СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2002 года по МПК C12N9/14 C12N9/24 

Изобретение относится к области биотехнологии, гидролизной промышленности и виноделия и предназначено для получения с высоким выходом пектолитического ферментного препарата, пригодного для исследования структуры растительных пектинов методом ферментативного гидролиза, для переработки и утилизации растительного сырья с целью получения олиго- и моносахаридов, для удаления осадка и осветления лучших сортов вин.

Известен способ очистки ферментов с использованием активированного древесного угля (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. - С.224). Недостатком данного способа является возможность необратимой адсорбции ферментов, приводящей к уменьшению выхода целевого продукта.

Известен способ очистки ферментов ионообменниками (Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985. - С.101), недостатком которого является возможность адсорбции ферментов, обусловленная их амфотерными свойствами, что снижает избирательность очистки и приводит к уменьшению выхода целевого продукта.

Известен способ адсорбционного выделения ферментов с использованием геля фосфата кальция (Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. - T.1. - С. 61) (прототип), недостатком которого является низкая степень извлечения фермента и растворимость геля в условиях, способствующих максимальной рН-стабильности пектиназ (рН 3,0 - 4,5), что приводит к существенному увеличению расхода адсорбента.

Ни один из приведенных способов не позволяет провести полную очистку и выделение пектиназы с высоким выходом. Способы, близкие к предлагаемому по существу, последовательности проведения операций, по выходу и чистоте целевого продукта, не известны.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового эффективного способа получения пектолитического ферментного препарата, пригодного для исследования структуры пектиновых полисахаридов из растительного сырья, для использования в гидролизной промышленности и виноделии.

Технический результат состоит в получении ферментного препарата с более высокой полигалактуроназной (ПгА) активностью и степенью очистки от пектиновых веществ при достаточно высоком выходе целевого продукта. Отсутствие пектиновых веществ и углеводов делает возможным его использование для ферментативного гидролиза растительных пектинов в целях изучения их структуры, получения олиго- и моносахаридов, а также в виноделии для осветления лучших сортов вин и удаления винного камня, в состав которого входят пектиновые вещества виноградного сока.

Технический результат достигается тем, что культуральные жидкости или растворы неочищенных ферментных препаратов обрабатывают микропористым активированным углем преимущественно в слабокислой среде при концентрации угля не более 6 - 7 г/л, после чего фильтрат подвергают обработке анионо- и катионообменными смолами преимущественно при рН 3,5 - 6,5, при этом концентрация смол составляет 70 - 80 г/л. Ферменты выделяют путем адсорбции гелем фосфата кальция при рН около 5,5 - 6,5 с последующей десорбцией ферментов фосфатным буфером при рН приблизительно 7,0. Раствор ферментов стабилизируют подкислением до рН ниже 4,5, обессоливают и концентрируют с помощью диа- и ультрафильтрации и лиофильно высушивают. Все стадии обработки проводят при пониженной температуре.

В предлагаемом способе для увеличения выхода целевого продукта процесс очистки проводят в условиях, обеспечивающих ее максимальную избирательность в отношении низкомолекулярных и олигомерных примесей. Это достигается использованием микропористого активированного угля с преимущественным развитием микропор в слабокислой среде, что препятствует необратимой адсорбции ферментов. Избирательность ионообменной очистки достигается последовательной обработкой анионообменниками в слабокислой среде и катионообменниками при рН среды, близком к нейтральному. Выделение ферментов с использованием геля фосфата кальция проводят в среде, близкой к нейтральной, что обеспечивает избирательную адсорбцию ферментов со степенью извлечения 92 - 97% при низком расходе адсорбента.

Для достижения высокого выхода целевого продукта процесс очистки и выделения ферментов реализуют в условиях, обеспечивающих их максимально возможную рН-стабильность, которая наблюдается в слабокислой среде при пониженной температуре. Это достигается тем, что наиболее длительные стадии диа- и ультрафильтрации, а также обработки активированным углем и анионообменником проводятся при рН не выше 4,5. Снижение рН-стабильности при рН 5,5 - 7,0 в случае кратковременных обработок катионообменником и гелем фосфата кальция компенсируется стабилизацией раствора ферментов подкислением до рН ниже 4,5 сразу после их десорбции фосфатным буфером.

Предлагаемая последовательность обработок является оптимальной, т.к. учитывает отрицательное влияние ионной силы раствора на эффективность адсорбционных и ионообменных процессов и приводит лишь к незначительному ее увеличению в ходе обработок, предшествующих диафильтрации.

В примерах 1-4 приведены экспериментальные данные, подтверждающие эффективность использования каждого этапа предлагаемого способа для очистки и выделения пектиназ в сравнении с существующими аналогами. В примере 5 приведены экспериментальные данные по использованию способа для выделения и очистки пектиназ.

Способ опробован на примере культуральных жидкостей от грибковых продуцентов пектиназ: Aspergillus foetidus и Aspergillus niger, а также на ферментном препарате Пектофоетидин ГЗх, выпускаемом промышленностью.

Пример 1. По 1000 мл культуральной жидкости от продуцента пектиназ A. Foetidus с содержанием сухих веществ около 10 г/л обрабатывают микропористым активированным углем СКТ, а также углями БАУ-А и ОУ-А с высоким развитием мезопор в слабокислой среде, концентрации угля в суспензии 7 г/л и температуре 4^oС. Степень очистки определяют по снижению цветности раствора, которую оценивают по его оптической плотности при длине волны 320 нм. После фильтрования получают частично очищенные ферментные препараты со следующими характеристиками: степень очистки для угля СКТ - 61,0%, БАУ-А - 78,5%, ОУ-А - 93,1%; потери полигалактуроназной активности (ПгА) для СКТ - 1,6%, БАУ-А - 24,5%, ОУ-А - 81,3%; удельная ПгА (ед/мг белка) составляет для необработанного раствора 80,3, после обработки углем СКТ - 86,4, БАУ-А - 92,0, ОУ-А - 22,1. Использование микропористого угля в указанных условиях позволяет провести более избирательную обработку ферментного препарата со степенью очистки 61% и выходом фермента - 98,4%.

Пример 2. 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 с удельной ПгА 80,3 ед/мг белка обрабатывают анионообменной смолой, например, Амберлит CG-400, при рН 3,5 - 4,0, концентрации смолы в суспензии 80 г/л и температуре 4^oС. Полученный фильтрат имеет следующие характеристики: степень очистки - 66,0 - 67,5%, потери активности - 8,0 - 9,1%, удельная ПгА - 112,4 - 120,6 ед/мг белка. Аналогичная обработка при рН 6.0 позволяет получить ферментный препарат со степенью очистки 78,3% при снижении ПгА на 17,3%, с удельной ПгА - 130,7 ед/мг белка.

Пример 3. 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 с удельной ПгА 80,3 ед/мг белка обрабатывают катионообменной смолой, например, Амберлит CG-120, при рН 6 концентрации смолы в суспензии 80,0 г/л и температуре 4^oС. Полученный фильтрат имеет следующие характеристики: степень очистки - 35,5%, потери активности - 6,2%, удельная ПгА - 101,1 ед/мг белка. Аналогичная обработка при рН 4.0 позволяет получить препарат со степенью очистки 50,0% при снижении ПгА на 92,0%, с удельной ПгА 20,7 ед/мг белка.

Пример 4. (по прототипу) 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 с удельной ПгА 80,3 ед/мг белка обрабатывают гелем фосфата кальция при рН 6, концентрации геля в суспензии 60 г/л по сухому веществу и температуре 4^oС. После фильтрования и промывки геля на фильтре дистиллированной водой с рН 6 проводят десорбцию ферментов 0,2 М фосфатным буфером с рН 7 двумя порциями по 200 мл, после чего объединенный раствор ферментов стабилизируют подкисленном до рН ниже 4,5. Получают концентрированный раствор ферментов со следующими характеристиками: степень извлечения фермента - 96,7%, степень очистки - 60,0%, удельная ПгА - 371,6 ед/мг белка. Аналогичная обработка при рН 5 и 7 позволяет достичь степени извлечения фермента 81 и 83%, степени очистки - 55 и 60% и удельной ПгА растворов 329,1 и 242,3 ед/мг белка соответственно.

Пример 5. 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 при 4^oС обрабатывают микропористым активированным углем аналогично примеру 1, анионообменной смолой Амберлит CG-400 при рН 4 и катионообменной смолой Амберлит CG-120 при рН 6, используя по 80 г смолы. Регулируют рН раствора 0,1 М гидроксидом натрия. Из частично очищенного раствора выделяют ферменты гелем фосфата кальция аналогично примеру 4. Стабилизированный раствор ферментов обессоливают диафильтрацией при непрерывном добавлении 2 л 0,01 - 0,20 М ацетатного буфера с рН ниже 4,5 на половолоконном модуле с пределом пропускания около 15 кДа и концентрируют до 100 мл на том же модуле в режиме ультрафильтрации. Очищенный концентрированный раствор ферментов высушивают лиофильно. Результаты приведены в таблице 1. Выход целевого продукта по полигалактуроназной активности составляет 57,2%, по белку - 9,3% от их исходного содержания в культуральной жидкости.

Предлагаемое изобретение позволяет получить ферментный препарат, превосходящий по чистоте и удельной полигалактуроназной активности известные аналоги. В таблице 2 приведена характеристика целевого продукта в сравнении с известными образцами пектиназы.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения с высоким выходом очищенного пектинолитического ферментного препарата. Изобретение позволяет получить с выходом 57-58% пектинолитический ферментный препарат, свободный от пектиновых веществ и углеводов, приводит к увеличению удельной полигалактуроназной активности целевого продукта в 6,0-6,2 раза по сравнению с исходной. Для удаления неактивных белков пептидов, пектиновых веществ, углеводов и солей культуральные жидкости от грибковых продуцентов пектиназ, полученные с использованием свекловичного пектина в качестве субстрата, обрабатывают при пониженной температуре микропористым активированным углем, анионо- и катионообменными смолами. Проводят выделение фермента из фильтрата с помощью адсорбции при обработке гелем фосфата кальция с последующей экстракцией геля фосфатным буфером. Экстракт стабилизируют подкислением до рН ниже 4,5, обессоливают и концентрируют путем диа- и ультрафильтрации и лиофильно высушивают. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения пектолитического ферментного препарата, включающий обработку культуральной жидкости или раствора неочищенного ферментного препарата микропористым активированным углем в слабокислой среде, анионообменной смолой при рН 3,5-4,0 и катионообменной смолой при рН 6, адсорбционное выделение ферментов гелем фосфата кальция, десорбцию ферментов 0,2-0,4 М фосфатным буфером, стабилизацию полученного экстракта подкислением до рН ниже 4,5, обессоливание и концентрирование диа- и ультрафильтрацией и лиофильную сушку. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку культуральной жидкости микропористым активированным углем проводят при концентрации угля не более 6-7 г/л.