СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/42 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано для получения высокоэффективного целлюлолитического ферментного препарата, предназначенного для обработки растительного сырья, получения кормовых и пищевых продуктов из отходов сельскохозяйственного и промышленного производства. Комплексный ферментный препарат может быть также использован в ряде отраслей пищевой промышленности (хлебопекарной и др.), для гидролиза некрахмальных полисахаридов пивоваренного сырья, а также в текстильной промышленности для обработки тканей.

Известен способ получения комплекса целлюлолитических ферментов, предусматривающий совместное культивирование Aspergillus foetidus M-45 - продуцента целлобиазы и пектиназы и Trichoderma viride 44 - продуцента целлюлазы на питательной среде следующего состава, % по сухой массе: жом свекловичный 5,0, дрожжи БВК 0,5, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,2, аммоний сернокислый 0,4, магний сернокислый 0,03, вода остальное. Продуценты вводятся последовательно. По достижении экспоненциальной фазы роста Tr. viride 44 (72 ч) в культуральную жидкость вводят посевной материал Asp.foltidus M-45 в количестве 5 об.% и продолжают совместное культивирование в течение 3 сут.

Недостатком этого способа является то, что получаемый при совместном культивировании комплекс ферментов характеризуется относительно низким уровнем активности целлюлазы 17,2 ед/мл (1,6 МЕ/мл) при длительности процесса культивирования 144 ч.

Цель изобретения - повышение активности целлюлазы при достаточной активности сопутствующих ферментов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения комплекса ферментов (Целлюлаза 100) проводят совместное глубинное культивирование продуцента: целлюлолитических ферментов Trichoderma viride и продуцента пектиназы Aspergillus foetidus на питательной среде, включающей свекловичный жом, солодовые ростки, паприн, лактозу, минеральные соли и целлюлозный компонент. При этом целлюлозный компонент вводится в питательную среду в конце экспоненциальной фазы роста Tr. viride одновременно с посевной культурой Asp. foetidus с целью активации синтеза целлюлазы и стабилизации фермента. Совместное культивирование продуцентов осуществляют в течение 2,5-3 сут до достижения максимальной активности.

В качестве целлюлозного компонента используют сульфатную или сульфитную вискозную целлюлозу, линт хлопковый, метилцеллюлозу, мелкое волокно, микрокристаллическую целлюлозу и т.д.

Способ получения комплекса ферментов "Целлюлаза 100" осуществляют следующим образом. Готовят питательную среду следующего состава, % по сухой массе: Жом свекловичный 2,5-3,5
Целлюлозный компонент 0,5-1,3 Ростки солодовые 1,0-2,0 Паприн 0,1-0,2 Лактоза 0,1-0,3 (NH₄)₂SO₄ 0,4-1,0 KH₂PO₄ 0,2-0-6 MnSO₄ 0,03-0,07 MgSO₄ 0,03-0,07 Вода Остальное
Для этого минеральные соли при непрерывном перемешивании в смесителе растворяют в воде и нагревают раствор до 80^оС. Одновременно в другой смеситель заливают воду и при непрерывном перемешивании вносят свекловичный жом, паприн и солодовые ростки. Смесь прогревают до 80^оС. После растворения солей в первом смесителе раствор переносят во второй смеситель и подготовленную смесь стерилизуют через установку непрерывной стерилизации (УНС). Через УНС подают также воду до необходимого объема. Разбавление питательной среды за счет конденсата учитывают при ее приготовлении. Питательную среду стерилизуют при 125-130^оС, давлении пара не ниже 4 кгс/см². Среда принимается в ферментатор, в котором поддерживают давление 0,1-0,2 кгс/см².

Целлюлозный компонент готовят в виде суспензии в воде и стерилизуют обычным способом.

После охлаждения питательной среды до 32^оС проводят корректирование рН до 4,3-4,5 с помощью лимонной кислоты или едкого калия. Засев глубинной культурой Tr. viride производят в количестве 5% и ведут выращивание при 28-30^оС и постоянном перемешивании. В конце экспоненциальной фазы роста в ферментатор передают глубинную культуру Asp. foetidus в количестве 5 об.% и суспензию целлюлозного компонента. Смешанную культуру выращивают в течение 60-70 ч до достижения максимальной активности ферментов.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является введение целлюлозного компонента в конце экспоненциальной фазы роста, что связано с биологической особенностью Tr. viride - продуцентов целлюлаз, у которых биосинтез ферментов начинается после окончания экспоненциальной фазы. Введение индуктора именно в этот момент способствует повышенному синтезу целлюлолитических ферментов.

Предлагаемый способ позволяет получать богатый энзиматический комплекс ферментов Целлюлаза 100 целлюлолитического и пектолитического действия, а также ксиланазы.

Глубина гидролиза целлюлозного сырья обеспечивается действием целлюлаз двух указанных продуцентов, характеризующихся различной сорбционной способностью и уровнем репрессии конечными продуктами гидролиза целлюлозы.

Способ получения комплекса ферментов осуществляют в условиях, указанных в примерах.

П р и м е р 1. Готовят 1000 л питательной среды следующего состава, % Жом свекловичный 2,5
Целлюлозный компонент 0,5 Ростки солодовые 1,0 Паприн 0,1 Лактоза 0,1 (NH₄)₂SO₄ 0,4 KH₂PO₄ 0,2 MgSO₄ 0,03 MnSO₄ 0,03 Вода Остальное
В питательную среду без целлюлозного компонента вносят 50 л посевной культуры Tr. viride ВКПМ F-105. Через 48 ч в конце экспоненциальной фазы вводят 50 л посевной культуры Asp. foetidus ВКПМ F-81 и 50 л 10%-ной суспензии целлюлозного компонента-сульфатной вискозной целлюлозы. Продолжают совместное культивирование одновременно двух культур 72 ч до накопления максимальной активности целлюлазы и других ферментов комплекса. В конце процесса активность целлюлазы в фильтрате культуральной жидкости составляет 1,8 МЕ/мл (19,4 ед/мл), целлобиазы 2,8 МЕ/мл (30,2 ед/мл), пектиназы 0,8 ед/мл.

П р и м е р 2. Готовят 1000 л питательной среды следующего состава, %: Жом свекловичный 3,5 Целлюлозный компонент 1,3 Ростки солодовые 2,0 Паприн 0,2 Лактоза 0,3 (NH₄)₂SO₄ 1,0 KH₂PO₄ 0,6 MgSO₄ 0,07 MnSO₄ 0,07 Вода Остальное
В питательную среду без целлюлозного компонента вносят 50 л посевной культуры Tr. viride ВКПМ F-374. В конце экспоненциальной фазы роста (48 ч) вводят 50 л посевной культуры Asp. foetidus ВКПМ F-359 и 50 л 26%-ной суспензии целлюлозного компонента - микроцеллюлозы. Продолжают совместное культивирование двух культур 72 ч до накопления максимальной активности целлюлазы, пектиназы и сопутствующих ферментов целлюлазно-пектиназного комплекса. В конце процесса активность целлюлазы в фильтрате культуральной жидкости составляет 2,4 МЕ/мл, целлобиазы 4,5 МЕ/мл, пектиназы 1,2 ед/мл, ксиланазы 3,5 МЕ/мл.

П р и м е р 3. Готовят 1000 л питательной среды состава, указанного в примере 2. В питательную среду без целлюлозного компонента вносят 50 л посевной культуры Tr. viride ВКПМ F-105. В конце экспоненциальной фазы роста (72 ч) вводят 50 л посевной культуры Asp. foetidus ВКПМ F-81 и 50 л 26%-ной суспензии целлюлозного компонента-микроцеллюлозы. Продолжают совместное культивирование двух культур 72 ч до накопления максимальной активности целлюлазы при оптимальном соотношении других ферментов. В конце процесса активность целлюлазы в фильтрате культуральной жидкости составляет 1,9 МЕ/мл, целлобиазы 3,0 МЕ/мл, пектиназы 0,9 ед/мл.

П р и м е р 4. Готовят 1000 л питательной среды следующего состава (по прототипу), %: жом свекловичный 5,0, дрожжи БВК 0,5, (NH₄)₂SO₄ 0,4, KH₂PO₄ 0,2, MgSO₄ 0,03. В питательную среду вносят посевную культуру Tr. viride ВКПМ F-374. Через 72 ч выращивания в конце экспоненциальной фазы роста еще вносят посевную культуру Asp. foetidus ВКПМ F-359 и продолжают совместное выращивание еще 72 ч. В конце процесса активность целлюлазы составляет 2,0 МЕ/мл, целлобиазы 3,8 МE/мл, пектиназы 0,9 ед/мл, ксиланазы 2,6 МЕ/мл.

П р и м е р 5. Готовят 1000 л питательной среды состава, указанного в примере 1. В питательную среду без целлюлозного компонента вносят 50 л посевной культуры Tr. viride ВКПМ F-374. Через 48 ч в конце экспоненциальной фазы роста вводят 50 л посевной культуры Asp. foetidus ВКПМ F-359 и 50 л 10% -ной суспензии целлюлозного компонента. Продолжают совместное культивирование одновременно двух культур 72 ч до накопления максимальной активности целлюлазы при оптимальном соотношении других ферментов комплекса. В конце процесса активность целлюлазы в фильтрате культуральной жидкости составляет 2,3 МЕ/мл, целлобиазы 4,1 МН/мл, пектиназы 1,0 ед/мл, ксиланазы 3,1 МЕ/мл.

Полученные результаты по всем пяти примерам сведены в табл. 1.

В табл. 2 приведена гидролитическая способность ферментного препарата, получаемого по предлагаемому в сравнении с препаратом, полученным по способу-прототипу.

Препарат, используемый для гидролиза, получали путем распылительного высушивания фильтрата культуральной жидкости. Гидролиз проводили при следующих условиях: субстрат пшеничная солома; доза препарата 0,1 МЕ/ЦлА/г субстрата; температура 50^оС; продолжительность 120 мин.

Гидролитическую способность характеризовали количеством образовавшихся редуцирующих веществ (мг/мл реакционной смеси и в % на сухую массу субстрата).

Как видно из табл. 2, ферментный препарат, полученный по предлагаемому способу даже на менее активных штаммах, обладает более высокой гидролитической активностью (пример 3), чем препарат, получаемый старым способом на более активных штаммах (пример 4), т.е. существенным для повышения гидролитической способности получаемого ферментного препарата является введение в питательную среду дополнительного индуктора-целлюлозного компонента одновременно с посевной культурой Asp. foetidus.

Использование: биотехнология, ряд отраслей пищевой промышленности, для гидролиза некрахмальных полисахаридов пивоваренного сырья, а также в текстильной промышленности для обработки тканей. Сущность изобретения: способ получения комплекса ферментов целлюлозо-пектиназного действия предусматривает совместное культивирование Trichoderma viride u Aspergillus foetidus с последовательным введением культур и с использованием целлюлозного компонента, являющегося индуктором биосинтеза ферментов в питательной среде, вводимого в среду в конце экспоненциальной фазы роста первого продуцента и одновременно с посевной культурой Aspergillus foetidus в количестве 0,5 - 1,3 мас.% по сухой массе. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий совместное глубинное выращивание продуцента целлюлолитических ферментов Grichoderma viride и продуцента пектиназы Aspergillus foetidus, вносимого в питательную среду, содержащую свекловичный жом, органический источник азота из дрожжей, минеральный источник азота-аммоний сернокислый, минеральные соли - калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый и воду, в конце экспоненциальной фазы роста продуцента целлюлазы, отличающийся тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят солодовые ростки, лактозу и марганец сернокислый, в качестве органического источника азота, выбранного из дрожжей, используют паприн при следующем соотношении компонентов, мас.% по сухой массе:
Жом свекловичный 2,5 - 3,5
Солодовые ростки 1,0 - 2,0
Паприн 0,1 - 0,2
Лактоза 0,1 - 0,3
Аммоний сернокислый 0,4 - 1,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,2 - 0,6
Магний сернокислый 0,03 - 0,07
Марганец сернокислый 0,03 - 0,07
Вода Остальное
при этом одновременно с продуцентом пектиназы вводят индуктор целлюлолитических ферментов-целлюлозный компонент в количестве 0,5 - 1,3 мас.% по сухой массе.