Способ прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии при хронической обструктивной болезни легких Российский патент 2025 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6883 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в лабораторной диагностике, кардиологии, пульмонологии, генетике для прогнозирования риска развития коморбидной формы артериальной гипертензии при хронической обструктивной болезни легких и коррекции тактики ведения этих больных.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) - это мультифакториальное заболевание, характеризующиеся стойкими респираторными симптомами и ограничениями воздушного потока, что является следствием воздействия негативных факторов окружающей среды и генетической предрасположенности человека.

В настоящее время ХОБЛ является глобальной проблемой. В некоторых странах мира распространенность ХОБЛ очень высока (свыше 20% в Чили), в других - меньше (около 6% в Мексике). Распространенность ХОБЛ II стадии и выше, по данным глобального исследования BOLD (Burden of Obstructive Lung Disease), среди лиц старше 40 лет составила 10,1%; в том числе для мужчин - 11,8% и для женщин - 8,5%. В России распространенность ХОБЛ среди лиц с респираторными симптомами составляет 21.8%, а в общей популяции - 15.3% [Чучалин А.Г. и др., 2022].

Наиболее распространенным коморбидным состоянием у пациентов с ХОБЛ является артериальная гипертензия, что в свою очередь может влиять на прогноз и течение заболевания [Сергеева В.А., 2022].

Артериальная гипертензия (АГ) - это синдром повышения систолического артериального давления (АД) ≥140 мм рт.ст. и/или диастолического АД ≥90 мм рт.ст.

Распространенность АГ среди взрослого населения составляет около 30-45%. Согласно прогнозу, к 2025 году число пациентов АГ увеличится на 15-20% и достигнет почти 1,5 миллиардов [Кобалава Ж.Д. и др. 2020].

Выделяют ряд факторов, которые связывают с возникновением артериальной гипертензии. К ним относятся: возраст, избыточная масса тела, избыточное потребление натрия, курение, злоупотребление алкоголем, гиподинамия, наследственная предрасположенность [Harrison D.G. 2021].

Общими патофизиолическими процессами при развитии АГ и ХОБЛ являются: нарушение функции автономной нервной системы с активацией симпато-адреналовой системы (САС), активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), воспаление на легочном и системном уровнях, дисбаланс в системе оксидант/антиоксидант с формированием оксидативного повреждения на локальном и системном уровнях, эндотелиальное и сосудистое повреждение с повышением жесткости сосудистой стенки и ускорением процессов атерогенеза.

Артериальная гипертензия и ХОБЛ - заболевания с генетической предрасположенностью, которую составляют множество генов, их сочетания, межгенные взаимодействия и эпигенетические процессы [Silverman E.K. 2020].

Доказана важная роль полиморфизма генов основных защитно-регуляторных систем организма в развитии, течении и осложнениях коморбидных патологий. Это, прежде всего, полиморфизм генов системы детоксикации ксенобиотиков, эндогенных компонентов антиоксидантной системы, факторов иммунной регуляции (интерлейкины), регуляции деятельности сердечно-сосудистой системы (ренин-ангиотензин-альдостероновая система). Особенности сочетания полиморфных вариантов генных сетей определяют не только характер течения болезни, но и эффективность проводимой фармакотерапии.

Прогнозирование развития АГ у пациентов с ХОБЛ, на основании исследования роли полиморфизма генов иммунной системы, системы детоксикации, ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, актуально в современной клинической практике для совершенствования программ диспансеризации, ранней диагностики АГ у больного ХОБЛ, разработки индивидуальных профилактических программ, своевременного начала терапии.

Известен «Способ оценки развития неблагоприятного течения хронической обструктивной болезни легких и артериальной гипертензии при их сочетании» по патенту РФ № 2018146771, опубл. 27.12.2018 г., позволяющий прогнозировать развитие АГ у пациентов с ХОБЛ.

У больного ХОБЛ с АГ определяют показатели клеточного иммунитета: содержание Т-лимфоцитов CD3- и CD4- в сыворотке крови и показатели вариабельности сердечного ритма (ВСР):SDNN - среднее квадратичное отклонение, RMSSD - среднеквадратичное значение между длительностью соседних R-R интервалов. Оценивают риск развития неблагоприятного течения ХОБЛ с АГ, используя математическую формулу: р=1/(1+ez ), где р - вероятность развития неблагоприятного течения ХОБЛ с АГ; z=3,4 * × H1+0,8 * × Н2 -2,3 * × Н3 -1,7 * × Н4+ (-7,74), H1 - Т-лимфоциты CD3+(× 10*9 клеток /л), Н2 - Т-лимфоциты CD4+(× 10*9 клеток /л), Н3 - SDNN (сек), Н4 - RMSSD (сек). При значении р от 0,1 до 0,5 риск развития неблагоприятного течения ХОБЛ с АГ оценивают как низкий риск. При р от 0,5 до 0,8 как высокий. При р от 0,9 до 1,1 как очень высокий. Способ обеспечивает вычисление индивидуального риска развития неблагоприятного течения у пациентов с ХОБЛ и АГ простым и доступным способом за счет определения содержания Т-лимфоцитов CD3-, CD4- (× 10*9 клеток/л) в сыворотке крови и показателей ВСР: SDNN, являющегося одним из основных показателей ВСР, и RMSSD по данным кардиоинтервалограммы.

Недостатком способа является то, что с помощью него прогнозируется развитие артериальной гипертензии у пациентов с ХОБЛ только на основании исследования показателей клеточного иммунитета и не оценивают полиморфизм генов иммунной системы, системы детоксикации и антиоксидантной защиты.

За ближайший аналог принят «Способ прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии и хронической обструктивной болезни легких» по патенту РФ №2620566, опубл. 26.05.2017 г.

У больного АГ или ХОБЛ определяют генотипы полиморфного локуса М235Т гена ангиотензиногена (AGT) и полиморфного локуса A1166C гена рецептора I типа агиотензина II (AGTR1). При наличии у больного генотипа Т/Т полиморфного локуса М235Т гена AGT и генотипа А/С полиморфного локуса А1166С гена AGTR1 прогнозируют высокую вероятность развития коморбидной АГ и ХОБЛ в течение 10 лет после дебюта первого из заболеваний. Изобретение позволяет с высокой долей вероятности прогнозировать развитие коморбидной формы АГ и ХОБЛ.

Недостатком способа является то, что с помощью него прогнозируют развитие артериальной гипертензии у пациентов с ХОБЛ только на основании исследования полиморфизмов генов РААС и не рассматривается полиморфизм генов иммунной системы, системы детоксикации и антиоксидантной защиты.

Задачи данного способа заключаются в определение молекулярно-генетических маркеров, с целью повышения достоверности прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ, улучшение ранней диагностики развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ и обеспечения своевременного и адекватного назначения терапии пациентам с артериальной гипертензии при ХОБЛ.

Сущностью изобретения является выделение ДНК из лейкоцитов образцов периферической венозной крови больного артериальной гипертензии и хронической обструктивной болезнью легких с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь», типирование полиморфных локусов A313G гена GSTP1, C-174G гена IL 6, G-308A гена TNF из лейкоцитарной фракции методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на анализаторе RotorGene и методом ПЦР SNP-экспресс-электрофорез на оборудовании Терцик, и при выявление у пациента генотипа G/G полиморфного локуса A313G гена GSTP1, генотипа G/G или C/G полиморфного локус C-174G гена IL 6, генотипа A/A или G/A полиморфного локуса G-308A гена TNF определяют высокий риск развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ, а при отсутствии указанных генотипов делают вывод о низкой вероятности развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ.

Данный способ заключается в том, что сначала выделяют ДНК из лейкоцитов образцов периферической венозной крови больных ХОБЛ и артериальной гипертензии с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь». В пробирку типа «эппендорф» вносят 1000 мкл цельной крови. Перед внесением кровь перемешивают до однородности. Затем закрывают пробирку и центрифугируют со скоростью 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 5 минут.

После центрифугирования кровь разделяют на плазму и форменные элементы. На поверхности осадка форменных элементов образуется тонкий слой лейкоцитов. Аккуратно удаляют пипеткой плазму без лейкоцитов. Затем закрывают пробирку и ее выдерживают при температуре -20°С (в морозильной камере) до полного замораживания форменных элементов (в течение одного часа).

Далее содержимое пробирки полностью размораживают при комнатной температуре. В пробирку вносят реактив «ДНК-экспресс-кровь». Его объем должен быть равен объему оставшихся в пробирке форменных элементов и плазмы. После чего пробирку закрывают, содержимое пробирки в течение 10 секунд тщательно перемешивают на «Вортексе» и осаждают капли на микроцентрифуге.

Затем пробирку устанавливают в предварительно прогретый до 99°С термостат и выдерживают при 99°С в течение 25 минут. Далее пробирку устанавливают в высокоскоростную микроцентрифугу и центрифугируют со скоростью 8000-14000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 1 минуты («Литех», Россия).

Полученный таким образом супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК. Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров. Далее проводят типирование полиморфных локусов: G-308A гена TNF методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе «Rotor-Gene Q» в режиме реального времени. Результаты анализа позволяют сделать следующие заключения: гомозигота по аллели 1, гетерозигота и гомозигота по аллели 2 [Руководство по работе с приборами для ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени 2021 / 26 c.]. Типирование полиморфных локусов: C-174G в гене IL 6, A313G в гене GSTP1 проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик» [Руководство по эксплуатации программируемого 4-канального термостата для проведения ПЦР-анализа ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК» 2014 г.- 23 с.].

Затем разделение продуктов амплификации проводится в 3% агарозном геле, приготовленном на TAE буфера методом горизонтального электрофореза. Для визуализации результатов электрофореза в качестве красителя вносят 1% раствор бромистого этидия из расчета 5 мкл на 50 мл расплавленного геля. Фрагменты анализируемой дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос под ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нанометров с использованием программы «VILBERLOURMAT» [Руководство по эксплуатации гельдокументирующей система QUANTUM 2016 г.].

Результаты анализа позволяют сделать заключения: гомозигота по аллели 1, гетерозигота, гомозигота по аллели 2.

Выявление у пациента генотипов G/G или C/G полиморфного локуса C-174G гена IL 6, генотипа G/G полиморфного локуса A313G гена GSTP1, генотипов G/A и A/A полиморфного локуса G-308A гена TNF, определяют высокий риск развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ, а при отсутствии указанных генотипов делают вывод о низкой вероятности развития коморбидной формы артериальной гипертензии и ХОБЛ.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «Jamovi 2.3.24». Ассоциации аллелей и генотипов, изученных ДНК-маркеров, с развитием коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ оценивают с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI).

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ подтверждает анализ результатов наблюдений 100 больных ХОБЛ и артериальной гипертензии, 50 с артериальной гипертензией и 60 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

Использование данного способа позволяет прогнозировать риск развития коморбидной формы артериальной гипертензии и хронической обструктивной болезнью легких за счет определения полиморфизмов генов иммунологического контроля, системы детоксикации и антиоксидантной защиты.

Определение высокой вероятности развития коморбидной формы артериальной гипертензии и ХОБЛ на основании данного способа позволит сформировать рекомендации по профилактики заболеваний, своевременно назначить диагностические мероприятия (измерение АД у пациентов с ХОБЛ, проведение ФВД у пациентов с АГ), своевременно назначить лекарственную терапию.

Способ прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии и хронической обструктивной болезни легких основан на выявление полиморфных локусов: C-174G в гене IL 6, A313G в гене GSTP1, G-308A в гене TNF.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами.

Пример 1

Пациент Г. 64 года, госпитализирован в пульмонологическое отделение ККБ №2 МЗ КК г. Краснодара с диагнозом ХОБЛ, тяжелой степени GOLD3, высокий риск обострений, эмфизематозный тип. Гипертоническая болезнь III ст, риск 4. ХСН I ст., I ФК по NYHA. ХОБЛ около 12 лет. Жалобы на одышку в покое, кашель с отделением мокроты, нестабильные цифры артериального давления, свистящие хрипы в грудной клетке. Течение заболевания тяжелое, лабильное, отмечаются частые обострения одышки, плохо поддающиеся терапии. У пациента исследовали полиморфизмы генов G-308A гена TNF, С-174G гена IL6, A313G гена GSTP1.

При генетическом исследовании выявлен генотип A/A полиморфного локуса G-308A гена TNF, генотип G/G полиморфного локуса С-174G гена IL6, генотип G/G полиморфного локуса A313G гена GSTP1. Соответственно, пациент имеет высокий риск развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ. Данные, полученные в исследовании, коррелируют с клинической картиной. Пациенту были даны рекомендации по оптимизации терапии АГ, даны рекомендации по ежедневному контролю АД, рекомендовано прохождение ежегодного диспансерного наблюдения.

Пример 2

Пациент С. 68 лет, госпитализирован в пульмонологическое отделение ККБ №2 МЗ КК г. Краснодара с диагнозом ХОБЛ, тяжелой степени GOLD3, высокий риск обострений, выраженные симптомы, эмфизематозный тип. Гипертоническая болезнь II ст, риск 4. ХСН I ст., I ФК по NYHA. ХОБЛ с 2012 г. Жалобы на одышку при минимальной нагрузке, кашель с отделением густой мокроты, нестабильные цифры артериального давления. Течение заболевания тяжелое, лабильное, отмечаются частые обострения одышки, плохо поддающиеся терапии. У пациента исследовали полиморфизмы генов G-308A гена TNF, С-174G гена IL6, A313G гена GSTP1.

При генетическом исследовании выявлен генотип G/A полиморфного локуса G-308A гена TNF, генотип C/G полиморфного локуса С-174G гена IL6, генотип G/G полиморфного локуса A313G гена GSTP1. Соответственно, пациент имеет высокий риск развития артериальной гипертензии. Данные, полученные в исследовании, коррелируют с клинической картиной. Пациенту были даны рекомендации по оптимизации терапии АГ, даны рекомендации по ежедневному контролю АД, рекомендовано прохождение ежегодного диспансерного наблюдения.

Пример 3

Пациент В. 55 лет, госпитализирован в пульмонологическое отделение ККБ №2 МЗ КК г. Краснодара с диагнозом ХОБЛ, тяжелой степени GOLD3, высокий риск обострений, выраженные симптомы, смешанный тип. ХОБЛ около 7 лет. Жалобы на одышку при минимальной нагрузке, кашель с отделением мокроты. Повышение АД отрицает. Течение заболевания тяжелое, лабильное, отмечаются частые обострения одышки, плохо поддающиеся терапии. У пациента исследовали полиморфизмы генов G-308A гена TNF, С-174G гена IL6, A313G гена GSTP1.

При генетическом исследовании выявлен генотип G/A полиморфного локуса G-308A гена TNF, генотип C/C полиморфного локуса С-174G гена IL6, генотип A/A полиморфного локуса A313G гена GSTP1. Соответственно, пациент имеет низкий риск развития артериальной гипертензии.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, кардиологии, пульмонологии и генетике, и может быть использовано для прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Из образцов периферической венозной крови больного артериальной гипертензией и ХОБЛ выделяют ДНК. Проводят типирование полиморфных локусов A313G гена GSTP1, C-174G гена IL 6, G-308A гена TNF методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. При выявлении у пациента генотипа G/G полиморфного локуса A313G гена GSTP1, генотипа G/G или C/G полиморфного локуса C-174G гена IL 6, генотипа A/A или G/A полиморфного локуса G-308A гена TNF определяют высокий риск развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ. При отсутствии указанных генотипов делают вывод о низкой вероятности развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ. Способ позволяет прогнозировать риск развития коморбидной формы артериальной гипертензии и ХОБЛ за счет определения полиморфизмов генов иммунологического контроля, системы детоксикации и антиоксидантной защиты. 3 пр.

Способ прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии при хронической обструктивной болезни легких, включающий выделение ДНК из лейкоцитов образцов периферической венозной крови больного артериальной гипертензией и хронической обструктивной болезнью легких с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь», типирование полиморфных локусов A313G гена GSTP1, C-174G гена IL 6, G-308A гена TNF из лейкоцитарной фракции методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на анализаторе RotorGene и методом ПЦР SNP-экспресс-электрофорез на оборудовании Терцик, и при выявлении у пациента генотипа G/G полиморфного локуса A313G гена GSTP1, генотипа G/G или C/G полиморфного локуса C-174G гена IL 6, генотипа A/A или G/A полиморфного локуса G-308A гена TNF определяют высокий риск развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ, а при отсутствии указанных генотипов делают вывод о низкой вероятности развития коморбидной формы артериальной гипертензии при ХОБЛ.