КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Z, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН Российский патент 2010 года по МПК C12N5/09 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2) и мутированные антигены (MUC-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и PRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые не доступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов, иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (питотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланомаспецифичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентная вакцина), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт.[3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении злокачественных новообразований.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Z из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК(П) 711Д.

Родословная клеточной линии melZ

Линия клеток получена из опухолевого образца пациентки З.З.С., женского пола, 55 лет, и/б 03/12300, находившейся на лечении в 2003 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи спины. Материал получен при хирургическом удалении метастатического узла из мягких тканей межлопаточной области. Предыдущее лечение: хирургическое, химиотерапия, иммунотерапия.

Получение клеточной линии melZ

Опухолевая ткань получена при хирургическом удалении метастазов кожи. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 20 пассаже.

Морфологические признаки mel Z

Цитограмма культуры mel Z состоит из клеток веретенообразной, вытянутой удлиненной, отросчатой формы и немногочисленных клеток округлой формы. Ядра клеток овальной, округлой и неправильной формы, нормо- и гиперхромные с зернистым и грубоглыбчатым строением хроматина. Ядра содержат одно или несколько мелких ядрышек. Цитоплазма клеток негомогенная, умеренно базофильная с розоватым оттенком. Имеются двух ядерные клетки и небольшое количество гигантских многоядерных клеток с 4-6 ядрами. Часто выявляются фигуры деления клеток.

Кариологическая характеристика клеточной линии melZ

Дата фиксации клеток: 27.04.06

Культура равномерна по диаметрам ядер, плотности окраски и состоянию хроматина. Проанализировано 43 метафазы. Число хромосом колеблется от 44 до 46. Модальное число хромосом соответствует диплоидному набору (2n). Наблюдается трисомия по хромосоме 7; моносомия по хромосоме 11; дериватная хромосома, состоящая из короткого плеча хромосомы 1, длинного плеча хромосомы 9 и сегмента хромосомы 1 проксимальнее 1р31, транспонированного на конец короткого плеча хромосомы 1; транслокация двух длинных плеч хромосомы 1 с образованием изохромосомы; транслокация короткого плеча 6 и длинного плеча 9 хромосом; транслокация части длинного плеча 6 хромосомы на конец длинного плеча 17 хромосомы (сегмент хромосомы 6 дистальнее 6q22 транслоцировался на хромосому 17 в участке 17q24). Таким образом, дисбаланс кариотипа заключается в частичной моносомии по короткому плечу хромосомы 1, трисомии по короткому плечу хромосомы 6, трисомии по хромосоме 7, нуллисомии по короткому плечу хромосомы 9 и моносомии по хромосоме 11.

Kapиотип - 44~46,XX,der(1;1;9)(1pter→1p31::1p36→1p10::9q10→9qter),

i(1)(qter→q10::q10→qter),der(6;9)(6pter→6p10::9q10→9qter),

t(6;17)(6pter→6q22::17q24→17qter;17pter→17q24::6q22→6qter),+7,-11

Культуральные свойства клеточной линии melZ

Клеточная линия met Z культивируется в питательной среде RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов: 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс./мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, 10%ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см³. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии melZ

Пример 1. Культивирование клеточной линии met Z

Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 20 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel Z

Полученная клеточная линия mel Z, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, гистосовместимости, раково-тестикулярные).

Дифференцировочный меланомный маркер, определяющий отношение данной линии к меланоме, исследован нами с помощью моноклональных антител CD63. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции. Раково-тестикулярные маркеры, которые могут быть экспрессированы на опухолях различного гистогенеза, исследованы в реакции ПЦР. Полученные данные отражены в таблице.

Экспрессия антигенов на клеточной линии melZ Дифференцировочные Антигены Раково-тестикулярные Антигены Антигены гистосовместимости CD63 положит. MAGE Слабо положит. HLA _{(I класс)} положит.         HLA-DR_{(II класс)} отр.

Как следует из таблицы, данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомного маркера CD63, подчеркивающего специфичность данной клеточной линии. Слабо положительная экспрессия раково-тестикулярных маркеров класса MAGE (слабо положит.) соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Антигены гистосовместимости представлены молекулой первого класса (HLA).

Данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомного дифференцировочного маркера CD63, антигена первого класса гистосовместимости и раково-тестикулярных маркеров класса MAGE (слабо положит.). Антиген гистосовместимости второго класса отсутствует.

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочного антигена CD63; молекулы гистосовместимости первого класса и слабо положительных раковотестикулярных маркеров класса MAGE, что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.

Литература

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25:1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 149:659-663, 1993.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690:120.

4. Sondak V.K. Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine/ Semin cancer Biol. 2003. Dec.13(6):409-15.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин. Клеточная линия меланомы человека mel Z обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 711Д. Изобретение позволяет расширить арсенал клеточных линий меланомы человека, используемых для создания противоопухолевых вакцин, применяемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований. 1 табл.

Клеточная линия меланомы человека mel Z, используемая для получения противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 711Д.