СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ МИЕЛОИДНОЙ ТКАНИ СТАРЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК A61K35/50 A61P35/00 A61N5/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения лучевой болезни, и может быть использовано для восстановления миелоидной ткани старых лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения.

При старении организма развитие регенерации осуществляется на ином, отличном от молодого организма уровне, что может определять существенные различия в выраженности регенераторного ответа в ответ на действие экстремального фактора. При старении в организме происходит уменьшение содержания стволовых клеток. Поэтому перспективным направлением в восстановлении регенераторного потенциала быстро обновляющихся тканей представляется использование клеточных технологий. С этой целью можно использовать стволовые клетки, в том числе и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК). ММСК были открыты в 70-х годах прошлого века, но только сейчас их начали использовать в экспериментальной медицине. Можно полагать, что при использовании стволовых клеток для коррекции процессов старения в организме происходит повышение синтеза факторов роста, необходимых для поддержки дифференцировки и пролиферации клеток, приводящих к восстановлению нарушенных при старении функций органов и систем.

Проблема клеточного восстановления после воздействия повреждающего фактора продолжает оставаться актуальным вопросом современной биологии и медицины. Помимо проводимой по показаниям заместительной терапии (костного мозга, периферической крови), выделяют функциональную терапию.

Восстановление активности гемопоэза после острого лучевого поражения можно свести к пролиферации клеток, сохранивших жизнеспособность, благодаря чему восполняется убыль популяции клеток критических органов (миелоидная ткань), а следовательно, восстанавливается их функциональная полноценность (Жербин Е.А. Радиационная гематология [Текст] / Е.А.Жербин, А.Б.Чухловин. - М.: Медицина, 1989. - 15 с.).

Применение препаратов данной группы сопряжено с побочными эффектами и противопоказаниями. Так, после инъекций водного раствора дезоксирибонуклеата натрия через 1,5-3 ч возникает выраженная гипогликемия.

Следующим направлением в патогенетической терапии лучевых поражений миелоидной ткани является использование колониестимулирующих факторов (Новик А.А. Клеточная терапия [Текст] / А.А.Новик, Р.А.Иванов. - М.: МИА, 2008. - 31 с.).

Препараты Г-КСФ (ленограстим, филграстим), а также ГМ-КСФ (молграмостим) стимулируют гранулоцитопоэз, уменьшают риск нейтропении и ее осложнений - лихорадки и инфекции.

Недостатками применения этих препаратов являются побочные эффекты: аллергические реакции, тромбоцитопения, сплено- и гепатомегалия, а также гематурия, протеинурия.

Одним из направлений в терапии лучевых поражений гемопоэза при старении организма является проведение заместительной терапии (трансплантации костного мозга) [Дж.Снелл, Ж.Доссе, С.Нэтенсон // Совместимость тканей. М.: МИР, 1979. С. - 290 - 294].

Недостатком данного метода терапии является развитие реакции «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата, а также инфекции.

Восстановление костномозгового кроветворения обеспечивается применением препаратов, повышающих регенераторный потенциал миелоидной ткани. Типичным представителем препаратов, оказывающих стимулирующее действие на процессы регенерации, является дезоксинат (деринат). Деринат представляет собой натриевую соль ДНК, полученную из молок осетровых рыб. Данный препарат применяют не позднее 24 ч после облучения. Его вводят однократно внутримышечно или подкожно в объеме 15 мл (75 г активного вещества) (Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита [Текст]: учеб. пособие для студентов мед. вузов / С.А.Куценко, Н.В.Бутомо, А.Н.Гребенюк. - СПб.: Фолиант, 2004. - 527 с.).

Преимуществом использования нашего способа является отсутствие аллергических реакций, а также реакций «трансплантат против хозяина», отторжения трансплантата, поскольку ММСК обладают умеренно выраженным иммуносупрессивным действием. Продукцией ММСК противовоспалительных цитокинов достигается противовоспалительный эффект. Способность ММСК синтезировать белки теплового шока обеспечивает их цитопротективное действие.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к восстановлению миелоидной ткани старых лабораторных животных, угнетенных воздействием ионизирующего излучения.

Технический результат достигается за счет внутривенной аллогенной трансплантации через час после облучения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты, в количестве 6×10⁶ клеток на 1 кг веса животного.

Сущность изобретения заключается в применении впервые для лечения лучевой болезни ММСК.

ММСК способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции ряда цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15, макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор роста стволовой клетки. Плюрипотентность ММСК, специфическая миграция в область повреждения и адгезионные свойства - все это обуславливает восстановительную функцию ММСК. ММСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и осуществлять функцию замещенных клеток. Постоянным продуктом секреции ММСК является простагландин Е2, который способен снижать экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 на поверхности периферических лимфоцитов, что препятствует их активации. При внутривенной аллогенной трансплантации совместимых ММСК не возникает реакции отторжения трансплантата, так как ММСК обладают слабыми иммуногенными свойствами, а также не возникает реакции «трансплантат против хозяина» за счет иммуносупрессивных свойств ММСК. Именно эти свойства ММСК и их количество (6×10⁶ клеток/кг веса) необходимы и достаточны для восстановления регенерации миелоидной ткани.

Из анализа научно-технической и патентной информации использование ММСК для восстановления миелоидной ткани нами не обнаружено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты по получению культуры ММСК проведены на 8 крысах линии Wistar, массой 150-170 г. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3-4 мес. Производилось выделение плаценты (срок гестации 18 дней), образец ткани массой 2 г трижды промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, дополненным антибиотиками (пенициллин 50 ед/мл, стрептомицин 50 мкг/мл), после чего осуществлялось механическое измельчение ткани и энзиматическая обработка (0,25% трипсин - ЭДТА 15 мин при 37°С).

Полученная суспензия клеток была дважды профильтрована через 100 мкм нейлоновую мембрану для очистки от крупных, неизмельченных кусочков ткани. Суспензию разбавляли средой α-МЕМ, содержащей антибиотики, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1000 g. Полученный клеточный осадок суспендировали в среде α-MEM (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Sigma, США) и однократным раствором антибиотиков (Chemicon). Суспензию клеток высевали в концентрации 150000-160000 кл/см² на чашки Петри 60 мм (Nunc, Дания).

Культивирование производилось при 37°С в увлажненной атмосфере с 5 % CO₂.

Подсчет клеток производили в гемоцитометре. Расчет количества клеток в 1 мл суспензии производили по формуле: Х=а*10000, где Х - число клеток в 1 мл суспензии; а - сумма клеток в малых квадратах.

Субкультивирование клеток осуществляли по достижении ими 80% монослоя. Клетки промывали смесью 0,25% трипсин - ЭДТА в соотношении 1:1, в которой клетки инкубировали около 5 мин при 37°С. Трипсин инактивировали добавлением ростовой среды с СЭК (10%), и центрифугировали суспензию при 200 g в течение 5 мин. Удалив супернатант, клетки суспендировали, производили подсчет и высевали в нужной концентрации (10000 кл/ см²).

Характеристику культуры проводили с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit Rat) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated). Моделирование экстремального воздействия:

Эксперименты выполнены на 56 белых лабораторных крысах-самцах (возраст 3 года, масса 300 г). Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе. Изучалось воздействие ионизирующего излучения (ИИ) дозой 3 Гр (мощность поглощенной дозы 15 сГр/мин). Тотальное облучение крыс осуществлялось однократно γ-излучением. В качестве источника γ-квантов был использован ⁶⁰Со. Контрольную группу составили животные, не подвергшиеся облучению. В каждой группе насчитывалось 14 крыс. Внутри группы было выделено 2 подгруппы по 7 животных в каждой.

Крысам парентерально производилось введение: животным первой подгруппы внутривенно вводилась суспензия ММСК 2 млн (из расчета 6×10⁶ клеток/кг животного), вторая подгруппа крыс являлась контролем в каждой из групп, животным вводили физиологический раствор - 0,5 мл внутривенно. Внутривенные введения осуществлялись через 1 час после облучения однократно в указанных выше дозах (таблица 1).

Таблица 1 Доза ИИ Препарат Путь введения Доза препарата Время проведения аутопсии органов 24 часа 7 сутки 3,0 Гр ММСК в/в 2 млн. кл./кг в 0,5 мл физ. раствора. 7 шт. 7 шт. NaCl в/в 0,5 мл 7 шт. 7 шт.

На 1 сутки после воздействия ИИ в контрольной подгруппе при подсчете числа митозов в клетках эритроидного и гранулоцитарного дифферонов установлено значительное (митотический индекс эритроидного дифферона - МИ эр.д.: 1,20±0,27‰, р<0,05 и МИ гр.д.: 1,17±0,28‰, р<0,05) снижение пролиферативной активности. При подсчете микроядер в ретикулоцитах выявлен мутагенный эффект после действия ионизирующего излучения (микроядерный тест-МЯТ: 17,17±2,50‰, р<0,05). В то же время в опытной подгруппе в клетках эритроидного дифферона установлено существенно меньшее угнетение пролиферативной активности по сравнению с контрольной подгруппой (МИ эр.д.: 1,63±0,17‰, р<0,05). Тогда как в гранулоцитарном ростке не отмечено значимого влияния ММСК на пролиферативную активность. При подсчете микроядер в ретикулоцитах обнаружено, что уровень цитогенетически измененных клеток достоверно не отличался от контрольной подгруппы (таблица 2).

Таблица 2 Показатели регенераторной и мутагенной активности гемопоэтических клеток костного мозга старых лабораторных животных на 1 сутки после воздействия ИИ, М±m, n=7 Параметры Значения Содержание клеток после NaCl, % Содержание клеток после ММСК, % Митотический индекс эритроидного дифферона (МИ эр.д.), ‰ 1,20±0,27 1,63±0,17* Митотический индекс гранулоцитарного дифферона (МИ гр.д.), ‰ 1,17±0,28 0,67±0,44 Микроядерный тест, ‰ 17,17±2,50 15,50±1,67 Примечание: * отличие от подгруппы старых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3,0 Гр, достоверно с р<0,05.

При анализе миелограммы на 1 сутки после воздействия ИИ в контрольной подгруппе установлено существенное угнетение активности эритропоэза и гранулоцитопоэза вследствие того, что происходит уменьшение содержания элементов изучаемых дифферонов. В то же время в опытной подгруппе установлено большее содержание элементов пролиферативного пула эритроидного дифферона (эритробласты: 0,38±0,09%, р<0,05) по сравнению с контрольной подгруппой. Однако к существенному изменению общего содержания эритроидных элементов, по сравнению с контрольной подгруппой, указанные изменения не привели, так как содержание других элементов эритрона достоверно не отличалось от контрольной подгруппы. Данные миелограммы свидетельствуют об отсутствии значимого действия ММСК в этот период на активность гранулоцитопоэза. В целом, после воздействия ИИ на первые сутки наблюдалось существенное снижение общего содержания эритроидных и гранулоцитарных элементов относительно значений нормы. Выявлено отсутствие значимого изменения скорости процессов созревания нейтрофилов и эритронормобластов по сравнению с подгруппой контроля (таблица 3).

Таблица 3 Показатели миелограммы старых лабораторных животных на 1 сутки после введения ММСК на фоне ИИ, М±m, n=7 Наименование клеточных элементов Содержание клеток после введения NaCl, % Содержание клеток после введения ММСК, % Нейтрофильные клетки миелобласты 0,45±0,23 0,52±0,14 промиелоциты 0,63±0,28 0,47±0,29 миелоциты 5,45±1,27 4,95±0,97 метамиелоциты 8,68±2,35 9,78±2,54 палочкоядерные и сегментоядерные 28,35±3,98 29,15±3,13 Эозинофилы (всех генераций) 0,98±0,34 0,90±0,27 Все гранулоцитарные элементы (Гр.эл.) 44,85±3,33 45,78±5,44 Эритробласты 0,22±0,08 0,38±0,09 * Нормобласты базофильные 0,93±0,08 1,25±0,20 полихроматофильные 12,67±1,63 10.10±2,10 оксифильные 2,32±0,42 1,92±0,76 Все эритроидные элементы (Эр.эл.) 16,23±1,37 13,65±1,92 Лимфоциты 3,43±1,07 0,78±0,25 Моноциты 0,75±0,27 1,02±0,42 Прочие 0,64±0,11 0,54±0,07 Индекс созревания эритронормобластов 0,93±0,01 0,88±0,02* Гранулоцитарно-эритробластическое соотношение 2,83±0,43 3,40±0,30 Индекс созревания нейтрофилов 0,55±0,16 0,54±0,10 Примечание: * отличие от подгруппы старых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, достоверно с р<0,05.

При подсчете ретикулоцитов ПК, подсчете лейкоцитарной формулы в опытной и контрольной подгруппах на 1 сутки после воздействия ИИ изучаемые показатели существенно не отличались. При этом в обеих подгруппах выявлен ретикулоцитоз, нейтрофильный лейкоцитоз, снижение содержания лимфоцитов относительно значений нормы.

В контрольной подгруппе к 7 суткам после воздействия ИИ при подсчете числа митозов в клетках эритроидного и гранулоцитарного дифферонов выявлено восстановление пролиферативной активности. При подсчете микроядер в ретикулоцитах установлено, что не произошло полного восстановления содержания цитогенетически измененных клеток до значений нормы, и данный показатель был достоверно выше СУМ (МЯТ 15,28±1,28‰, р<0,05). В опытной подгруппе к 7 суткам выявлен существенный пролиферативный ответ на проведенную аллогенную трансплантацию ММСК. Количество митотически делящихся клеток в эритроидном (МИ эр.д.: 3,82±0,98‰, р<0,05) и гранулоцитарном (МИ гр.д.: 3,67±0,50‰, р<0,05) дифферонах превышало данный показатель в контрольной подгруппе. При подсчете микроядер в ретикулоцитах отмечено снижение уровня образования цитогенетически измененных клеток (МЯТ 12,27±2,23‰, р<0,05) по сравнению с контрольной подгруппой. В то же время следует отметить, что не произошло восстановления изучаемого показателя до значений нормы, и уровень мутагенной активности оставался повышенным (таблица 4).

Таблица 4. Показатели регенераторной и мутагенной активности гемопоэтических клеток костного мозга старых лабораторных животных на 7 сутки после воздействия ИИ, М±m, n=7 Параметры Значения Содержание клеток после NaCl, % Содержание клеток после ММСК, % Митотический индекс эритроидного дифферона (МИ эр.д.), ‰ 2,07±0,33 3,82±0,98* Митотический индекс гранулоцитарного дифферона (МИ гр.д), ‰ 2,15±0,95 3,67±0,50* Микроядерный тест, ‰ 15,28±1,28 12,27±2,23* Примечание: * отличие от подгруппы старых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, достоверно с р<0,05.

При анализе миелограммы отмечено, что к 7 суткам после облучения не произошло естественного восстановления активности эритропоэза и гранулоцитопоэза в контрольной подгруппе. По данным эритроидного ростка установлено, что произошло естественное восстановление содержания элементов пролиферативного пула. Однако не произошло восстановления содержания клеток созревающего пула. Анализируя данные гранулоцитарного ростка, следует отметить, что произошло также восстановление содержания клеток пролиферативного пула (миелобластов и промиелоцитов). Однако не произошло полного восстановления содержания миелоцитов и клеток созревающего пула. Следствием указанных изменений было сниженное общее содержание элементов эритроидного и гранулоцитарного пула. Значения ИСЭНбл и ИСН на 7 сутки в контрольных и в опытных подгруппах соответствовали значению нормы.

При подсчете миелограммы на 7 сутки после введения ММСК на фоне воздействия ИИ выявлено восстановление содержания элементов пролиферативного пула эритроидного ростка, а также клеток пролиферативного пула гранулоцитарного ростка. На фоне проводимой трансплантации ММСК в эритроне отмечено увеличение всех изучаемых элементов дифферона по сравнению с контрольной подгруппой. Тем не менее, не произошло восстановления содержания элементов созревающего пула, а также общего содержания эритроидных элементов до значений нормы. Изучая содержание элементов гранулоцитарного ростка, установлено повышение содержания клеток пролиферативного пула: миелобластов и промиелоцитов (1,42±0,28%, р<0,05 и 2,88±0,48%, р<0,05 соответственно). Однако содержание миелоцитов, а также клеток созревающего пула достоверно не отличалось от их содержания в контрольной подгруппе. Оценивая общее содержание элементов в гранулоцитарном ростке, следует отметить, что указанные изменения не привели к изменению активности гранулоцитопоэза (таблица 5).

Таблица 5. Показатели миелограммы старых лабораторных животных на 7 сутки после воздействия ИИ, М±m, n=7 Наименование клеточных элементов Содержание клеток после введения NaCl, % Содержание клеток после введения ММСК, % Нейтрофильные клетки миелобласты 1,07±0,11 1,42±0,28* промиелоциты 1,43±0,31 2,88±0,48* миелоциты 5,90±1,67 6,22±1,19 метамиелоциты 10,55±1,33 12,33±1,71 палочкоядерные и сегментоядерные 25,28±2,52 25,65±2,00 Эозинофилы (всех генераций) 1,17±0,30 1,32±0,38 Все гранулоцитарные элементы (Гр.эл.) 45,40±2,53 49,82±2,79 Эритробласты 0,50±0,13 0,92±0,18* Нормобласты базофильные 2,15±0,83 3,65±0,52* полихроматофильные 13,80±3,07 17,40±0,93* оксифильные 1,75±0,18 2,27±0,33* Все эритроидные элементы (Эр.эл.) 17,85±3,32 24,23±1,58* Лимфоциты 3,88±0,92 3,28±0,55 Моноциты 0,82±0,09 0,83±0,12 Прочие 1,04±0,21 2,36±0,18 Индекс созревания эритронормобластов 0,85±0,05 0,81±0,01 Гранулоцитарно-эритробластическое отношение (ГЭС) 2,66±0,51 2,07±0,17 Индекс созревания нейтрофилов 0,78±0,19 0,90±0,08 Примечание: * отличие от подгруппы старых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, достоверно с р<0,05.

В опытной подгруппе при подсчете ретикулоцитов ПК, подсчете лейкоцитарной формулы не установлено значимой разницы в содержании анализируемых элементов по сравнению с контрольной подгруппой. При этом их уровень был достоверно ниже границы нормы.

Полученные данные свидетельствуют, что в экстремальных условиях (после воздействия ИИ) на фоне введения ММСК происходит увеличение содержания элементов пролиферативного пула эритроидного и гранулоцитарного дифферонов, а также снижение индуцированного мутагенеза. Полученные данные позволяют считать ММСК цитопротективными в отношении миелоидной ткани в условиях лучевой нагрузки.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к терапии лучевой болезни у лабораторных животных, и касается восстановления миелоидной ткани у старых лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения. Для этого через час после облучения осуществляют внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, в количестве 6×10⁶ клеток/кг. Такой режим введения трансплантата обеспечивает эффективное восстановление миелоидной ткани у старых лабораторных животных и позволяет расширить арсенал средств противолучевой терапии. 5 табл.

Способ восстановления миелоидной ткани старых лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения осуществляют через час после облучения путем внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, в количестве 6×10⁶ клеток/кг.