СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, пульмонологии, внутренним болезням, и может быть использовано для дифференциальной диагностики бронхиальной астмы (БА).

Известен способ дифференциальной диагностики БА, заключающийся в иммуноцитохимическом определении экспрессии транскрипционного фактора STAT6 (Signal transductor and activator of transcription - сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции) в биоптате легкого, полученном в ходе фибробронхоскопии у больных аллергической и неаллергической БА [Christodoulopoulos P., Cameron L, Nakamura Y., Lemiére С, Muro S., Dugas M., Boulet L-P., Laviolette M., Olivenstein R., Hamid Q. Th2 cytokine-associated transcription factors in atopic and nonatopic asthma: evidence for differential signal transducer and activator of transcription 6 expression. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2001. - Vol.107, №4. - P.586-591]. Этот способ принят авторами за прототип.

Хотя описанный выше способ является достаточно специфичным, тем не менее, высокая инвазивность и травматичность способа, связанная с проведением фибробронхоскопии и биопсии, резко ограничивают его использование даже в специализированных пульмонологических стационарах и пульмонологических отделениях, а в целом ряде случаев даже исключают его применение для указанной цели.

Необходимость точной дифференциальной диагностики БА диктуется современными требованиями к дифференцированному лечению этих больных, которое обеспечивает высокое качество медицинской помощи на основе инновационных способов диагностики.

Задачей изобретения является разработка безопасного, эффективного и специфичного способа дифференциальной диагностики БА.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе дифференциальной диагностики БА путем иммунологического исследования согласно изобретению определяют уровень транскрипционного фактора pSTAT6 в условиях активации IL-4 лимфоцитов периферической венозной крови и при уровне pSTAT6 менее 1,22 диагностируют неаллергическую БА, а при уровне pSTAT6 более 1,23 диагностируют аллергическую БА.

В процессе разработки способа установлен феномен, ранее не описанный, заключающийся в различной степени активации транскрипционного фактора pSTAT6 под влиянием IL-4 в лимфоцитах периферической венозной крови у больных аллергической и неаллергической БА.

Изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как технический результат достигнут за счет нового существенного признака изобретения.

  Транскрипционный фактор Больные неаллергической БА (n=19) Больные аллергической БА (n=9) Медиана Процентили Медиана Процентили 5-й 95-й 5-й 95-й pSTAT6 исходно 0,3 0,0008 0,731 0,43 0,007 1,94 pSTAT6 в условиях активации IL-4 0,697 0,036 1,219 4,8* 1,237 8,75 Примечание: * - значимость (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни для несвязанных совокупностей) (р<0,05) - сравнение с неаллергической бронхиальной астмой.

В таблице представлены результаты проведенных исследований по предлагаемому способу. Всего было обследовано 28 человек, среди них 19 больных неаллергической БА и 9 больных аллергической БА. Из таблицы видно, что при сравнении обеих групп уровни pSTAT6 мало отличаются в исходном состоянии и имеют значительное отличие при активации pSTAT6 под влиянием IL-4, что позволило использовать это отличие в качестве существенного признака изобретения.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы "Excel 7" и статистического пакета "Statistica 6" с использованием методов и критериев непараметрической статистики при малом значении n (числа наблюдений): критерия Вилкоксона-Манна-Уитни, коэффициента корреляции Спирмана и так далее. Заключение о статистической значимости давалось при уровне вероятности ошибочного заключения не менее 0,05.

Для обработки и анализа полученных данных (с регистрацией интегрированной плотности по стандартной методике) использовали программы Adobe Photoshop CS2 и Scion Image.

В качестве модели исследования использовали лимфоциты периферической венозной крови больных аллергической и неаллергической БА, выделенные с использованием стандартной методики выделения мононуклеаров (Boyum, 1968) на градиенте плотности Lymphoseparation Medium (производство "MP Biomedicals", США), с последующим удалением моноцитов осаждением на пластике в условиях инкубации в CO₂-инкубаторе в течение 40 мин. Перед использованием суспензии лимфоцитов проверяли их жизнеспособность с использованием 0,2% раствора трипанового синего на PBS (фосфатном буфере). Окрашенные (мертвые) клетки просчитывали на 100 клеток в поле зрения. Процент мертвых клеток составлял 3,39±0,43%.

Затем проводили активацию добавлением 10 ng/ml IL-4 (Sigma Aldrich, США) в CO₂-инкубаторе в течение 60 мин. После окончания инкубации лимфоциты помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при 4°С. Клетки промывали один раз холодным фосфатно-солевым буфером. Тотальный лизат получали добавлением в микропробирки 50 мкл лизирующего буфера (стандартного состава), содержащего коктейль из ингибиторов протеаз. Клетки инкубировали в течение 10 мин при 4°С. Затем клеточный лизат центрифугировали 15 мин при 10000 g. К супернатанту добавляли буфер для электрофоретических проб (стандартного состава - буфер Laemmli) в соотношении 1:4 (1 часть буфера и 4 части супернатанта) и инкубировали в течение 5 мин при 100°С. Концентрацию белка определяли по методу Bradford (1976), используя овальбумин для построения калибровочной кривой.

Электрофорез и иммуноблоттинг.

Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS в модификации Laemmli (1970). Концентрирующий гель содержал 4% полиакриламида, разделяющий - 10%. Разделение белков проводили в блоках геля 90×60×1 мм при силе тока 40 мА на пластину в течение 2 часов. Разделенные в полиакриламидном геле белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). Электроперенос проводили при силе тока 0.8 мА на 1 см² геля в течение 1 часа в буфере для переноса (стандартный состав). Для визуализации белковых полос использовали краску Ponceau S. Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL Western blotting protocols (Amersham). Инкубацию с антителами против фосфорилированных по тирозину 641 STAT6 проводили при 4°С. Все остальные процедуры осуществляли при комнатной температуре. Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую пленку СЕА RP NEW (CEA AB, Швеция).

Антитела

Для специфического выявления белков использовали поликлональные антитела против фосфорилированного по тирозину STAT6 (Tyr641) (Cell Signaling Technology, США), моноклональные антитела к β-актину (Cell Signaling Technology, США). В качестве вторичных антител применяли поликлональные антитела GAR-HRP (Cell Signaling Technology, США), моноклональные антитела GAM-HRP (Sigma, CIF).

Предлагаемый способ может быть осуществлен следующим образом.

Определяют уровень транскрипционного фактора pSTAT6 в условиях активации IL-4 лимфоцитов периферической венозной крови методом иммунноблоттинга и при уровне pSTAT6 менее 1,22 диагностируют неаллергическую бронхиальную астму, а при уровне pSTAT6 более 1,23 диагностируют аллергическую бронхиальную астму.

Способ иллюстрирован следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная Б., 22 года. Клинический диагноз: БА аллергическая, средней тяжести течения, фаза затихающего обострения. Аллергический ринит. Постоянная форма. Страдает БА с шестилетнего возраста. Отмечала появление заложенности носа и приступов удушья при контакте с домашней и книжной пылью, домашними животными (кошки, собаки). С 14-летнего возраста проводились элиминационные мероприятия, на фоне чего отмечала улучшение самочувствия.

При обследовании - эозинофилия крови и мокроты. Кожное аллергологическое тестирование с бытовыми, пыльцевыми, эпидермальными аллергенами выявило повышенную сенсибилизацию. При употреблении в пищу меда - крапивница.

По результатам функционального исследования легких: умеренные обструктивные нарушения вентиляционной способности легких, обратимая обструкция, выраженный бронхоспазм.

При иммунологическом обследовании - повышение общего IgE в 3 раза.

У матери и у сестры - бронхиальная астма. Не курит. Профессиональных вредностей нет.

Лечение: в последние 2 года - тайлед практически без эффекта, сальбутамол - ежедневно, по 3-5 ингаляций в сутки.

Нами было проведено специальное обследование на изменение уровня pSTAT6 под действием IL-4 для уточнения формы заболевания и для решения вопроса о коррекции терапии. Выявлен уровень pSTAT6 4,81 в условиях активации IL-4, что позволило диагностировать аллергическую БА. Назначение гипоаллергенной диеты и введение гипоаллергенных бытовых условий (элиминационные мероприятия) в комплексе с назначением комбинированного препарата серетида, содержащего 125 мкг флутиказона пропионата и 25 мкг салметерола, привело к ремиссии заболевания.

Пример 2. Больная Б., 55 лет. Клинический диагноз: БА неаллергическая, течение средней степени тяжести, фаза обострения. Хронический необструктивный бронхит. Вторичные бронхоэктазы. Страдает БА в течение 11 лет. Дебют заболевания после перенесенного простудного заболевания.

Лечение: в последние 3 года - беклазон в суточной дозе 1000 мкг с нестойким эффектом, в последний год к терапии добавлен комбинированный препарат симбикорт по 1 ингаляции 2 раза в день, состоящий из будесонида 80 мкт и формотерола фумаратдигидрата 4.5 мкг. Беродуал - ежедневно, за неделю до госпитализации увеличен прием до по 6-7 ингаляций в сутки, периодически - эуфиллин.

Отмечает связь приступов удушья с резкими запахами, переохлаждением. Ухудшение течения заболевания в сырую холодную погоду.

Из перенесенных заболеваний в анамнезе - в детстве частые ангины, тонзилэктомия в 1964 году; перенесла рожистое воспаление, сепсис после родов в 1980 г.; в 1985 - тромбофлебит, флебэктомия. На протяжении всей жизни - частые пневмонии. Не курит. Из профессиональных вредностей - контакт с бумажной пылью (работа в канцелярии медицинского учреждения).

Наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям не отмечает.

Неоднократно - положительный эффект от антибактериальной терапии.

Поступила в клинику в связи с обострением заболевания на фоне ОРВИ.

При обследовании выявлена умеренная эозинофилия и повышение уровня макрофагов в мокроте. По данным гематологического исследования - абсолютный и относительный нейтрофиллез, лимфо- и моноцитопения, СОЭ - 18 мм/ч. Общий IgE не повышен.

По результатам функционального исследования легких: резкие обструктивные нарушения вентиляционной способности легких, обратимая обструкция, выраженный бронхоспазм.

Анамнестически отмечает наличие бытовой (домашняя, бумажная пыль), эпидермальной (шерсть кошек, собак), пищевой (рыба) сенсибилизации с развитием приступа удушья; непереносимость новокаина, кетонала (потеря сознания). Нами было проведено специальное обследование с определением уровня pSTAT6 под действием IL-4 для уточнения формы заболевания и для коррекции терапии. Выявлен уровень pSTAT6 0,82 в условиях активации IL-4, что позволило диагностировать неаллергическую БА. Включение в терапию антибиотика (цефотаксима) и назначение дексаметазона внутривенно капельно в дозе 8 мг привело к ремиссии заболевания.

Пример 3. Больная X., 69 лет. Клинический диагноз: БА аллергическая, течение средней тяжести, фаза обострения.

Страдает БА более 25-ти лет, ранее отмечались бронхиты, дважды перенесла пневмонию, лечили антибиотиками. Контакта с профессиональными вредностями не было. Наследственность: у сестры - БА. Не курит.

Отмечала появление заложенности носа и приступов удушья при контакте с домашней и бумажной пылью. Обострения заболевания связывала с холодным временем года (осень, зима).

В первые годы заболевания применяла ингаляционно интал с положительным эффектом. Впоследствии, с утяжелением течения заболевания была переведена на ингаляции ингакорта в суточной дозе 0,5 мг с хорошим эффектом. В последние 5 лет постоянно применяет ингаляционную противовоспалительную терапию беклазоном в суточной дозе 400 мкг в течение нескольких лет, приступы купирует беродуалом.

Поступила в клинику для уточнения диагноза и коррекции терапии на фоне обострения заболевания.

При обследовании выявлена умеренная эозинофилия крови и выраженная эозинофилия мокроты, СОЭ - 6 мм/ч. При аллергологическом обследовании - повышенная чувствительность к аллергенам домашней пыли.

Нами было проведено специальное обследование на изменение уровня pSTAT6 под действием IL-4 для уточнения формы заболевания и для решения вопроса о коррекции терапии. Выявлен уровень pSTAT6 1,45 в условиях активации IL-4, что позволило диагностировать аллергическую БА. Больной рекомендовано увеличить дозу ингаляционного беклазона до 1000 мкг в сутки.

Пример 4. Больная Ж., 46 лет. Клинический диагноз: БА неаллергическая, средней тяжести течения, фаза обострения. Хронический бронхит. Обострение.

Около 3 лет страдает БА. Дебют заболевания после перенесенной пневмонии. Имеет место связь приступов удушья с резкими запахами, переохлаждением, физическими нагрузками. Отмечает появление дыхательного дискомфорта в сырых помещениях, в холодную, дождливую погоду.

Обострения заболевания на фоне ОРВИ, обострения хронического бронхита.

Перенесенные заболевания: повторные ангины, повторные пневмонии, фибромиома матки (экстирпация матки в 2005 году).

Анамнестически отмечает наличие бытовой (домашняя, бумажная пыль), эпидермальной (шерсть кошек, собак), пыльцевой сенсибилизации с появлением приступов кашля, удушья; непереносимость пенициллина, витамина С с появлением сыпи, развитием крапивницы.

Наследственность не отягощена. Курит с 20 лет по 5-10 сигарет в день.

Имеет профессиональные вредности: контакт с бумажной пылью (работала на канатной фабрике), с 1996 года - ртутная интоксикация, в последние 8 лет - контакт с парами лаков и красок (работает кладовщицей на лакокрасочном складе).

Поступила в клинику в связи с обострением БА на фоне ОРВИ и обострения хронического бронхита, применяла ингаляционно серетид, содержащий сальметерол 50 мкг, флутиказона пропионат 100 мкг, по 2 ингаляции в сутки с нестойким эффектом, беродуал в режиме "по требованию", в последнюю неделю (перед госпитализацией) до 6-8 раз в сутки и более.

При клиническом исследовании - выраженный лейкоцитоз, сдвиг влево за счет нейтрофилов, СОЭ - 4 мм/ч. Эозинофилии крови не выявлено. При иммунологическом обследовании - повышения общего IgE не отмечалось. При цитологическом исследовании мокроты выявлялся умеренный воспалительный процесс, умеренная эозинофилия, выраженная макрофагальная реакция.

Было проведено специальное обследование на изменение уровня pSTAT6 под действием IL-4 для уточнения формы заболевания и для решения вопроса о коррекции терапии. Выявлен уровень pSTAT6 1,16 в условиях активации IL-4, что позволило диагностировать неаллергическую БА. Назначение дексаметазона внутривенно капельно в дозе 8 мг в сочетании с курсом УФО-крови привело к ремиссии заболевания.

Проведенные исследования подтвердили безопасность, эффективность и специфичность предлагаемого способа дифференциальной диагностики БА.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, пульмонологии и внутренним болезням, и может быть использовано для дифференциальной диагностики бронхиальной астмы. Заявленный способ диагностики позволяет определять бронхиальную астму (БА) по уровню транскрипционного фактора pSTAT6 в условиях активации IL-4 лимфоцитов периферической венозной крови методом иммунноблоттинга. При уровне pSTAT6 менее 1,22 диагностируют неаллергическую бронхиальную астму, а при уровне pSTAT6 более 1,23 диагностируют аллергическую бронхиальную астму. 1 табл.

Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы путем иммунологического исследования, отличающийся тем, что определяют уровень транскрипционного фактора рSТАТ6 в условиях активации IL-4 лимфоцитов периферической венозной крови методом иммунноблоттинга и при уровне рSТАТ6 менее 1,22 диагностируют неаллергическую бронхиальную астму, а при уровне pSTAT6
более 1,23 диагностируют аллергическую бронхиальную астму.