процентного содержания морфологически различных видов эритроцитов: дискоциты, эхиноциты, мишеневидные, дегенеративные формы. Было обследовано 30 здоровых женщин, не имевших заболеваний на протяжении 6 предыдущих месяцев. Исследования проводились на базе поликлиники и отделения физиологии и патологии беременных Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Получены средние показатели морфологических форм эритроцитов у здоровых женщин: дискоциты - 87,0±1,1%, эхиноцитов - 2,5±0,06%, мишеневидные - 1,6±0,1%, дегенеративные формы - 7,2±0,09%. Пример 1 (фигура 1); пример 2 (фигура 2).

Установка «Мекос» позволяет после установления процентного содержания различных форм эритроцитов сгруппировать их виде галереи: дискоциты (фигура 3), эхиноциты (фигура 4), мишеневидные (фигура 5), дегенеративные формы (фигура 6).

Третий этап работы.

Из каждой галереи выбиралось по 50 отдельных эритроцитов. Выделенные из галереи эритроциты подвергались компьютерному биофизическому анализу с целью определения площади уплотненных участков и процента, приходящегося на этот участок: дискоциты (фигура 7), эхиноциты (фигура 8), мишеневидные (фигура 9), дегенеративные формы (фигура 10). Выделяются фазы по ранжам (пиксель на дюйм). Предварительно стандартизуется будущее изображение: ширина рисунка - 10 см, разрешающая способность - 300 пикселей на дюйм при постоянном увеличении х40. Исследования во всех случаях проводилось при ранже 120. В мембранах дискоцитов здоровых лиц уплотненные участки - единичные и занимают площадь 10,351±0,15 усл.ед., что составляет по отношению к площади всей мембраны 1,403±0,004% (фигура 7). В эхиноцитах площадь - 19,252±0,2 усл. ед., процент - 2,826±0,03% (фигура 8); в мишеневидных площадь уплотненных белково-липидных комплексов составляет 31,959±0,3 усл. ед., процент - 4,476±0,008% (фигура 9). В дегенеративных эритроцитах уплотненные участки составляют площадь 91,965±1,1 усл. ед., процент - 14,852±0,82% (фигура 10).

Таким образом, предлагаемый способ может с помощью морфобиофизического компьютерного анализа дать оценку степени уплотнения («старения») мембраны в зависимости от структурных изменений эритроцита, позволяет различать дискоциты от эхиноцитов, мишеневидных и дегенеративных форм.

Литература

1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии / А.И.Воробьев. - Изд. «Ньюдиамед». - М. - 2007. - 1275 с.

2. Кассирский И.А. Клиническая гематология / И.А.Кассирский, Г.А.Алексеев. - Изд. «Медицина». - М. - 1970. - 800 с.

3. Рябов С.И. Основы физиологии и патологии эритропоэза / С.И.Рябов. - Изд. «Медицина». - Ленинградское отделение. - 1971. - 255 с.

4. Шиффман Ф. Патофизиология крови / Binom Publishers. - М. - Невский Диалект. - Санкт-Петербург. - 2001. - 441 с.

5. Deisenhofer J. The structure of the protein subunits in the photosynthetic reation centre of Rhodopseudomonds viridis at 3 Aresolution / J.Deisenhofer, O.Epp, K.Miki, R.Huber, H.Michel // Nature. - 1985. - vol.318. - P.618-624.

6. Singer S. The fluid mosaic model of the structure of cell membrane / S.Singer, G.Nicolson // Science. - 1972. - vol.175. - P.720-731.

Изобретение относится к медицине. Для определения уплотненных белково-липидных участков в мембранах эритроцитов различной степени зрелости разделяют эритроциты здоровых лиц, не имевших никаких заболеваний в течение 6 предыдущих месяцев, по морфологическому принципу: дискоциты, эхиноциты, мишеневидные, дегенеративные формы. Выделяют каждую группу в виде галереи. Выделяют с помощью компьютерной программы Bio Vision участки высокой конденсации белково-липидных комплексов в мембранах отдельных эритроцитов, составляющих свою галерею. Определяют их площадь и процент отношения к площади всей мембраны. При этом в мембранах дискоцитов уплотненные участки составляют 1,403±0,004%; в эхиноцитах - 2,826±0,03%; в мишеневидных эритроцитах - 4,476±0,008% и в мембранах дегенеративных форм - 14,852±0,82%. Использование способа позволяет дать оценку уплотнения мембраны в зависимости от структурных изменений эритроцитов, различить дискоциты от эхиноцитов, мишеневидных и дегенеративных форм. 10 ил.

Способ определения уплотненных белково-липидных участков в мембранах эритроцитов различной степени зрелости, включающий разделение эритроцитов здоровых лиц, не имевших никаких заболеваний в течение 6 предыдущих месяцев, с помощью компьютерной морфометрии по морфологическому принципу: дискоциты, эхиноциты, мишеневидные, дегенеративные формы; выделение каждой группы в виде галереи; выделение с помощью компьютерной программы Bio Vision участков высокой конденсации белково-липидных комплексов в мембранах отдельных эритроцитов, составляющих свою галерею, определение их площади и процента отношения к площади всей мембраны, при этом в мембранах дискоцитов уплотненные участки составляют (1,403±0,004)%; в эхиноцитах - (2,826±0,03)%; в мишеневидных эритроцитах - (4,476±0,008)% и в мембранах дегенеративных форм - (14,852±0,82)%.