НОВЫЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К АНТИБИОТИКАМ ШТАММЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2010 года по МПК C12N15/01 C12N13/00 C12N1/20 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения новых чувствительных к антибиотикам штаммов рода Bifidobacterium из устойчивых к антибиотикам Bifidobacteriacea, обладающих кодируемым хромосомой геном устойчивости к антибиотикам, и к штаммам, получаемым этим способом. В частности, настоящее изобретение относится к новым чувствительным к антибиотикам штаммам, полученным из пробиотических устойчивых к антибиотикам штаммов, и к применению таких новых штаммов для изготовления продукта питания, или корма, или дозированной формы, содержащей живые организмы.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Бактерии, которые сбраживают сахара с получением кислот, в частности, молочной кислоты, в качестве основного метаболического компонента, давно известны. Такие бактерии встречаются в молоке или в молочных продуктах, живых или разлагающихся растениях, а также в кишечнике человека и животных. Традиционно, эти бактерии называют "молочнокислыми бактериями". Молочнокислые бактерии определяют в некоторой степени гетерологичную группу грамположительных неподвижных микроаэрофильных или анаэробных бактерий, которые сбраживают сахар с образованием кислот, включающих в себя молочную кислоту, и включают в себя, например, род Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc и Pediococcus.

На протяжении веков молочнокислые бактерии использовали для изготовления продуктов питания и корма, включая большинство молочных продуктов, и в настоящее время молочнокислые бактерии необходимы для изготовления всех продуктов брожения молока, таких как йогурт, сыр и масло. Более того, молочнокислые бактерии широко используют в индустрии переработки мяса, индустрии изготовления вина, индустрии изготовлении сока, а также в ряде других индустрий.

Культуры молочнокислых бактерий также являются важными для применения в биологической консервации продуктов питания.

Публикация большого количества данных, в которых документируется, что различные молочные бактерии оказывают положительное влияние на здоровье человека и/или животных, привлекла еще больший интерес к этой группе бактерий. В частности, было обнаружено, что определенные штаммы Lactobacillus или Bifidobacterium способны колонизировать слизистую оболочку кишечника и способствовать поддержанию здоровья организма хозяина.

В EP 0768375 описаны определенные штаммы Bifidobacterium ssp, которые способны вселяться во флору кишечника и конкурентным образом не допускать адгезии патогенных бактерий к клеткам кишечника. Описано, что эти Bifidobacteria способствуют модулированию иммунной системы и, таким образом, поддержанию здоровья индивидуума. Иммуномодулирующий эффект Bifidobacteria может даже передаваться еще не родившемуся ребенку. В WO 01/97822, например, описано, что прием внутрь штамма Bifidobacterium animalis Bb-12® матерью во время беременности снижает встречаемость атопических заболеваний у детей. Также в WO 03/099037 описано, что штамм Bifidobacterium animalis Bb-12® способен положительно модифицировать иммунный ответ. В соответствии с Masco et al. (2004), штамм Bb-12® Bifidobacterium animalis правильно называть штаммом Bb-12® Bifidobacterium animalis subsp . lactis.

Пробиотические микроорганизмы определяют как "Живые микроорганизмы, которые при введении в достаточных количествах оказывают пользу для здоровья хозяина" (FAO / WHO 2002). В течение последних лет происходило накопление данных о пробиотических свойствах Bifidobacteria и других молочных бактерий. Как правило, пробиотическая активность связана с определенными штаммами. Упомянутый выше штамм Bifidobacterium animalis Bb-12®, а также штамм Bifidobacterium lactis HN019 были описаны как пробиотический (WO 01/97822, WO 03/099037, Zhou et al. (2005), US 6379663).

Во всем мире существует широко распространенное опасение, что количество устойчивых к антибиотикам патогенных бактерий значительно возрастает. Все имеющиеся данные указывают на то, что вызывающее беспокойство увеличение количества устойчивых к антибиотикам патогенных бактерий вызвано распространенным и очень широким применением антибиотиков у населения в целом, а также в животноводстве.

Точно установлено, что множество устойчивых к антибиотикам бактерий обладают генетическими детерминантами, генами, которые придают устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Более того, хорошо известно, что такие генетические детерминанты в определенных условиях могут быть перенесены и могут передавать реципиентным бактериям устойчивый к антибиотикам фенотип. Частота переноса в значительной степени зависит от конкретного генетического окружения, в котором находятся гены устойчивости к антибиотикам. Таким образом, было показано, что гены устойчивости к антибиотикам, расположенные на плазмидах или на транспозонах, передают фенотип устойчивости к антибиотикам реципиентной бактерии с относительно высокой частотой, в то время как кодируемые хромосомой детерминанты являются в значительно меньшей степени способными к перемещению.

По этим причинам может вызывать опасение употребление также полезных непатогенных бактерий, если они содержат детерминанту устойчивости к антибиотику. Этой проблеме также уделено внимание в отчете Научного комитета по питанию животных (SCAN) ЕВРОПЕЙСКОЙ КОМИССИИ по критериям оценки безопасности микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам в клинике человека и ветеринарии, 3 июля 2001 года, пересмотренном 24 января 2003 года, в котором утверждается, что наличие известного гена устойчивости недопустимо (страница 21).

Устойчивость к тетрациклину является наиболее распространенным типом устойчивости к антибиотикам у бактерий, встречающихся в природе, а также она является наиболее широко распространенным типом устойчивости среди бактерий, выделенных из животных (Billington, 2002). Тетрациклин ингибирует синтез белка посредством связывания с единичным высокоаффинным участком на субъединице рибосомы 30S. При наличии тетрациклина в этом положении предотвращается связывание аминоацил-тРНК с A-участком и, таким образом, блокируется синтез белка.

Устойчивость к тетрациклину может быть опосредована либо активным выведением тетрациклина из клетки, либо посредством защиты рибосом одним или несколькими растворимыми белками, так называемыми белками защиты рибосом (RPP), либо посредством ферментативной инактивации тетрациклина.

Недавно в изолятах рубца Butyrivibrio fibrisolvens и ряда других бактерий рубца был выявлен новый ген устойчивости к тетрациклину (Tet^r) по типу защиты рибосом, tetW (Barbosa, 1999).

Несмотря на то, что детерминанта tetW широко распространена среди устойчивых к тетрациклину изолятов патогенов животных (Billington, 2002), для авторов настоящей заявки было удивительным обнаружить, что все известные пробиотические штаммы Bifidobacterium animalis subs. lactis, включая два широко известных штамма Bifidobacterium Bb-12® и DR10™, обладают функциональной детерминантой tetW и являются устойчивыми к тетрациклину; особенно потому, что в недавнем отчете сообщалось, что штамм DR10™, а также штамм Bb-12® являются чувствительными к тетрациклину (Zhou et al. 2005).

Даже несмотря на то, что обширные эксперименты показали, что детерминанта tetW штамма Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® не способна к перемещению в природных условиях, проблема устойчивых к антибиотикам детерминант в продуктах питания все еще остается. Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли несколько подходов для осуществления инактивации или удаления гена tetW в Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® посредством классического мутагенеза, вовлекающего различные мутагены, а также посредством прямых генетических манипуляций. Однако до настоящего времени все попытки были безуспешными. Полагают, что важной причиной многих безуспешных попыток является тот факт, что tetW расположен на хромосоме пробиотических штаммов Bifidobacterium animalis subs. lactis.

Таким образом, создание способа инактивации гена устойчивости tetW в пробиотических Bifidobacteriacea обеспечило бы значительное преимущество. Более того, такой способ может помочь в решении проблемы получения чувствительных к антибиотикам вариантов представляющих коммерческий интерес пробиотических устойчивых к тетрациклину Bifidobacteriacea, которые могут удовлетворять требованию отсутствия функциональных генов устойчивости к антибиотикам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Указанная выше проблема была решена посредством предоставления способа выделения чувствительного к тетрациклину штамма Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea) из устойчивого к тетрациклину бактериального штамма-предшественника, где причиной устойчивого к антибиотику фенотипа является экспрессия функционального tetW, который стабильно интегрирован в хромосому, где указанный способ включает в себя воздействие на клетки как химического мутагена, так и физического мутагена. Предпочтительно, химический мутаген содержит бромид этидия (EtBr), а физическим мутагеном является УФ-излучение.

Этот способ является, главным образом, применимым в отношении устойчивых к тетрациклину Bifidobacterium sp. с функциональным tetW, стабильно встроенным в их хромосому, поскольку в каждом из двух экспериментов по мутагенезу, которые авторы настоящего изобретения проводили с помощью этого способа, можно было выделить чувствительные к тетрациклину варианты двух штаммов Bifidobacterium: Bb-12® и HN019 (DR10™).

Таким образом, следующими важными аспектами этого изобретения является предоставление штаммов Bifidobacterium sp., содержащих мутантный кодируемый хромосомой tetW, обеспечивающий чувствительность штамма к тетрациклинам, которые получают указанным выше способом, и применение таких штаммов Bifidobacterium для получения материала для употребления внутрь или лекарственного средства.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriaceae), где указанный способ включает в себя оказание воздействия химического мутагена и физического мутагена на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения клетки Bifidobacterium sp., содержащей инактивированный ген tetW, где указанный способ включает в себя стадии:

a) инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp., содержащей функциональный ген tetW, посредством воздействия на клетку химического мутагена и физического мутагена,

b) выделения мутантной клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), которая обладает инактивированным геном tetW.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения чувствительной к тетрациклину клетки Bifidobacterium sp., где указанный способ включает в себя стадии:

a) воздействия на клетку Bifidobacterium sp. химического мутагена и физического мутагена, где клетка Bifidobacterium sp. обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 4 микрограмма тетрациклина/мл или более,

b) выделения мутантной клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), где указанная мутантная форма обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp., содержащей инактивированный ген tetW.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp., которая обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp., содержащей мутантный кодируемый хромосомой tetW, придающий клетке чувствительность к тетрациклинам, получаемой способом по настоящему изобретению.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium, которая является чувствительной к тетрациклинам вследствие мутации в tetW, где указанная клетка Bifidobacterium получена из клетки-предшественника, которая является устойчивой к тетрациклинам вследствие наличия гена tetW, расположенного на хромосоме.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к применению клетки Bifidobacterium в соответствии с настоящим изобретением для получения материала для употребления внутрь или бактериальной культуры.

В девятом аспекте настоящее изобретение относится к продукту питания или корму, содержащему бактериальную клетку по настоящему изобретению.

В десятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве пробиотической клетки.

В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, включающему в себя введение клетки Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriaceae), где указанный способ включает в себя воздействие химического мутагена и физического мутагена на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения клетки Bifidobacterium sp., содержащей инактивированный ген tetW, где указанный способ включает в себя стадии:

a) инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp., содержащей функциональный ген tetW, посредством воздействия на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW, химического мутагена и физического мутагена,

b) выделения мутантной формы клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), которая обладает инактивированным геном tetW.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу получения чувствительной к тетрациклину клетки Bifidobacterium sp., где указанный способ включает в себя стадии:

a) воздействия на клетку Bifidobacterium sp. химического мутагена и физического мутагена, где клетка Bifidobacterium sp. обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 4 микрограмма тетрациклина/мл или более,

b) выделения мутантной формы клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), где указанная мутантная форма обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

Причина возможных сложностей при внесении мутации в ген tetW в клетке Bifidobacterium sp. может заключаться в том, что ген расположен на хромосоме клеток.

Таким образом, в способе по настоящему изобретению функциональный ген tetW может быть расположен на хромосоме клетки Bifidobacterium sp.

Таким образом, в способе по настоящему изобретению инактивированный ген tetW может быть расположен на хромосоме клетки Bifidobacterium sp.

Термин "инактивированный ген tetW" в контексте настоящего изобретения относится к гену tetW, который, при наличии в клетке, не способен выполнять его нормальную функцию.

В частности, инактивированный ген tetW представляет собой ген, который, по сравнению с функциональным геном tetW, содержит мутацию в открытой рамке считывания (ORF) гена, где указанная мутация может представлять собой мутацию со сдвигом рамки считывания, внесение стоп-кодона или мутацию, которая приводит к неконсервативной аминокислотной замене. Неконсервативную аминокислотную замену определяют как замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком со сходными химическими свойствами (например, размером, зарядом или полярностью), которая, в целом, не изменяет функциональных свойств белка.

В частности, инактивированный ген tetW представляет собой ген tetW, который, если находится в клетке, придает указанной клетке чувствительность к тетрациклину.

Термин "функциональный ген tetW" в контексте настоящего изобретения относится к гену tetW, который, если находится в клетке, придает клетке устойчивость к тетрациклину. В частности, функциональный ген tetW может представлять собой ген, содержащий открытую рамку считывания (ORF), которая обладает последовательностью, соответствующей положению 1318-3234 в SEQ ID NO:22, или последовательностью, которая обладает 30%, как, например, 40%, или 50%, или 60%, или 70%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 99% гомологией последовательности, соответствующей положению 1318-3234 в SEQ ID NO:22.

Для целей настоящего изобретения можно проводить выравнивание последовательностей и вычисление показателей гомологии с использованием полного выравнивания Смита-Ватермана, пригодного для выравнивания как белков, так и ДНК. Стандартные оценочные матрицы BLOSUM50 и матрицу идентичности использовали для выравнивания белков и ДНК соответственно. Штраф за делецию первого остатка составляет 12 для белков и 16 для ДНК, а штраф за дополнительные остатки в области делеции составляет 2 для белков и 4 для ДНК. Выравнивание можно проводить с помощью программного обеспечения FASTA версии v20u6 (W.R.Pearson and D.J.Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, и W.R.Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183: в направлении 3' или N-конец -> C-конец нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, соответственно.

Результатом настоящего изобретения является то, что автор изобретения может предоставить, в целом, пригодный способ выделения штамма Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea), который содержит мутантный tetW на хромосоме, который придает штамму чувствительность к тетрациклинам и который выделен из устойчивого к тетрациклину бактериального штамма-предшественника, где устойчивый к антибиотику фенотип вызван экспрессией tetW, стабильно интегрированного в хромосому.

Указание на "штамм-предшествинник" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как указание на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW, устойчивую к тетрациклину клетку Bifidobacterium sp. или клетку Bifidobacterium sp., которая обладает значением MIC, составляющим 4 микрограмма тетрациклина/мл или более.

Указание на "чувствительный к антибиотику штамм" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как указание на клетку Bifidobacterium sp., содержащую инактивированный ген tetW, чувствительную к тетрациклину клетку Bifidobacterium sp. или клетку Bifidobacterium sp., которая обладает значением MIC, составляющим 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка Bifidobacterium может представлять собой штамм.

В следующем варианте осуществления способы по настоящему изобретению могут после стадии a) дополнительно включать в себя стадии:

i) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналога пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но к которой устойчивы нерастущие клетки, и

ii) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде, в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствии пенициллина или аналога пенициллина, такого как ампициллин.

Термин "оказывающий отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки" в контексте настоящего изобретения относится к соединениям, способным снижать скорость экспоненциального роста клеток.

Термин "переносимый" в контексте настоящего изобретения относится к соединениям, которые оказывают критическое воздействие на бактерии.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению могут включать в себя стадии:

i) культивирования клеток-предшественников или клетки Bifidobacterium sp., содержащей функциональный ген tetW или обладающей минимальной ингибирующей концентрацией 4 микрограмма тетрациклина/мл или более, с получением культуры экспоненциально растущих клеток,

ii) переноса аликвоты клеток, полученной на стадии i), в свежую среду, содержащую химический мутаген,

iii) переноса культуры, полученной на стадии ii), в один или несколько контейнеров для образования слоя культуры толщиной 0,5-10 мм,

iv) воздействия на культуру(ы) стадии iii) физического мутагена,

v) культивирования мутантных клеток, полученных на стадии iv), с получением культуры экспоненциально растущих клеток,

vi) переноса аликвоты бактерий стадии v) в одну или несколько чашек Петри, содержащих пригодную среду для роста на основе агара, где аликвота бактерий выбрана для получения единичных колоний,

vii) идентификации тех колоний стадии vi), которые обладают приобретенной чувствительностью к антибиотику, посредством копирования посевов на чашках Петри с антибиотиком и без него и

viii) выделения и выращивания клеток, полученных на стадии vii).

Химический и физический мутаген может представлять собой мутаген, как описано в разделе, описывающем химические и физические мутагены, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению. Может быть предпочтительным поддержание и сохранение чувствительных к антибиотикам колоний, полученных на стадии viii).

Этот процесс также можно описать следующим образом: 1) культивирование клеток-предшественников с получением культуры экспоненциально растущих клеток, 2) перенос аликвоты клеток в свежую среду, содержащую бромид этидия (EtBr), 3) перенос культуры в один или несколько контейнеров для образования слоя культуры толщиной 0,5-10 мм, 4) обработка культуры УФ-излучением, 5) культивирование мутантных клеток с получением культуры экспоненциально растущих клеток, 6) перенос аликвоты бактерий в одну или несколько чашек Петри с получением единичных колоний, 7) идентификация тех колоний, которые обладают приобретенной чувствительностью к антибиотику, посредством копирования посевов на чашках Петри с антибиотиком и без него и 8) выделение, выращивание и хранение тех чувствительных к антибиотикам колоний, которые идентифицированы как новый чувствительный к антибиотику штамм.

В следующем варианте осуществления культуру полученную на стадии iv) или 4), можно подвергать стадии накопления мутаций, включающей в себя стадии:

iva) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналогов пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но к которой устойчивы нерастущие клетки, и

ivb) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствие пенициллина или аналога пенициллина, такого как ампициллин.

В данной области для определения минимальной ингибиторной концентрации (MIC)

противомикробных средств используют тесты с разведениями, и они представляют собой стандартные способы для тестирования чувствительности к антибиотикам. В тестах с разведениями микроорганизмы тестируют на их способность проявлять видимый рост в пригодной среде и наименьшую концентрацию противомикробного средства, которая ингибирует рост микроорганизма, определяют как MIC. Термины минимальная ингибиторная концентрация, минимальная ингибирующая концентрация и MIC в контексте настоящего изобретения могут использоваться взаимозаменяемо. MIC (минимальную ингибиторную концентрацию) можно рассматривать как наименьшую концентрацию конкретного соединения, которая приводит к ингибированию видимого роста, или как минимальную концентрацию антибактериального средства в данной культуральной среде, ниже которой ингибирования бактериального роста не происходит.

Для определения значения MIC конкретного соединения существуют различные способы анализа. В контексте настоящего изобретения значение MIC, в частности, можно определять в соответствии со способом скрининга чувствительности Etest, описанным Danielsen and Wind (2003). Способ скрининга чувствительности Etest включает в себя стадии:

a) погружения стерильного хлопкового тампона в культуру чувствительного к тетрациклину подлежащего тестированию штамма, который выращивали в течение ночи,

b) проведения штрихового посева на всей поверхности чашки с агаром MRS (диаметр: 8,5 см) равномерно по трем направлениям с помощью хлопкового тампона стадии a),

c) нанесения полоски E-test на поверхность агара с помощью ручного аппликатора со шкалой MIC, обращенной кверху, после высыхания посевной культуры, нанесенной на стадии b),

d) засевания чашки с агаром в анаэробных или микроаэробных условиях в перевернутом положении при 37°C в течение ночи,

e) определения значения MIC посредством определения пересечения краем эллипса ингибирования полоски.

Этот способ и полоска Etest также описаны в EP 157071, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Другой способ определения минимальной ингибиторной концентрации описан в FR-A-2264089, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Выражение "устойчивый к тетрациклину" относится к бактерии, которая обладает минимальной ингибиторной концентрацией (MIC) тетрациклина по меньшей мере более чем 4 мкг/мл (EFSA, 2005), например, по меньшей мере 5 микрограмм/мл, как, например, по меньшей мере 8 микрограмм/мл, включая по меньшей мере 10 микрограмм/мл или также по меньшей мере 15 микрограмм тетрациклина/мл. Значение MIC, в частности, может представлять собой значение, как определяют посредством способа скрининга чувствительности Etest, как описано Danielsen and Wind (2003).

Таким образом, клетка Bifidobacterium sp., содержащая функциональный ген tetW, в частности, может обладать минимальной ингибирующей концентрацией, как описано выше.

В контексте настоящего изобретения выражение "чувствительный к тетрациклинам" относится к бактерии, которая обладает MIC, составляющей 1,5 микрограмм/мл или менее, как, например, 1 микрограмм/мл или также менее чем 0,75 микрограмм/мл конкретного тетрациклина из группы тетрациклинов. Значение MIC, в частности, может представлять собой значение, как определяют способом скрининга чувствительности Etest.

Конкретно, выражение "чувствительный к тетрациклину" относится к бактерии, которая обладает MIC, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее, как, например, 1 микрограмм/мл или также менее чем 0,75 микрограмма тетрациклина/мл. Значение MIC, в частности, может представлять собой значение, как определяют способом скрининга чувствительности Etest.

Таким образом, клетка Bifidobacterium sp., содержащая инактивированный ген tetW, в частности, может обладать минимальной ингибирующей концентрацией, как описано выше.

Как показано в примере 12, до настоящего момента все мутации, которые характеризуются определенной посредством Etest минимальной ингибирующей концентрацией (MIC), которая является равной или составляет менее 1,5 мкг tet/мл, содержали мутантный tetW. Это позволяет проводить процесс селекции, который приводит к селекции чувствительных к тетрациклину штаммов Bifidobacteria, которые с высокой вероятностью содержат инактивированный ген tetW. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать в себя селекцию чувствительных к тетрациклину мутантных форм, которые, наиболее вероятно, содержат мутантный ген tetW. Этот способ селекции может включать в себя представленные ниже стадии, таким образом, стадия b) в способе по настоящему изобретению, описанная выше, может, в частности, дополнительно включать в себя стадии:

i) определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) бактерий посредством способа скрининга чувствительности Etest,

ii) разделения бактерий на два класса, исходя из результата скрининга чувствительности Etest:

Класс 1: бактерии с MIC, составляющей 1,5 мкг/мл или менее в соответствии с Etest, и

Класс 2: бактерии с MIC более 1,5 мкг/мл в соответствии с Etest; и

iii) идентификации и выращивания чувствительных к антибиотикам бактерий, выявленных в ii), с MIC, составляющей 1,5 мкг/мл или менее (Класс 1).

Кроме того, может быть предпочтительным хранение чувствительных к антибиотикам бактерий, полученных на стадии iii).

"Тетрациклины" или "группа тетрациклиновых антибиотиков" относятся к группе бактериостатических антибиотиков, продуцируемых видами Streptomyces, и к сходным с ними полусинтетическим производным. Тетрациклины ингибируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, а также риккетсии. Они характеризуются способом действия, который предполагает обратимое связывание антибиотика с рибосомой 30S и ингибирует связывание аминоацил-тРНК с акцепторным участком на рибосоме 70S. В дополнение непосредственно к тетрациклину членами группы тетрациклинов считают террамицин, демеклоциклин, меклоциклин, доксициклин/доксициклин, лимециклин, метациклин, миноциклин, окситетрациклин, ролитетрациклин, ауреомицин, а также другие хлортетрациклины. Таким образом, вариантом осуществления настоящего изобретения также является способ, где тетрациклины представляют собой антибиотики, выбранные из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, тетрациклина, террамицина, демеклоциклина, меклоциклина, доксициклина/доксициклина, лимециклина, метациклина, миноциклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, ауреомицина и других хлортетрациклинов.

Предпочтительным типом тетрациклинов является тетрациклин.

Как упоминалось, перед тем как способ был разработан, потребовалось несколько попыток. Полагают, что именно совместное действие как химического, так и физического мутагена, например, бромида этидия и ультрафиолетового излучения, повышает вероятность успешной мутации гена tetW.

Для дальнейшего повышения вероятности успеха культуру или клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW или обладающую значением MIC 4 микрограмма тетрациклина/мл или более, можно после стадии мутации, т.е. стадии воздействия на указанную культуру или клетку химического и физического мутагена, подвергать стадии накопления мутаций, включающей в себя стадии: a) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналога пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но к которой устойчивы нерастущие клетки, и b) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствие аналога пенициллина.

Поскольку такой "процесс селекции с ампициллином" широко распространен и его часто использовали для грамотрицательных бактерий с 1972 года (Miller 1972), удивительно, что "процесс селекции с ампициллином", насколько известно авторам настоящего изобретения, ранее не применяли в протоколе мутаций, направленном против грамположительных Bifidobacteriaceae. Несмотря на то, что некоторые Bifidobacteriacea могут расти в аэробных условиях, считают предпочтительным, чтобы культуру выращивали при пониженном давлении кислорода, например, посредством дополнения среды для выращивания гидрохлоридом цистеина, как описано в примере 1.

В общем, полагают, что подход двойного мутагенеза по настоящему изобретению является более эффективным, чем когда мутагены используют по отдельности.

Химический мутаген по существу может представлять собой любое химическое соединение, способное приводить к мутациям в нуклеиновых кислотах, в частности, в ДНК. В частности, химический мутаген может представлять собой интеркалирующий поглощающий УФ-излучение мутаген, т.е. химическое соединение, способное как интеркалировать в нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, так и поглощать УФ-излучение. Без связи с какой-либо теорией автор настоящего изобретения полагает, что посредством сочетания интеркалирующих поглощающих УФ-излучение соединений в качестве химических мутагенов и УФ-излучения в качестве физического мутагена можно достичь определенной степени специфичности последовательности в отношении мутации последовательности нуклеиновой кислоты, такой как ДНК. Например, бромид этидия (EtBr), который представляет собой интеркалирующее поглощающее УФ-излучение соединение, обычно не случайным образом интеркалирует в ДНК. Как правило, количество EtBr, который интеркалирует в ДНК, зависит от степени сверхспирализации ДНК. Поскольку степень сверхспирализации ДНК, по меньшей мере в эукариотах, коррелирует с уровнем экспрессии конкретного гена, полагают, что это может привести к определенной степени специфичности последовательности в отношении области, в которой EtBr интеркалирует в ДНК. Наличие интеркалированного в последовательность ДНК EtBr, как правило, приводит к мутации(ям) последовательности ДНК в той области, где интеркалирует EtBr, при воздействии на указанную последовательность УФ-излучения. Более того, EtBr, как правило, интеркалирует в областях участка поли-dA - поли-dT последовательностей ДНК, или по меньшей мере степень интеркаляции EtBr в таких последовательностях является низкой по отношению к другим последовательностям.

Примеры пригодных интеркалирующих поглощающих УФ-излучение соединений включают в себя, но не ограничиваются ими, бромид этидия (EtBr), этидий, профлавин, дауномицин, адриамицин, актиномицин, эллиптицин, тилорон, m-AMSA, митрамицин, нетропсин, иредиамин A, антрамицин, стрептонигрин, блеомицин, дитеркалиний, триостин и эхиномицин. Другие примеры таких пригодных соединений приведены в US 5391723, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Физический мутаген по настоящему изобретению в конкретном варианте осуществления может представлять собой неионизирующее излучение с длиной волны короче 800 нм. Примером такого физического мутагена является УФ-излучение.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения химический мутаген представляет собой интеркалирующее поглощающее УФ-излучение соединение, такое как любое из упомянутых выше примеров, и физический мутаген представляет собой неионизирующее излучение с длиной волны короче 800 нм, такое как УФ-излучение. В следующем варианте осуществления химический мутаген представляет собой EtBr и физический мутаген представляет собой УФ-излучение.

Как показано в примере 1, комбинированное воздействие EtBr и УФ-излучения значительно снижает жизнеспособность клеток после обработок EtBr-УФ. Полагают, что такой эффективный двойной подход позволяет сделать вывод, что можно достичь эффективной инактивации гена tetW в Bifidobacteriacae. Таким образом, в одном важном варианте осуществления настоящего изобретения обработку УФ-излучением подбирают таким образом, чтобы вызвать снижение количества живых клеток, как измеряют с помощью колониеобразующих единиц (CFU), до менее чем 20%, как, например, менее чем 15% или даже менее чем 10% относительно количества CFU в культуре непосредственно перед обработкой УФ-излучением. В одном варианте осуществления этот подбор обработки УФ-излучением можно проводить на стадии iv) способа.

В предпочтительном варианте осуществления концентрацию EtBr доводят до концентрации между 10 и 30 микрограмм/мл. В следующих вариантах осуществления аналог пенициллина, используемый в "процессе накопления с ампициллином" представляет собой ампициллин, который, в частности, можно использовать в дозе 50-300 микрограмм/мл в среде, в частности, эту дозу ампициллина можно использовать совместно с концентрацией EtBr 10-30 микрограмм/мл.

Устойчивость к тетрациклину и окситетрациклину была выявлена в штаммах Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis и их подвидов (Yazid (2000), Lim (1983), Scott (2000), это исследование). TetW был выявлен в устойчивых к тетрациклину штаммах Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis (Scott et al. 2000, Moubareck et al. 2005). Однако устойчивость к тетрациклину не является свойственной пробиотическим штаммам Bifidobacterium. Moubareck (2005) описывает, что пробиотические Bifidobacteria, как правило, оказываются более чувствительными к антибиотикам, и было описано, что два хорошо известных пробиотических штамма Bifidobacteria, Bifidobacterium animalis supsp. lactis Bb-12® и DR10™ являются чувствительными к тетрациклину (Zhou et al. 2005). Также Moubareck (2005) не выявил tetW в Bifidobacterium animalis. Однако удивительно, в настоящем исследовании описано, что также пробиотические штаммы Bifidobacterium, включая пробиотические штаммы Bifidobacterium animalis, такие как штамм Bifidobacterium animalis supsp. lactis Bb-12® и DR10™, содержат функциональный tetW, придающий бактерии устойчивость к тетрациклину.

Таким образом, в предпочтительных в настоящем описании вариантах осуществления бактериальные виды выбраны из группы, состоящей из Bifidobacteriacea, содержащих функциональный tetW, придающий бактериям устойчивость к тетрациклину. В следующем предпочтительном варианте осуществления устойчивый к тетрациклину бактериальный штамм-предшественник представляет собой пробиотический штамм. Аналогично, клетка Bifidobacterium sp., содержащая функциональный ген tetW или обладающая значением MIC 4 микрограмм тетрациклина/мл или более, может представлять собой пробиотическую клетку.

Мутантная клетка Bifidobacterium sp., содержащая инактивированный ген tetW или обладающая значением MIC 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее, также может представлять собой пробиотическую клетку.

В контексте настоящего изобретения термин "пробиотический" следует понимать как "Живые микроорганизмы, которые при введении в достаточных количествах приносят пользу для здоровья хозяина" (FAO / WHO 2002).

В частности, пробиотические штаммы могут представлять собой штаммы, которые способны выживать при прохождении через пищевод и желудок и, более того, способны выживать после воздействия желчной кислоты, которое происходит в верхней части кишечника. Таким образом, ожидают, что потенциальная пробиотическая бактерия выживает после воздействия желудочного сока в желудке (пример 9) и, кроме того, обладает устойчивостью к желчным солям (пример 10). Штамм плацебо для таких исследований, в частности, может представлять собой штаммы, которые не обладают пробиотическим эффектом; более конкретно, штаммы, которые, кроме того, не обладают патогенным эффектом.

В течение последних лет накапливались данные о пробиотических свойствах Bifidobacteria и других молочных бактерий. Как правило, пробиотическая активность ассоциирована с конкретными штаммами. Упомянутый ранее штамм Bifidobacterium animalis Bb-12®, а также штамм Bifidobacterium lactis HN019 были описаны как пробиотические (WO 01/97822, WO 03/099037, Zhou et al. (2005), US 6379663).

Виды Bifidobacterium, которые являются пригодными по настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium pseudocatenulatum и их подвиды.

Однако это изобретение не ограничивается этими упомянутыми выше конкретными Bifidobacteriacea. Специалист в данной области определит те Bifidobacteriacea, которые могут быть пригодными в способе в соответствии с этим изобретением, а также другие пробиотические бактерии, которые содержат функциональный tetW, придающий им устойчивость к тетрациклинам.

В предпочтительном варианте осуществления штамм-предшественник или клетка-предшественник, клетка Bifidobacterium sp., которая содержит функциональный ген tetW, или клетка Bifidobacterium sp., которая обладает MIC 4 микрограмма тетрациклина/мл или более, представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis. В частности, указанная клетка или штамм представляет собой клетку или штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC5445 (Bb-12®), депонированный 30 сентября 2003 года в соответствии с Договором Будапешта о международном признании коллекции микроорганизмов для целей процедур выдачи патентов в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM15954, или штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC7158, депонированный 28 апреля 2005 года в соответствии с Договором Будапешта о международном признании коллекции микроорганизмов для целей процедур выдачи патентов в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17280.

Следует отметить, что со временем номенклатура Bifidobacterium animalis подвида lactis изменилась.

Первоначально штамм Bifidobacterium Bb-12® был описан как Bifidobacterium bifidum. Затем было обнаружено, что более правильным было Bifidobacterium animalis, хотя штамм не является типичным Bifidobacterium animalis. Штамм отличается от Bifidobacterium animalis несколькими аспектами, как описано Meile et al (1997), которые предположили создать новый вид, Bifidobacterium lactis. Это название вида позднее было утверждено в перечне no.62 в IJSB (1997). После публикации Meiles статус вида Bifidobacterium lactis обсуждали. Недавно, Cai et al. (2000) опубликовали результаты гибридизации ДНК-ДНК, которые показали, что Bifidobacterium lactis не отличается в достаточной степени от Bifidobacterium animalis для признания статуса вида. Исходя из этих результатов, Международный комитет по Системной бактериологии, Субкомитет по систематике Bifidobacterium, Lactobacillus и родственных им организмов постановил, что Bifidobacterium lactis нельзя признать отдельным видом (Minutes, IJSEM, 2001). С того времени был проведен и опубликован многофазный таксономический анализ, что привело к выделению двух подвидов в Bifidobacterium animalis (Masco et al., 2004). Bb-12® относится к одному из подвидов B. animalis subsp. lactis. Исходя из "отпечатков пальцев ДНК" авторы настоящего изобретения также обнаружили, что широко известный штамм Bifidobacterium DR10™ правильно было бы обозначать как B. animalis subsp. lactis. В литературе штамм DR10™ также называют Bifidobacterium lactis HN019 (Zhou 2005) и HOWARU™ Bifido (www.danisco.com).

Как показано в примере 2, результатом способа по настоящему изобретению может быть получение двух классов новых чувствительных к антибиотику изолятов, где один класс проявляет промежуточный уровень чувствительности к тетрациклину, т.е. изоляты с MIC в диапазоне между 2 и 4 мкг тетрациклина/мл, и изоляты с MIC менее чем 1,5 мкг тетрациклина/мл, как, например, 0,75 или даже 0,5 мкг тетрациклина/мл. К настоящему времени авторы выявили изоляты с инактивированным tetW в изолятах с MIC менее чем 1,5 мкг тетрациклина/мл, и во всех случаях авторы настоящего изобретения в качестве клеток-предшественников использовали Bifidobacteriacea, обладающие MIC более 10 микрограмм тетрациклина/мл. Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ выделения чувствительного к тетрациклину штамма Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea) из устойчивого к тетрациклину бактериального штамма-предшественника, где минимальная ингибирующая концентрация (MIC) тетрациклина для клетки-предшественника составляет по меньшей мере 10 микрограмм тетрациклина/мл, и MIC чувствительного к антибиотику штамма составляет 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее. Штамм-предшественник может представлять собой клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW или обладающую значением MIC 4 микрограмма тетрациклина/мл или более, и чувствительный к антибиотику штамм может представлять собой мутантную клетку Bifidobacterium sp., содержащую инактивированный ген tetW или обладающую значением MIC 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

Поскольку группа тетрациклиновых антибиотиков обладает общим способом действия, полагают, что инактивация tetW, в целом, приведет к изменению чувствительности к любому антибиотику из группы тетрациклинов, сходному с изменением, выявленным для тетрациклина. Таким образом, вариант осуществления этого изобретения представляет собой способ выделения штамма Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea), который является чувствительным к одному или нескольким тетрациклинам, из бактериального штамма-предшественника, который является устойчивым к одному или нескольким тетрациклинам, и где минимальная ингибирующая концентрация (MIC) указанного антибиотика для штамма-предшественника по меньшей мере в 10 раз превышает MIC чувствительного к антибиотику штамма. Штамм-предшественник может представлять собой клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW или обладающую значением MIC 4 микрограмма тетрациклина/мл или более, и чувствительный к антибиотику штамм может представлять собой мутантную клетку Bifidobacterium sp., содержащую инактивированный ген tetW или обладающую значением MIC 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

Примеры антибиотиков группы тетрациклинов представлены группой антибиотиков, содержащей тетрациклин, террамицин, демеклоциклин, меклоциклин, доксициклин/доксициклин, лимециклин, метациклин, миноциклин, окситетрациклин, ролитетрациклин, ауреомицин и другие хлортетрациклины.

Насколько известно авторам настоящего изобретения, к настоящему времени все пробиотические штаммы Bifidobacterium animalis subs. lactis и значительное количество других Bifidobacteriacea обладают функциональной детерминантой tetW, придающей им устойчивость к тетрациклину. Автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что можно получить Bifidobacteriacea, которые обладают инактивированной детерминантой tetW.

Как показано в примерах, получение вариантов известных пробиотических штаммов Bifidobacterium sp., которые содержат мутантный кодируемый хромосомой tetW, придающий штамму чувствительность к тетрациклинам, действительно является возможным. Предоставление таких новых штаммов считают наиболее предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Таким образом, в следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp., содержащей инактивированный ген tetW. Эта клетка, в частности, может обладать минимальной ингибирующей концентрацией 1,5 микрограмма тетрациклина/мл.

В следующем варианте осуществления инактивированный ген tetW клетки Bifidobacterium sp. может быть расположен на хромосоме указанной клетки.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к клетке Bifidobacterium sp., которая обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к полученной способом по настоящему изобретению клетке Bifidobacterium sp., содержащей мутантный кодируемый хромосомой tetW, придающий клетке чувствительность к тетрациклинам.

Настоящее изобретение также относится к клетке Bifidobacterium, которая является чувствительной к тетрациклинам вследствие мутации в tetW, где указанная клетка Bifidobacterium получена из клетки-предшественника, которая является устойчивой к тетрациклинам вследствие наличия гена tetW, расположенного на хромосоме.

Новый штамм или клетка по существу может представлять собой вариант или мутантную форму любой Bifidobacterium, обладающей хромосомой, кодирующей tetW, придающий штамму устойчивость к тетрациклинам. Пригодные клетки могут быть выбраны из группы Bifidobacteriacea, содержащей Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis и их подвиды. В частности, предпочтительными являются клетки, относящиеся к Bifidobacterium animalis подвида lactis.

Указание на тетрациклин в отношении клетки Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению включает в себя тетрациклины, описанные в отношении способов по настоящему изобретению. Аналогично, клетка-предшественник может представлять собой любую из клеток, ранее указанных в отношении клетки-предшественника, пригодной в способе по настоящему изобретению. Как правило, предпочтительными являются новые бактериальные штаммы, обладающие минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) антибиотика, которая по меньшей мере в 10 раз меньше MIC устойчивой к антибиотику клетки-предшественника.

Таким образом, минимальная ингибирующая концентрация антибиотика (MIC) клетки-предшественника может по меньшей мере в 10 раз превышать MIC чувствительной к антибиотику клетки.

В частности, минимальная ингибирующая концентрация (MIC) тетрациклина для клетки-предшественника может составлять по меньшей мере 10 микрограмм тетрациклина/мл, и MIC клетки чувствительного к антибиотику штамма может составлять 1 микрограмм тетрациклина /мл или менее.

Предпочтительными клетками Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению могут быть клетки, обладающие MIC, которая составляет 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее, как, например, 1 микрограмм/мл или даже менее 0,75 микрограмма тетрациклина/мл. Значение MIC, в частности, может представлять собой значение, как определяют посредством способа скрининга чувствительности Etest.

Такие штаммы, которые обладают мутантным tetW, являются особенно предпочтительными вариантами осуществления этого изобретения.

Инактивирующую мутацию гена tetW, которая придает новым штаммам чувствительность к тетрациклинам, как правило, можно описывать по отношению к последовательности гена tetW соответствующей клетки-предшественника.

Как описано в примерах, пригодные чувствительные к тетрациклину штаммы с инактивированным tetW можно получать посредством внесения определенных мутаций в ген tetW.

В одном предпочтительном варианте осуществления этого изобретения в tetW вводили стоп-кодон "opal" посредством изменения части кодируемого хромосомой tetW, характеризующегося последовательностью TCG CTG GGA TAC TTG AAC CAG AGT [SEQ ID 1], на TCG CTG GGA TAC TGA ACC AGA GTT [SEQ ID 2], удаленное основание в функциональном tetW указано подчеркиванием. Таким образом, клетка Bifidobacterium, которая содержит последовательность: GGA TAC TGA ACC [SEQ ID 3] или [ATACTGAA] в своем гене tetW, является предпочтительным вариантом осуществления по настоящему изобретению. Авторы также выявили, что можно инактивировать ген tetW и обеспечивать чувствительность к тетрациклину посредством изменения части кодируемого хромосомой tetW, который содержит последовательность CAG AGC GTG GTT CAG TCT GTT CGG [SEQ ID 4], на CAG AGC GTG GTT TAG TCT GTT CGG [SEQ ID 5]. Эта мутация вносит стоп-кодон "amber" в tetW, и мутантное основание в функциональном tetW подчеркнуто. Такая Bifidobacterium, которая содержит последовательность GTG GTT TAG TCT [SEQ ID 6] или [GGTTTAGT] в своем гене tetW представляет собой другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Бактериальный штамм или клетка Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению, где инактивированный или мутантный ген tetW содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, SEQ ID NO:3 [GGA TAC TGA ACC], [ATACTGAA], SEQ ID NO:6 [GTG GTT TAG TCT], [GGTTTAGT], SEQ ID NO:27 [AC CAG CGT TTT C] и [CAGCGTTT], также представляет собой вариант осуществления настоящего изобретения.

Внесение стоп-кодонов "opal" и "amber" в кодирующую белок область гена tetW отражает два значительно отличающихся молекулярных процесса. В случае мутации "opal" основание было удалено, в то время как в случае "amber" была проведена мутация основания (в данном случае с C на T-пару, т.е. транзиция основания).

Следует отметить, что tetW в Bifidobacterium можно инактивировать посредством мутаций другого типа в других участках tetW. Это показано с помощью мутантного штамма Bifidobacterium Bb-12Tet-S180, в котором ген tetW содержит SEQ ID NO:27 [AC CAG CGT TTT C], которая соответствует трансверсии одного основания с A на C в положении #2731 в SEQ ID 22; и DR10Tet-S33 и Bb-12Tet-S79, которые содержат множественные мутации в tetW. DR10Tet-S33 содержит две мутации в tetW, описанные с помощью SEQ ID NO:28 [CG CCC TGC CAC A] (или [CCCTGCCA]) и SEQ ID NO:29 [AT ATT GTC ATC A] (или [ATTGTCAT]), и Bb-12Tet-S79 содержит три мутации, описанные с помощью SEQ ID NO:30 [TA GAC GAT GGA A] (или [GACGATGG]), SEQ ID NO:31 [CG GTC CGG GTA A] (или [GTCCGGGT]) и SEQ ID NO:32 [CT GAT CCG GCC TT] (или [GATCCGGC]). Таким образом, в одном варианте осуществления клетка Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению может представлять собой клетку, где инактивированный или мутантный ген tetW содержит одно из указанных выше сочетаний последовательностей.

Таким образом, клетка Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой клетку, где инактивированный или мутантный ген tetW содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID 3 [GGATACTGAACC], SEQ ID NO:6 [GTGGTTTAGTCT], SEQ ID 25 [ATACTGAA], SEQ ID NO:27 [ACCAGCGT TTTC], SEQ ID 28 [CGCCCTGCCACA], SEQ ID 29 [ATATTGTCATCA], SEQ ID 30 [TAGACGATGGAA], SEQ ID 31 [CGGTCCGGGTAA], SEQ ID 32 [CTGATCCGGCCTT], [CAGCGTTT], [GACGATGG], [GTCCGGGT], [ATCCGGCC], [CCTGCCAC], [TTGTCATC], [GGTTTAGT], [GTGGACCG], [CGCCCATT] и [TCCGGCCC].

В частности, клетка Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой клетку, где инактивированный или мутантный ген tetW содержит последовательности [CCTGCCAC] и [TTGTCATC].

В другом варианте осуществления клетка Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой клетку, где инактивированный или мутантный ген tetW содержит последовательности [GACGATGG], [GTCCGGGT] и [ATCCGGCC].

Поскольку штамм Bifidobacterium содержит мутантный кодируемый хромосомой tetW, придающий штамму чувствительность к тетрациклинам и получаемый способом по настоящему изобретению, полученные чувствительные к тетрациклину штаммы являются вариантами осуществления по настоящему изобретению.

Очень важным показателем наличия высокой вероятности того, что мутантный чувствительный к тетрациклину штамм содержит мутантный ген tetW, является определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для бактерии посредством способа скрининга чувствительности Etest. Как показано в примере 12, мутантные штаммы можно подразделить на два класса: Класс 1: штаммы с MIC 1,5 мкг/мл или менее; и Класс 2: штаммы с MIC > 1,5 мкг/мл. Это используют в варианте осуществления способа выделения штаммов, который включает в себя стадии:

a) определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) бактерий посредством способа скрининга чувствительности Etest,

b) разделения бактерий на два класса, исходя из результата скрининга чувствительности Etest:

Класс 1: бактерии с MIC 1,5 мкг/мл или менее в соответствии с Etest, и

Класс 2: бактерии с MIC более 1,5 мкг/мл в соответствии с Etest и

c) идентификации и выращивания тех чувствительных к антибиотикам бактерий, которые идентифицированы на стадии b) как относящиеся к классу 1.

В следующем варианте осуществления стадия c) может включать в себя хранение чувствительных к антибиотикам бактерий. В частности, на стадии c) можно идентифицировать, выращивать и хранить те чувствительные к антибиотикам бактерии, которые идентифицированы на стадии b) как относящиеся к классу 1, как новый чувствительный к антибиотикам штамм. Наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой бактериальный штамм или клетку Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению, который идентифицирован как Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) и депонирован 28 апреля 2005 года в соответствии с Договором Будапешта о международном признании коллекции микроорганизмов для целей процедур выдачи патентов в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17281. Этот чувствительный к тетрациклину штамм в своем tetW содержит мутацию "opal". Этот штамм является особенно предпочтительным, поскольку он является мутантной формой широко известных пробиотических Bifidobacterium Bb-12®. Более того, CHCC8902 содержит делецию одного основания в tetW, характеризующуюся относительно низкой скоростью реверсии, составляющей менее 1,6×10^-9, что делает его особенно пригодным для употребления внутрь в больших количествах (см. пример 4). Как показано в примере 9 и 10, чувствительный к тетрациклину штамм Bb-12Tet-S139 сохраняет свойства пробиотического штамма. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения чувствительный к тетрациклину бактериальный штамм или клетка Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению представляет собой пробиотический штамм.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой бактериальный штамм или клетку Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению, который идентифицирован как Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC9070 (DR10Tet-S9X) и депонирован 28 апреля 2005 года в соответствии с Договором Будапешта о международном признании коллекции микроорганизмов для целей процедур выдачи патентов в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17282. Этот чувствительный к тетрациклину штамм в своем tetW содержит мутацию "amber". Этот штамм также является предпочтительным, поскольку он представляет собой мутантную форму широко известного пробиотического штамма Bifidobacterium DR10™ (CHCC7158). CHCC9070 (DR10Tet-S9X) содержит транзицию одного нуклеотида в tetW. Как ожидали, исходя из существующей литературы по транзициям оснований, скорость реверсии является более высокой, чем, например, в мутантных формах с делецией. В случае CHCC9070 он обладает скоростью обратной мутации 1,8×10^-8. Несмотря на то, что CHCC9070 более подвержен реверсии, чем CHCC8902, штамм, тем не менее, является относительно стабильным и, таким образом, пригодным для употребления внутрь.

Как упоминалось выше, некоторые Bifidobacteria могут служить в качестве пробиотических, т.е. в качестве непатогенных организмов, которые приносят пользу для здоровья при пероральном приеме в продуктах питания или капсулах. Общими мишенями пробиотического действия являются нарушения кишечника (например, диарея путешественников, ассоциированная с антибиотиками диарея) или кишечные симптомы (набухание, вздутие, дискомфорт). Кроме того, более широкий диапазон положительных эффектов (например, антихолистеринемические, антиканцерогенные и иммуностимулирующие свойства) также описан в литературе, касающейся пробиотических бактерий.

Таким образом, в следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению клетки Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению для получения материала для употребления внутрь или бактериальной культуры.

Таким образом, в следующем варианте осуществления клетка Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению может быть предназначена для применения в качестве пробиотической.

В частности, клетка Bifidobacterium sp. по настоящему изобретению для применения в качестве пробиотической может находиться в форме употребляемого внутрь материала.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего посредством введения клетки Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением.

В частности, клетка Bifidobacterium sp. может быть предоставлена в способе в качестве употребляемого внутрь материала.

Термины "желудочно-кишечный тракт" или "кишечный" в контексте настоящего изобретения используют взаимозаменяемо, и они относятся как к верхнему, так и к нижнему желудочно-кишечному тракту, который включает в себя рот, пищевод, желудок, тонкий кишечник, включая двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку, и толстый кишечник, включающий в себя ободочную кишку и слепую кишку.

В следующем варианте осуществления бактериальную культуру можно дополнительно обрабатывать.

Бактерии, т.е. клетки Bifidobacterium sp., по этому изобретению могут быть представлены в форме ферментированного продукта питания или в дозированных формах, составленных в качестве таблетки (включая жевательные таблетки), капсулы (либо твердого, либо мягкого типа), порошка, гранулята, жидкого препарата, суспензии, высушенной пероральной добавки, жидкой пероральной добавки, сухого состава для кормления через зонд или жидкого состава для кормления через зонд.

В одном варианте осуществления употребляемый внутрь материал представляет собой ферментированный продукт питания или корм, полученный с использованием Bifidobacteria по настоящему изобретению. Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к продукту питания или корму, содержащему бактериальную клетку или штамм в соответствии с настоящим изобретением, т.е. клетку Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением.

Ферментированный продукт питания или корм можно подвергать дополнительной обработке. В ряде случаев было описано, что в процессе брожения бактерии продуцируют полезные для здоровье соединения. В таких случаях может быть предпочтительным фракционирование и/или повышении концентрации фракций ферментированных продуктов питания. Можно даже предположить, что в определенных случаях может быть полезной дополнительная обработка ферментированного продукта питания посредством пастеризации, даже несмотря на то, что при таком процессе происходит инактивация Bifidobacteria.

Однако, как правило, считают, что полезно, когда употребляемый внутрь материал содержит живые Bifidobacteria в количестве от приблизительно 10⁵ кое/г до приблизительно 10¹² кое/г употребляемого внутрь материала, поскольку живые клетки являются необходимым условием для достижения пробиотического эффекта.

Полагают, что Bifidobacteria по настоящему изобретению можно использовать для получения широкого диапазона употребляемых внутрь материалов, таких как молоко, творог, продукты брожения молока, сквашенное молоко, йогурт, замороженный йогурт, молочный порошок, порошки на основе молока, концентрат молока, сыр, плавленый сыр, соусы, напитки, мороженое, фруктовое мороженое или фруктовый лед, ферментированные продукты на основе зерновых, молочная смесь для младенцев и соевое молоко.

Следующий важный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой применение Bifidobacteria по настоящему изобретению для получения композиции для лечения или профилактики заболевания, синдрома или состояния, или для улучшения переваривания пищевых добавок, или для улучшения общего состояния здоровья человека или позвоночного животного.

Поскольку Bifidobacteria, как правило, рассматривают как пробиотические организмы (Yazid, 2000), применение Bifidobacteria по настоящему изобретению в качестве пробиотических организмов является предпочтительным вариантом осуществления. Пробиотическая композиция по настоящему изобретению может представлять собой любой употребляемый внутрь материал, выбранный из группы, состоящей из молока, творога, продуктов брожения молока, сквашенного молока, йогурта, замороженного йогурта, молочного порошка, порошков на основе молока, концентрата молока, сыра, плавленого сыра, соусов, напитков, мороженого, ферментированных продуктов на основе злаковых, молочной смеси для младенцев, таблеток, жидких бактериальных суспензий, сухой пероральной добавки, жидкой пероральной добавки, сухого продукта для питания через зонд или жидкого продукта для питания через зонд, которые получают с использованием Bifidobacteria по этому изобретению.

В следующем варианте осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в настоящем описании, термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько твердых или жидких разбавителей или одно или несколько веществ для инкапсулирования, которые пригодны для введения человеку или животному и которые являются совместимыми с пробиотически активными организмами. Термин "совместимый" относится к компонентам фармацевтической композиции, которые можно смешивать с пробиотическими организмами таким образом, чтобы не происходило взаимодействия, поскольку оно по существу может снизить пробиотическую эффективность организмов, выбранных для этого изобретения, в обычных условиях применения. Фармацевтически приемлемые носители должны обладать достаточно высокой чистотой и достаточно низкой токсичностью для того, чтобы они были пригодными для введения человеку и животным, подлежащим лечению.

В пригодных вариантах осуществления употребляемый внутрь материал в соответствии с этим изобретением является пригодным для профилактики или лечения заболевания, синдрома или состояния, выбранного из группы, состоящей из ассоциированных с антибиотиками нарушений, гастроэнтерита, диареи, включая диарею путешественников и острую младенческую диарею, непереносимости лактозы, желудочно-кишечных инфекций и колонизации желудочно-кишечного тракта патогенными бактериями, включая Helicobacter pylori и Clostridium difficile, синдрома раздраженной кишки (IBS), воспалительного заболевания кишечника (IBD) и других иммуномодулирующих заболеваний, рака толстой кишки, урогенитальных инфекций и опухолей, вагинальных инфекций, аллергии (особенно атопической экземы), вакцинации, холестеринемии и гипертензии.

В следующих пригодных вариантах осуществления употребляемый внутрь материал в соответствии с этим изобретением является пригодным для профилактики или лечения инфекций патогенами, такими как, например, Heliobacter pylori, Campylobacter pylori, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas maltophilia, Salmonella sp., и грибами, такими как Candida albicans и Aspergillus fumigatus, и сочетаниями этих видов.

В последние годы в качестве основной причины инфекционной диареи были выявлены ротавирусы и другие кишечные вирусы. Интересно, что было показано, что как Bifidobacterium Bb-12®, так и HN019 (DR10™) также являются эффективными для профилактики и лечения инфекций, вызванными этими патогенами. Таким образом, в пригодных вариантах осуществления употребляемый внутрь материал в соответствии с этим изобретением применяют для профилактики или лечения инфекций ротавирусами и другими кишечными вирусами.

Может быть пригодным объединение двух или более из указанных выше пробиотически активных организмов, таких как, например, препарат, содержащий вид Lactobacillus и вид Bifidobacterium.

Эффективность мутантных штаммов и их польза для человека

Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12® (CHCC5445) представляет собой крайне важный штамм для здоровья и хорошего самочувствия млекопитающего вследствие его пробиотических способностей (например, иммуностабилизирующего эффекта у человека, контроля баланса микрофлоры в пищеварительном тракте, приводящего к снижению или ингибированию различных эпидемиологических синдромов, и т.д.). Также Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 (DR10™, CHCC7158) обладает внушительными данными в отношении пробиотической активности. Несмотря на то, что оба из этих штаммов обладают активным геном, кодирующим устойчивость к тетрациклину, наиболее известную встречающуюся в природе устойчивость к антибиотикам (Chopra и Roberts, 2001), оба из них в течение многих лет используют при изготовлении продуктов питания, и, насколько известно авторам настоящего изобретения, они не причиняют какого-либо вреда. Напротив, применению этих штаммов приписывают только положительные эффекты. Однако тот факт, что оба штамма содержат активный tetW в своем геноме, обеспечивает теоретическую возможность переноса устойчивости к тетрациклину другим и, возможно, вредным бактериям в пищеварительной системе человека. Риск этого возрастает, если употребленные внутрь донорные бактерии выживают в кишечнике в больших количествах, как в случае типичного применения пробиотических бактерий. Инактивация в двух вариантах гена tetW, как это показано в настоящем описании, устраняет риск горизонтального переноса функциональных генов устойчивости к антибиотикам. За исключением повреждения tetW, два чувствительных к тетрациклину штамма, вероятно, являются изогенными с их родительскими штаммами, как предположено в примере 5 и примере 6. Таким образом, можно предположить, что два чувствительных к тетрациклину штамма обладают большинством, если не всеми признаками, которые делают Bb-12® и HN019 (DR10™) пробиотическими.

Кроме того, для дополнительной характеристики мутантных штаммов проводят лабораторные тесты, включающие в себя двумерный гель-электрофорез, для подтверждения изогенных со штаммами дикого типа основных свойств.

Заключение

1) Инактивацию гена устойчивости к тетрациклину, tetW, из Bifidibacterium animalis ssp lactis Bb-12® и Bifidibacterium animalis ssp lactis HN019 (DR10™) проводили посредством сочетания интеркалирующего мутагена, бромида этидия, и последующего ультрафиолетового облучения.

2) Пять из полученных чувствительных к тетрациклину изолятов, источником которых были Bb-12® и HN019 (DR10™), были не способны расти в бульоне MRS с тетрациклином в концентрации выше 1,5 мкг/мл.

3) Характеристика одного из мутантных изолятов, Bb12Tet-139 (производное CHCC5445), показала наличие сдвига рамки считывания в положении нуклеотида #2722 в гене tetW, непосредственно приводящего к укороченному на 170 аминокислот продукта гена вследствие стоп-кодона "opal". В другой мутантной форме, DR10Tet-S9X (производное CHCC7158) стоп-кодон "amber" (нуклеотидное положение #1741) приводил к укороченному на 498 аминокислот продукту гена.

4) Скорость реверсии для Bb12Tet-S139 составляет менее 1,6×10^-9 и скорость обратной мутации для DR10Tet-S9x составляет 1,8×10^-8.

5) Рост, скорость закисления, ДНК-профиль и транскриптом (пример 6) мутантных форм по tetW не отличались от соответствующих штаммов дикого типа.

6) Анализы мутантных изолятов не показали каких-либо перестроек или модификаций, кроме tetW, геномной ДНК, исходя из "отпечатков пальцев" ДНК и транскриптомных анализов.

7) Эксперименты показали, что в Bb12Tet-139 сохранено множество пробиотических свойств Bb-12®.

Bifidobacteria и другие молочнокислые бактерии широко применяют в качестве заквасочных культур, которые служат для технологических целей при получении различных продуктов питания. Наиболее широко известная индустрия с использованием заквасочных культур представляет собой молочную промышленность, однако заквасочные культуры также применяют в других индустриях, например, в мясоперерабатывающей индустрии. Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой применение штамма Bifidobacterium в соответствии с этим изобретением для получения заквасочной культуры. Помимо жидких заквасочных культур заквасочные культуры могут быть предоставлены в качестве замороженных или сухих заквасочных культур. В следующем варианте осуществления заквасочная культура может быть лиофилизированной, высушенной распылением или высушенной в псевдоожиженном слое.

Композиция заквасочной культуры в соответствии с настоящим изобретением, как правило, содержит бактерии с концентрацией живых клеток, находящейся в диапазоне от 10⁴ до 10¹² кое на грамм композиции. Удобный способ получения замороженной заквасочной культуры включает в себя следующие стадии: 1. культивирования бактериального штамма в соответствии с настоящим изобретением, 2. сбора размноженных клеток с получением концентрированной бактериальной культуры, 3. замораживания бактериального материала с получением замороженного материала и 4. упаковки замороженного материала в пригодный контейнер. Аналогично, удобный способ получения лиофилизированной заквасочной культуры включает в себя следующие стадии: 1. культивирования бактериального штамма в соответствии с формулой изобретения по настоящему изобретению, 2. сбора размноженных клеток с получением концентрированной бактериальной культуры, 3. замораживания бактериального материала с получением замороженного материала, 4. сублимации воды из замороженного материала и 5. упаковки лиофилизированного материала в пригодный контейнер. Также предусмотрена высушенная распылением/в псевдоожиженном слое заквасочная культура. Замораживание бактериального материала удобно проводить посредством погружения концентрированной культуры в жидкий азот и сбора замороженного материала.

Как описано в WO 2005/003327 A1, предпочтительно добавлять в заквасочную культуру определенные криопротекторы. Таким образом, композиция заквасочной культуры в соответствии с настоящим изобретением может содержать один или несколько криопротекторов, выбранных из группы, состоящей из инозин-5'-монофосфата (IMP), аденозин-5'-монофосфата (AMP), гуанозин-5'-монофосфата (GMP),

уранозин-5'-монофосфата (UMP), цитидин-5'-монофосфата (CMP), аденина, гуанина, урацила, цитозина, аденозина, гуанозина, уридина, цитидина, гипоксантина, ксантина, гипоксантина, оротидина, тимидина, инозина и производного любого из таких соединений.

Это изобретение представлено в форме формулы изобретения

Предпочтительные аспекты и варианты осуществления этого изобретения могут быть представлены, как указано ниже.

1. Способ выделения штамма Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea), содержащего на своей хромосоме мутантный tetW, где указанная мутация придает штамму чувствительность к тетрациклинам и где указанный штамм выделен из устойчивого к тетрациклину бактериального штамма-предшественника, где устойчивый к антибиотику фенотип вызван экспрессией tetW, стабильно встроенного в хромосому, где указанный способ включает в себя воздействие химического мутагена и физического мутагена на клетки.

2. Способ по п.1, где химический мутаген содержит бромид этидия (EtBr) и физический мутаген представляет собой УФ-излучение.

3. Способ по п.1 или 2, где устойчивый к тетрациклину бактериальный штамм-предшественник выбран из группы штаммов, состоящей из штамма Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC5445 (Bb-12®), депонированного 30 сентября 2003 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM15954, и штамма Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC7158, депонированного 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17280.

4. Способ по пп.1-3, где способ включает в себя селекцию чувствительных к тетрациклинам мутантных форм, которые с наибольшей вероятностью содержат мутантный ген tetW, где указанный способ селекции включает в себя стадии:

a) определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) бактерий посредством способа скрининга чувствительности Etest,

b) разделения бактерий на два класса, исходя из результатов скрининга чувствительности Etest:

Класс 1: бактерии с MIC 1,5 мкг/мл или менее в соответствии с Etest и

Класс 2: бактерии с MIC более 1,5 мкг/мл в соответствии с Etest; и

c) идентификации, выращивания и хранения тех чувствительных к антибиотикам бактерий, которые идентифицированы на стадии b) как обладающие MIC 1,5 мкг/мл или менее (Класс 1), в качестве нового чувствительного к антибиотикам штамма.

5. Способ по п.4, где тетрациклины представляют собой тетрациклин.

6. Способ по пп.1-5, где устойчивый к тетрациклину бактериальный штамм-предшественник представляет собой пробиотический штамм.

7. Способ по пп.1-6, где чувствительный к тетрациклину бактериальный штамм представляет собой пробиотический штамм.

8. Способ по пп.1-7, где способ включает в себя стадии:

1) культивирования клеток-предшественников с получением культуры экспоненциально растущих клеток,

2) переноса аликвоты клеток в свежую среду, содержащую бромид этидия (EtBr),

3) переноса культуры в один или несколько контейнеров для образования слоя культуры толщиной 0,5-10 мм,

4) обработки культуры УФ-излучением,

5) культивирования мутантных клеток с получением культуры экспоненциально растущих клеток,

6) переноса аликвоты бактерий в одну или несколько чашек Петри, содержащих пригодную среду для роста на основе агара, где аликвоту бактерий выбирают для получения единичных колоний,

7) выявления тех колоний, которые обладают приобретенной чувствительностью к антибиотику посредством копирования посевов на чашках Петри с антибиотиком и без него, и

8) выделения, выращивания и сохранения тех чувствительных к антибиотику колоний, которые идентифицированы как новый чувствительный к антибиотикам штамм.

9. Способ по п.8, где культуру после стадии 4) подвергают стадии накопления мутаций, содержащей стадии:

4a) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналога пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но к которой устойчивы нерастущие клетки, и

4b) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствие пенициллина или аналога пенициллина, такого как ампициллин.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где культивирование проводят при пониженном давлении кислорода.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где обработка УФ-излучением стадии 4) снижает количество живых клеток, измеренное с помощью колониеобразующих единиц (КОЕ) до менее чем 20% относительно количества КОЕ в культуре непосредственно перед обработкой УФ-излучением.

12. Способ по любому из пп.1-10, где аналог пенициллина представляет собой ампициллин, применяемый в дозе 50-300 микрограмм/мл среды.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где тетрациклины представляют собой антибиотик, выбранный из группы тетрациклина, террамицина, демеклоциклина, меклоциклина, доксициклина/доксициклина, лимециклина, метациклина, миноциклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, ауреомицина и других хлортетрациклинов.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где штамм-предшественник выбран из группы Bifidobacteriacea, содержащей Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis и их подвидов.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где штамм-предшественник представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где минимальная ингибирующая концентрация (MIC) антибиотика для штамма-предшественника по меньшей мере в 10 раз превышает MIC чувствительного к антибиотику штамма.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где минимальная ингибирующая концентрация (MIC) тетрациклина для штамма-предшественника составляет по меньшей мере 10 микрограмм/мл и MIC тетрациклина для чувствительного к антибиотику штамма составляет 1 микрограмм/мл или менее.

18. Штамм Bifidobacterium sp., содержащий мутантный кодируемый хромосомой tetW, придающий штамму чувствительность к тетрациклинам, полученный способом по любому из предшествующих пунктов.

19. Штамм Bifidobacterium по п.18, где тетрациклины представляют собой антибиотик, выбранный из группы тетрациклина, террамицина, демеклоциклина, меклоциклина, доксициклина/доксициклина, лимециклина, метациклина, миноциклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, ауреомицина и других хлортетрациклинов.

20. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18 или 19, где штамм-предшественник выбран из группы Bifidobacteriacea, содержащей Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis и их подвидов.

21. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-20, где штамм-предшественник представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis.

22. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-21, где штамм-предшественник представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC5445 (Bb-12®), депонированный 30 сентября 2003 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM15954.

23. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-22, где штамм-предшественник представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC7158, депонированный 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17280.

24. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-23, где минимальная ингибирующая концентрация антибиотика (MIC) для штамма-предшественника по меньшей мере в 10 раз превышает MIC чувствительного к антибиотику штамма.

25. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-23, где минимальная ингибирующая концентрация (MIC) тетрациклина для штамма-предшественника составляет по меньшей мере 10 микрограмм/мл и MIC чувствительного к антибиотику штамма составляет 1 микрограмм тетрациклина/мл или менее.

26. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-23, отличающийся тем, что он является чувствительным к концентрации тетрациклинов, составляющей 1,0 мкг/мл или менее в соответствии с анализом скрининга чувствительности E-test.

27. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-25, где ген tetW содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы из SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC], SEQ ID NO:6 [GTG GTT TAG TCT] и SEQ ID NO:27 [AC CAG CGT TTT C].

28. Штамм Bifidobacterium по п.27, где ген tetW содержит SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC].

29. Штамм Bifidobacterium по п.27, где ген tetW содержит SEQ ID NO:6 [GTG GTT TAG TCT].

30. Штамм Bifidobacterium по п.27, где ген tetW содержит SEQ ID NO:27 [AC CAG CGT TTT C].

31. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-25, где ген tetW содержит последовательности SEQ ID NO:28 [CG CCC TGC CAC A] и SEQ ID NO:29 [AT ATT GTC ATC A].

32. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.18-25, где ген tetW содержит последовательности SEQ ID NO:30 [TA GAC GAT GGA A], SEQ ID NO:31 [CG GTC CGG GTA A] и SEQ ID NO:32 [CT GAT CCG GCC TT].

33. Штамм Bifidobacterium по п.18, который идентифицирован как штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) и депонирован 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17281.

34. Штамм Bifidobacterium по п.18, который идентифицирован как штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC9070 (DR10Tet-S9X) и депонирован 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17282.

35. Штамм Bifidobacterium, который является чувствительным к тетрациклинам вследствие мутации в tetW, где источником указанного штамма Bifidobacterium является штамм-предшественник, который является устойчивым к тетрациклинам вследствие наличия tetW, расположенного на хромосоме.

36. Штамм Bifidobacterium по п.35, где тетрациклины представляют собой антибиотик, выбранный из группы, состоящей из тетрациклина, террамицина, демеклоциклина, меклоциклина, доксициклина/доксициклина, лимециклина, метациклина, миноциклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, ауреомицина и других хлортетрациклинов.

37. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35 или 36, где штамм-предшественник выбран из группы, состоящей из Bifidobacteriacea, содержащей Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis и их подвиды.

38. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-37, где штамм-предшественник представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis.

39. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-38, где штамм-предшественник представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC5445 (Bb-12®), депонированный 30 сентября 2003 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM15954.

40. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-39, где штамм-предшественник представляет собой штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC7158, депонированный 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17280.

41. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-40, где минимальная ингибирующая концентрация антибиотика (MIC) для штамма-предшественника по меньшей мере в 10 раз превышает MIC чувствительного к антибиотику штамма.

42. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-40, где минимальная ингибирующая концентрация (MIC) тетрациклина для штамма-предшественника составляет по меньшей мере 10 микрограмм/мл и MIC чувствительного к антибиотику штамма составляет 1 микрограмм тетрациклина/мл или менее.

43. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-42 или 72-74, где ген tetW содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы из SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC], SEQ ID NO:6 [GTG GTT TAG TCT] и SEQ ID NO:27 [AC CAG CGT TTT C].

44. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-42 или 72-74, где ген tetW содержит последовательности SEQ ID NO:28 [CG CCC TGC CAC A] и SEQ ID NO:29 [AT ATT GTC ATC A].

45. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-42 или 72-74, где ген tetW содержит последовательности SEQ ID NO:30 [TA GAC GAT GGA A], SEQ ID NO:31 [CG GTC CGG GTA A] и SEQ ID NO:32 [CT GAT CCG GCC TT].

46. Штамм Bifidobacterium по п.43, где ген tetW содержит SEQ ID NO:3 [GGA TAC TGA ACC].

47. Штамм Bifidobacterium по п.43, где ген tetW содержит SEQ ID NO:6 [GTG GTT TAG TCT].

48. Штамм Bifidobacterium по п.43, где ген tetW содержит SEQ ID NO:27 [AC CAG CGT TTT C].

49. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-46 или 72-74, который идентифицирован как штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) и депонирован 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17281.

50. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-45, 47 или 72-74, который идентифицирован как штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC9070 (DR10Tet-S9X) и депонирован 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen под регистрационным номером DSM17282.

51. Применение штамма Bifidobacterium по любому из пп.18-50 для изготовления употребляемого внутрь материала или бактериальной культуры.

52. Применение по п.51, где бактериальную культуру подвергают дополнительной обработке.

53. Применение по п.51, где употребляемый внутрь материал представляет собой ферментированный продукт питания или корм.

54. Применение по п.53, где ферментированный продукт питания или корм подвергают дополнительной обработке.

55. Применение по п.51, где употребляемый внутрь материал содержит Bifidobacteria в количестве от приблизительно 10⁵ кое/г до приблизительно 10¹² кое/г употребляемого внутрь материала.

56. Применение по любому из пп.51-55, где употребляемый внутрь материал представляет собой композицию, выбранную из группы, состоящей из молока, творога, продуктов брожения молока, сквашенного молока, йогурта, замороженного йогурта, молочного порошка, порошков на основе молока, концентрата молока, сыра, плавленого сыра, соусов, напитков, мороженого, ферментированных продуктов на основе злаковых, молочной смеси для младенцев и соевого молока.

57. Применение по любому из пп.51-56, где употребляемый внутрь материал применяют для изготовления композиции для лечения и/или профилактики заболевания, синдрома или состояния, или для улучшения переваривания пищевых добавок, или для улучшения общего состояния здоровья человека или позвоночного животного.

58. Применение по любому из пп.51-57, где употребляемый внутрь материал используют в качестве пробиотического.

59. Применение по п.51 или 58, где употребляемый внутрь материал представляет собой композицию, выбранную из группы, состоящей из молока, творога, продуктов брожения молока, сквашенного молока, йогурта, замороженного йогурта, молочного порошка, порошков на основе молока, концентрата молока, сыра, плавленого сыра, соусов, напитков, мороженого, ферментированных продуктов на основе злаковых, молочной смеси для младенцев, таблеток, капсул, жидких бактериальных суспензий, сухой пероральной добавки, жидкой пероральной добавки, сухого продукта для питания через зонд или жидкого продукта для питания через зонд.

60. Применение по п.51, где указанное заболевание, синдром или состояние выбирают из группы, состоящей из ассоциированных с антибиотиками нарушений, гастроэнтерита, диареи, включая диарею путешественников и острую младенческую диарею, непереносимости лактозы, желудочно-кишечных инфекций и колонизации желудочно-кишечного тракта патогенными бактериями, включая Helicobacter pylori и Clostridium difficile, синдрома раздраженной кишки (IBS), воспалительного заболевания кишечника (IBD), рака толстой кишки, урогенитальных инфекций и опухолей, вагинальных инфекций, аллергии (особенно атопической экземы), вакцинации, холестеринемии и гипертензии.

61. Применение по любому из пп.57-60, где употребляемый внутрь материал является пригодным для профилактики или лечения инфекции патогенами.

62. Продукт питания или корм, содержащий бактериальный штамм по любому из пп.18-50.

63. Применение штамма Bifidobacterium по любому из пп.18-50 для изготовления заквасочной культуры.

64. Применение по п.63, где заквасочная культура является замороженной.

65. Применение по п.63, где заквасочная культура является лиофилизированной.

66. Применение по п.63, где заквасочная культура является высушенной распылением/в псевдоожиженном слое.

67. Композиция заквасочной культуры, содержащая бактерию по любому из пп.18-50, предпочтительно где композиция заквасочной культуры обладает концентрацией живых клеток, находящейся в диапазоне 10⁴-10¹² кое на грамм композиции.

68. Композиция заквасочной культуры по п.67, которая дополнительно содержит один или несколько криопротектор(ов), выбранных из группы, состоящей из инозин-5'-монофосфата (IMP), аденозин-5'-монофосфата (AMP), гуанозин-5'-монофосфата (GMP),

уранозин-5'-монофосфата (UMP), цитидин-5'-монофосфата (CMP), аденина, гуанина, урацила, цитозина, аденозина, гуанозина, уридина, цитидина, гипоксантина, ксантина, оротидина, тимидина, инозина и производного любого из таких соединений.

69. Способ получения замороженной заквасочной культуры, включающий в себя следующие стадии:

1. культивирования бактериального штамма по пп.18-50,

2. сбора размноженных клеток с получением концентрированной бактериальной культуры,

3. замораживания бактериального материала с получением замороженного материала и

4. упаковки лиофилизированного материала в пригодный контейнер.

70. Способ получения лиофилизированной заквасочной культуры, включающий в себя следующие стадии:

1. культивирования бактериального штамма по пп.18-50,

2. сбора размноженных клеток с получением концентрированной бактериальной культуры,

3. замораживания бактериального материала с получением замороженного материала,

4. сублимации воды из замороженного материала, и

5. упаковки лиофилизированного материала в пригодный контейнер.

71. Способ по п.69 или 70, где стадию проводят посредством погружения концентрированной культуры в жидкий азот и сбора замороженного материала.

72. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-42, где ген tetW содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы [ATACTGAA], [GGTTTAGT] и [CAGCGTTT].

73. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-42, где ген tetW содержит последовательности [CCCTGCCA] и [ATTGTCAT].

74. Штамм Bifidobacterium по любому из пп.35-42, где ген tetW содержит последовательности [GACGATGG], [GTCCGGGT] и [GATCCGGC].

Это изобретение проиллюстрировано в следующих ниже неограничивающих примерах и таблицах, где таблица 1 представляет собой описание олигонуклеотидов, используемых для ПЦР-анализов и секвенирования ДНК гена устойчивости к тетрациклину tetW в Bb-12® и HN019. Таблица 2 представляет собой последовательность ДНК tetW и расположенного выше гена транспозазы, tps, из Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12® (SEQ ID 22). Представлена нуклеотидная последовательность гена tetW и фланкирующего участка из Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12®.

Последовательность получали секвенированием в Chr. Hansen A/S. Выше расположена кодирующая транспозазу открытая рамка считывания, nt. # 4-966, с аминокислотами, представленными под последовательностью ДНК (ММ приблизительно 35 кДа). Последовательность nt. # 1318-3234 представляет собой кодирующий устойчивость к тетрациклину ген, tetW, с аминокислотной последовательностью, указанной под последовательностью ДНК (ММ приблизительно 70 кДа).

Мутация "amber" в положении нуклеотида (nt) # 1741 (nt # 424 относительно инициирующего кодона tetW) для чувствительного к тетрациклину штамма DR10Tet-S9X (CHCC9070) указана над последовательностью ДНК. Мутация со сдвигом рамки считывания в положении nt # 2722 (nt #1405 относительно инициирующего кодона) для чувствительного к тетрациклину штамма Bb12Tet-S139 (CHCC8902) указана над последовательностью ДНК.

*): обозначает стоп-кодон.

Таблица 8-1: Список контрольных штаммов, используемых для подтверждения специфичного выявления Bb-12Tet-S139.

Таблица 9-1: Условия для тестирования стабильности лиофилизированных культур.

Таблица 9-2: Выживаемость лиофилизированных культур (%).

Таблица 10-1. Выживаемость в искусственном желудочном соке (%). Средняя для трех экспериментов.

Таблица 11-1. Устойчивость в желчных кислотах. Бактериальный рост на чашках с агаром MRS-цистеин-HCl, дополненных 2% мас./об. желчными солями.

Таблица 12-1. Минимальные ингибиторные концентрации (MIC) тетрациклина для пробиотических штаммов Bifidobacterium animalis подвида lactis и двух его производных.

Таблица 13-1. Минимальные ингибиторные концентрации (MIC) тетрациклина для Bb-12 и его 3 новых производных.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Инактивация гена tetW в двух пробиотических штаммах Bifidobacterium animalis подвида lactis, проявляющих устойчивость к тетрациклину

Для инактивации природной устойчивости к тетрациклину в геноме штамма Bb-12® и штамма HN019 (DR10™) Bifidobacerium animalis ssp. lactis использовали мощный двойной мутагенный подход. Он включал в себя обработку клеток мутагеном, бромидом этидия (EtBr), с последующим облучением ультрафиолетом на более мощном уровне, чем в норме, когда мутагены используют по отдельности.

Штаммы и условия культивирования

Штаммы Bb-12® и HN019 (DR10™) Bifidobacterium animalis подвида lactis получали из коллекции культур Chr. Hansen A/S, Horsholm, Denmark. Штамм Bb-12® B. animalis subsp. lactis имеет регистрационный номер CHCC5445 в коллекции культур Hansen и депонирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) под регистрационным номером DSM15954. Штамм HN019 (DR10™) B. animalis subsp. lactis был выделен из коммерчески доступного продукта молочной смеси, обозначаемого как Fernleaf DR-10 bifidus и приобретенного на Тайване в 2000 году. Он обладает регистрационным номером CHCC7158 в коллекции культур Hansen и депонирован в DSMZ под регистрационным номером DSM17280.

Два штамма, которые являются устойчивыми к тетрациклину (по меньшей мере 15 мкг/мл, как определено посредством способа E-test, Danielsen and Wind, 2003), выращивали общепринятыми способами в анаэробных условиях при 37°C в бульоне Difco-MRS (deMan 1960), дополненном 0,05% гидрохлоридом цистеина (Цистеин-HCl, Merck chemicals), а также на агаре MRS (1,5% агар) с такой же концентрацией цистеин-HCl и 15 мкг тетрациклина на мл.

Мутагенная обработка Bb-12

Аликвоту (2%) Bb-12®, выращиваемого в течение ночи (на) в MRS, переносили в свежий бульон MRS (10 мл без тетрациклина), содержащий бромид этидия (EtBr), 20 мкг/мл, и инкубировали до оптической плотности [OD] при 600 нм, равной 0,35. Затем экспоненциально растущие клетки подвергали облучению ультрафиолетом (УФ-поперечносшивающий агент, Stratagene) в открытой чашке Петри в течение 5 мин (70 мДж/см²). УФ-обработку повторяли один раз после интервала в темноте в течение 5 мин при комнатной температуре. Обработку подбирали таким образом, чтобы обеспечить приблизительно 90% летальность. Летальность оценивали следующим образом: жизнеспособность клеток непосредственно после обработок EtBr-УФ определяли посредством выращивания клеток на агаре MRS без тетрациклина и летальность вычисляли по наблюдаемым КОЕ. Затем один мл подвергнутой мутагенезу культуры переносили в 9 мл свежего MRS без добавления EtBr, а затем позволяли расти в течение 16 часов при 37°C в полной темноте, а затем аликвоты обработанных клеток повторно высевали (1% [об./об.]) в свежий бульон MRS и позволяли расти в течение дополнительных 16 часов.

Пример 2: Селекция чувствительных к тетрациклину вариантов двух пробиотических штаммов Bifidobacterium animalis подвида lactis

Способ скрининга

Скрининг на чувствительные к тетрациклину изоляты проводили после проведения процесса накопления с ампициллином (Miller, 1972), адаптированного для Bifidobacteriae. В кратком изложении, процесс накопления с ампициллином проводили посредством переноса аликвоты (1%) выращенной подвергнутой мутагенезу культуры в свежую среду MRS (10 мл) и выращивания клеток до OD₆₀₀, равной 0,2, без добавления тетрациклина. 0,5 мл этой культуры использовали для посева в 10 мл бульона MRS, содержащего 10 микрограмм тетрациклина/мл, и инкубировали в течение 2 часов при 37°C при пониженном давлении кислорода, после чего добавляли ампициллин до конечной концентрации 150 микрограмм/мл и культуру непрерывно инкубировали в течение 16 часов при 37°C. Поскольку ампициллин вызывает гибель только растущих клеток (т.е. клеток Tet^R) и не вызывает гибели неделящихся клеток (т.е. мутантных клеток Tet^s), добавление ампициллина можно рассматривать как стадию накопления для последующего выделения мутантных форм Tet^s. Клетки собирали центрифугированием (4000×g в течение 5 мин при 4°C) и дважды промывали свежим бульоном.

После накопления с ампициллином проводили скрининг на чувствительные к тетрациклину изоляты посредством выращивания аликвот клеток после промывания на агаре MRS в соответствующем разведении для получения приблизительно 150 колоний на чашку после инкубации при 37°C в течение 20 часов.

Чувствительные к тетрациклину колонии идентифицировали посредством получения копированных посевов на агаре MRS без антибиотиков и на агаре MRS, содержащем 10 мкг тетрациклина на мл, на котором чувствительные к тетрациклину изоляты не способны расти. В конце чувствительные к тетрациклину колонии культивировали в бульоне MRS. Для тщательной характеристики выделяли общую геномную ДНК как из чувствительных к тетрациклину клонов, так и из устойчивого к тетрациклину штамма. Результатом скрининга копированных посевов были 155 чувствительных к тетрациклину изолятов из CHCC5445 среди всего приблизительно 4000 подвергнутых скринингу колоний. Из CHCC7158 было выделено 43 чувствительные к тетрациклину колонии среди приблизительно 1000 клеток. Все эти колонии затем тестировали в жидком бульоне MRS, содержащем тетрациклин (10 мкг/мл). Существенная фракция ложноположительных колоний (приблизительно 85%) обладала ростом в этих условиях. Остальные чувствительные к тетрациклину изоляты затем подвергали скринингу чувствительности E-test для определения их порога чувствительности к тетрациклину.

E-test проводили в соответствии со способом изготовителя (AB BIODISK, Sweden), несколько модифицированного M. Danielsen and A. Wind (2003). В кратком изложении, определение значения минимальной ингибиторной концентрации (MIC) для отдельных изолятов проводили посредством погружения стерильного хлопкового тампона в ночную культуру чувствительного к тетрациклину подлежащего тестированию штамма и проведения штрихового посева на всей поверхности чашки с агаром MRS (диаметр: 8,5 см) равномерно по трем направлениям. После высыхания нанесенной посевной культуры с помощью ручного аппликатора со шкалой MIC, обращенной кверху, на поверхность агара наносили полоски для Etest. Планшеты засевали в анаэробных условиях в течение ночи в перевернутом положении при 37°C. Значение MIC определяли посредством определения области пересечения края ингибиторного эллипса и полоски. В большинстве случаев оно варьирует между 2 и 4 мкг/мл. Только для двух изолятов, источником одного из которых, получившего название Bb12Tet-S139, является CHCC5445, а источником другого из которых, получившего название DR10Tet-S9X, является CHCC7158, была показана высокая чувствительность к тетрациклину со значением MIC 0,5 мкг/мл.

Пример 3: Молекулярная характеристика чувствительных к тетрациклину производных двух пробиотических штаммов Bifidobacterium animalis подвида lactis

ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК гена tetW

Геномную ДНК получали из Bb-12® дикого типа и двух чувствительных к тетрациклину изолятов посредством применения протокола Easy-DNA для выделения ДНК из грамположительных бактерий в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen).

Характеристику гена tetW чувствительных вариантов проводили посредством ПЦР-анализов в соответствии с протоколом Innis and Gelfand (1990) и для тестирования на возможные мутации в гене проводили секвенирование ДНК. С каждого изолята амплифицировали полную открытую рамку считывания (ORF, приблизительно 2,0 т.п.н.) tetW в виде трех перекрывающихся фрагментов (A, B и C) с тремя наборами праймеров (таблица 1, таблица 2).

Фрагмент A (приблизительно 785 п.о.) амплифицировали с помощью смыслового праймера: tetWx.D1 на основе последовательности, расположенной на 296 п.о. выше инициирующего кодона гена tetW, и антисмыслового праймера: tetWx.R2 на основе ORF tetW. Фрагмент B (приблизительно 935 п.о.) амплифицировали с помощью смыслового праймера: tetWx.D4 и антисмыслового праймера: tetWx.R5 ORF tetW. Фрагмент C (920 п.о.) амплифицировали с помощью смыслового праймера: tetWx.D3 на основе ORF и антисмыслового праймера: tetWx.R4, расположенного на 262 п.о. ниже терминирующего кодона гена tetW.

Амплифицированные фрагменты в трех реакциях ПЦР подвергали агарозному гель-электрофорезу (0,7%) с окрашиванием посредством EtBr и идентифицировали с помощью освещения посредством УФ. Из геля вырезали полосы, соответствующие трем амплифицированным фрагментам гена, и экстрагировали ДНК (набор для экстракции из геля QIAquick от Qiagen). Очищенные продукты ПЦР клонировали в плазмидный вектор, pCR2.1-TOPO (Invitrogen) для определения нуклеотидной последовательности с использованием прямого и обратного праймеров M13.

Секвенирование ДНК гена tetW из каждого отдельного чувствительного к тетрациклину изолята со значениями E-test 2-4 мкг/мл показало, что ген устойчивости к тетрациклину не был поврежденным или мутантным в этих изолятах и был на 100% гомологичным гену tetW Bb-12® дикого типа, представленному в таблице 2.

Секвенирование гена tetW из двух изолятов со значениями E-test для тетрациклина, составляющими 0,5 мкг тетрациклина/мл, показало, что в обоих случаях ген tetW был поврежден. Для Bb12Tet-S139 (производное CHCC5445) был показан сдвиг рамки считывания в положении нуклеотида #2722, где остаток тимидина был удален, как представлено ниже и в таблице 2.

В представленной выше иллюстрации показана часть последовательности гена tetW в CHCC5445. Подчеркнутый остаток тимидина в Bb-12® (nt: 2722 в последовательности tetW) удален в мутантной форме со сдвигом рамки считывания, Bb12Tet-S139, что привело к стоп/нонсенс-кодону "opal" с укороченным на 170 аминокислот продуктом гена tetW дикого типа.

[nt #2722 обладает положением nt номер #1405 в последовательности tetW в таблице 2, SEQ ID 22].

Секвенирование ДНК гена tetW из другого чувствительного к тетрациклину изолята DR10Tet-S9X, производного штамма HN019 (CHCC7158), показало транзицию остатка цитидина на остаток тимидина в положении нуклеотида # 174, которая, таким образом, непосредственно приводит к трансляционному стоп-кодону "amber", как представлено ниже и в таблице 2.

В приведенной выше иллюстрации представлена часть последовательности гена tetW в CHCC7158, которая является идентичной гену tetW в CHCC5445. Подчеркнутый остаток цитидина в HN019 (nt: 1741) заменен в мутантном штамме на остаток тимидина, приводя к стоп/нонсенс-кодону "amber" с укороченным на 498 аминокислот продуктом гена tetW дикого типа.

[nt # 1741 обладает положением nt номер # 424 в последовательности ДНК tetW в таблице 2, SEQ ID 22].

Пример 4: Генетическая стабильность чувствительных к тетрациклину изолятов Bb12Tet-S139 (CHCC8902), DR10Tet-S9X(CHCC9070) и Bb12Tet-S180

Определение скоростей обратных мутаций посредством выращивания клеток на агаре MRS с тетрациклином

Один мл культуры мутантного штамма Bb12Tet-S139 (1,6×10^-9 клеток/мл), выращиваемой в течение ночи, распределяли по 50 мкл на каждую из 20 чашек Петри (диаметр: 13,8 см) с агаром MRS, дополненным тетрациклином (15 мкг/мл). Через 24 часа инкубации в анаэробных условиях при 37°C не было выявлено колоний на чашках, что показывает, что скорость реверсии составляет менее чем 1,6×10^-9.

Аналогичное тестирование стабильности проводили для штамма DR10Tet-S9X. Ночную культуру этого штамма (1,1×10^-9 клеток/мл) аналогичным образом распределяли по 50 мкл на каждую из 20 чашек Петри с агаром MRS, дополненным тетрациклином (15 мкг/мл). После периода инкубации было выявлено 19 устойчивых к тетрациклину колоний. Вычисленная скорость реверсии для мутации "amber" составляла 1,8×10^-8. Вычисленная скорость реверсии для штамма Bb12Tet-S180 составляла 1,7×10^-7.

Пример 5: Физиологическое и фенотипическое тестирование двух чувствительных к тетрациклину штаммов, Bb12Tet-S139 (CHCC8902) и DR10Tet-S9X (CHCC9070)

Условия роста мутантных штаммов в бульоне MRS

Рост Bb12Tet-S139 и DR10Tet-S9X сравнивали (по три образца) с их родительскими штаммами, CHCC5445 и CHCC7158 соответственно, выращенными в аналогичных условиях в бульоне MRS (200 мл с цистеин-HCl) в течение 24 часов. Мониторинг образцов для измерения оптической плотности при 600 нм проводили на протяжении всего периода инкубации. Скорости роста для обоих мутантов были сходными со скоростями для родительских штаммов дикого типа, указывая на то, что мутагенная обработка чувствительных к тетрациклину изолятов, по-видимому, не повреждала гены их ферментативных каскадов.

Скорости закисления двух мутантных по tetW форм

Мониторинг закисления (бульон MRS), т.е. превращения пирувата в молочную кислоту, проводили (по два образца) на протяжении периода времени 6 часов и сравнивали с соответствующими родительскими штаммами, выращенными в аналогичных условиях. Не наблюдалось заметных различий скоростей закисления между мутантными производными CHCC5445 и CHCC7158 и их родительскими штаммами.

Анализ "отпечатков пальцев" ДНК

Пульсирующий гель-электрофорез геномной расщепленной посредством SpeI и XbaI ДНК из двух мутантных штаммов tetW проводили в соответствии со стандартными способами (Hung and Bandziulis, 1990), и в нем не было выявлено какого-либо перераспределения в характере расщепления хромосомы посредством SpeI или XbaI по сравнению с соответствующими штаммами дикого типа. Это прибавляет доказательство в пользу общего изогенного характера мутантных и родительских штаммов.

Пример 6: Анализ (транскриптомный) экспрессии генов в геноме в целом показывает, что экспрессия генов Bb12Tet-S139 не отличается от Bb-12®

Материалы и способы

Разработка и получение полных геномных микроматриц для Bb12

Авторы настоящего изобретения ранее провели секвенирование и создали полные геномные микроматрицы для Bb12® (Garrigues et al. 2005). В кратком изложении, Bb-12® секвенировали посредством стохастических геномных фрагментов с получением 56 контигов. В ходе дальнейшего анализа сборки стало понятно, что только несколько процентов последовательности было пропущено. В геномной последовательности почти из 2,0 млн.п.о. было идентифицировано 1612 предполагаемых CDS (кодирующих последовательностей). Для каждого гена был сконструирован специфичный 65-75-мерный олигонуклеотид, за исключением нескольких генов, таких как очень маленькие предполагаемые гены. Для нескольких генов было сконструировано несколько олигонуклеотидов. В целом, из последовательности было сконструировано 1569 олигонуклеотидов. Кроме того, было сконструировано более 100 контрольных олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды наносили на пластины UltraGAPS (Corning B.V., Schiphol-Rijk, The Netherlands) по четыре повторяющихся копии, как описано ранее (Pedersen et al. 2005).

Образцы РНК собирали в RNAprotect (QIAGEN, Valencia, CA, USA) для стабилизации профиля экспрессии и выделяли тотальную РНК (RNeasy, QIAGEN). 10 мкг РНК копировали в кДНК с использованием набора CyScribe Post-Labelling Kit с 1,65 мкг случайного нонамера в качестве праймера (Amersham Biosciences, Hillerod, Denmark). Условия тестирования обозначали как Cy5 и контрольные условия обозначали как Cy3. Два образца объединяли и половину их гибридизовали с матрицей. Вместо 50% формамида, рекомендованного в протоколе, использовали 60% (эти условия были ранее определены с использованием контрольных олигонуклетоидов). После приблизительно 18 ч гибридизации матрицу промывали (Corning B.V.), сканировали и предварительно анализировали, как описано ранее (Pedersen et al. 2005). Данные матрицы переносили в Acuity 4,0 (Axon Instruments Inc., Union City, CA, USA), где их нормализовали посредством LOWESS. Для всех идентифицированных пятен создавали набор данных. Данные для олигонуклеотидов, где было идентифицировано только 0, 1 или 2 из 4 повторяющихся пятен, удаляли. Аналогично, удаляли данные для олигонулеотидов, где стандартное отклонение между нормализованными log2(соотношения) составляло >0,5.

Результаты

Экспрессию генов Bb12Tet-139S сравнивали с экспрессией генов Bb12 с использованием полных геномных микроматриц. Стационарные культуры обоих штаммов высевали в концентрации 1% (OD₆₀₀=0,06) в свежую MRS+0,05% цистеин-HCl,

предварительно нагретую до 37°C. Затем каждые 30 минут измеряли OD₆₀₀. В диапазоне OD 0,1-1,0 AU (единицы поглощения) рост был экспоненциальным. Удельная скорость роста, µ, составляла 0,50 ч^-1 (R2=0,9977) и 0,51 ч^-1 (R2=0,9953) для Bb-12® и Bb12Tet-S139 соответственно. Таким образом, нет значимых различий между скоростями роста двух штаммов. Из образцов РНК при OD=1,0 AU (через шесть с половиной часов роста) изготавливали микроматрицы. Bb12Tet-S139 и Bb-12® представляли собой условия тестирования и контроля соответственно. Среди 1569 генов, представленных на микроматрице значимых регуляторных генов, данные были получены для 1271 генов.

Исходя из эмпирических данных, экспрессию гена часто считают дифференциальной в случае >2-кратной положительной или отрицательной регуляции при двух условиях (см., например, Pedersen et al. 2005). Ни один из 1271 генов в наборе данных не экспрессировался с более чем >2-кратным отличием. Для сравнения, при воздействии на Bb12 0,1% желчной соли положительная и отрицательная регуляция для 86 и 123 генов была >2-кратной, соответственно (Garrigues et al. 2005). Среди этих генов положительная и отрицательная регуляция 17 и 27 была даже >4-кратной, соответственно. Это показывает, что при нарушении метаболизма клетки могут происходить значительные изменения в отношении экспрессии гена. Аналогично, при добавлении к среде 1% фруктоолигосахарида (FOS) только 2 гена экспрессировались с >2-кратным отличием. Эти 2 гена кодируют белки, вовлеченные в утилизацию FOS, и их положительная регуляция была 5-кратной (Garrigues et al. 2005). Этот последний эксперимент показывает, что можно воспроизводить условия роста и что можно идентифицировать факторы, нарушающие конкретные части метаболизма. Суммируя приведенные выше результаты, понятно, что в отношении экспрессии генов и общего физиологического состояния не было выявлено отрицательных эффектов в Bb12Tet-S139 по сравнению с Bb-12®. Исходя из этого, можно предположить, что Bb12Tet-S139 обладает таким же поведением, как и Bb-12®, за исключением чувствительности к тетрациклину.

Пример 7: Количественное специфичное в отношении мутантной формы выявление Bb-12Tet-S139

В целях получения способа количественного определения BB-12TET-S139 разработали анализ ПЦР с детекцией в реальном времени с зондом с двойной меткой. Мишенью для этого анализа является ген tetW, более конкретно, зонд с двойной меткой нацелен на область делеции.

Праймеры и зонд

Праймеры были сконструированы с помощью находящейся в свободном доступе программы "Primer 3" (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Зонд разрабатывали вручную. Производные LNA (замкнутой нуклеиновой кислоты, запатентованная технология, принадлежащая Exiqon, Vedbaek, Denmark) встраивали в зонд в целях возможности укорочения зонда и, таким образом достижения более высокой специфичности. Температуру отжига, вторичную структуру и гибридизацию праймера/зонда оценивали с помощью программ Exiqon (http://Inatools.com). Праймеры получали от TAGC, Copenhagen, DK, зонд с двойной меткой получали от Exiqon, Vedbaek, DK.

Реакция ПЦР с детекцией в реальном времени

Реакцию ПЦР проводили в ABI 7500 (Applied Biosystems) в стандартных условиях: денатурация в течение 15 сек при 95°C, отжиг в течение 1 мин и элонгация при 60°C в течение 40 циклов. Использовали следующие реагенты: TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x-концентрированный), прямой праймер и обратный праймер в концентрации 300 нМ, зонд в концентрации 200 нМ. Объем реакции составлял 25 мкл.

Результаты

Разработка анализа

В результате разработки анализа получили следующие праймеры и зонд: прямой праймер 5'-CAA TAC AAG AGC CGG GTT TC, обратный праймер 5'-GTG CTG ACC GGA CTG TAA TAA A-3', зонд 5'-FAM-AtActgaaccA-TAMRA-3' (FAM=Карбоксифлуоресцеин; TAMRA=Карбокситетраметилродамин). Строчными буквами в последовательности зонда показаны LNA-производные. Размер продукта амплификации составляет 160 п.о.

Экстракция ДНК

ДНК экстрагировали из чистых культур грамположительных бактерий с помощью набора DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Germany) в соответствии с инструкциями изготовителя. ДНК экстрагировали из образцов экскрементов с помощью набора для экстракции ДНК QIAamp Stool (Qiagen, Germany) в соответствии с инструкциями для выявления патогена, как описано изготовителем.

Тестирование специфичности

Специфичность анализа тестировали против дикого типа, некоторых контрольных штаммов Bifidobacterium (см. таблицу 8-1) и ДНК из экскрементов мыши и человека.

Анализ был полностью специфичным в отношении BB-12TET-S139, и не было выявлено амплификации выше порогового уровня для образца дикого типа или любого другого образца Bifidobacterium.

Таблица 8-1
Перечень контрольных штаммов, используемых для подтверждения специфичной детекции Bb-12Tet-S139    

Заключение

Таким образом, этот анализ можно использовать для идентификации штамма BB-12TET-S139 Bifidobacterium animalis ssp. lactis.

Пример 8: Получение и стабильность лиофилизированных культур

Проводили исследование способности изготовленных лиофилизированных штаммов выживать при 30°C в течение 3 недель при 2 различных уровнях кислорода и влажности.

Материалы

Bb-12® (DSM15954), 2 лиофилизированных массы и одна смесь, Bb-12Tet-S139 (DSM17281), 2 лиофилизированных массы и одна смесь. Для этого исследования использовали всего 6 образцов. Лиофилизированные массы получали в соответствии со стандартным способом. Смеси представляют собой измельченную лиофилизированную массу, смешанную с декстрозой с водной активностью менее 0,15.

Способы

Каждый образец разделяли на 3 части, которые обрабатывали, как указано в таблице 9-1, в течение 3 недель.

Таблица 9-1
Условия для тестирования стабильности
лиофилизированных культур   Контроль Обработка 1 Обработка 2 Температура -50±5°C +30±2°C +30±2°C Условия в течение периода тестирования Хранение в герметичном alu-bag Хранение в герметичном alu-bag Хранение в открытом контейнере в климатической камере с rH приблизительно 15%

После периода тестирования во всех образцах дважды проводили анализ КОЕ/г.

КОЕ/г

Известное количество образца гомогенизируют с помощью разбавителя и приготавливают десятикратные разведения. Соответствующие разведения смешивают с агаром MRS от OXOID, с добавлением 0,05% цистеин-гидрохлорида, а затем инкубируют в течение 3 суток при 37°C в анаэробной камере с использованием AnaerGen™ от OXOID. Для каждого подсчета используют по меньшей мере 4 чашки Петри с количеством колоний от 30 до 300.

Выживаемость

Выживаемость вычисляют следующим образом.

Выживаемость %: (Log КОЕ/г в образце после обработки × 100)/(Log КОЕ/г в контрольном образце).

Результаты

Результаты представлены в таблице 9-2 ниже.

Таблица 9-2
Выживаемость лиофилизированных культур (%)   Обработка 1 Обработка 2   Bb-12Tet-S 139 Bb-12® Bb-12Tet-S 139 Bb-12® Лиофилизированная масса         1   99%   - 2 100%   99%   3   100%   98% 4 99%   98%   Смеси         А   100%   97% В 99%   97%  

Заключение

Не существует различий между Bb-12® и Bb-12Tet-S139 в отношении их выживаемости в течение 3 недель при +30°C или их выживаемости в герметичных alu-bag при +30°C и rH приблизительно 15%. Это имеет место как для очищенных лиофилизированных культур, так и для культур, смешанных с экспципиентами (смесей).

Пример 9: Выживаемость в искусственном желудочном соке

Выживаемость пробиотической бактерии в желудочно-кишечном тракте человека считают важным фактором ее пробиотической функциональности.

Штамм Bb-12® Bifidobacterium animalis subsp. lactis обладает превосходной переносимостью желудочного сока и желчной соли. Тест in vitro, используемый для определения переносимости кислот, основан на определения выживания бактерий после воздействия на них искусственного желудочного сока.

Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12Tet-S139, культивированные в анаэробных условиях в течение ночи в MRS (Difco) при 37°C, тестировали на переносимость искусственного желудочного сока по сравнению с BB-12.

Желудочный сок получали посредством смешивания 2,0 г хлорида натрия (Merck 1.06404.1000) и 3,2 г порошка пепсина (Sigma P-7000) в воде. Затем добавляли 80 мл 1 М хлористоводородной кислоты и с помощью H₂O смесь разбавляли до 1000 мл. Конечное доведение до pH 2 проводили посредством 5 М NaOH. Ночную бактериальную культуру промывали три раза с помощью разбавителя, представляющего собой 0,9% физиологический раствор, дополненный 1,5% триптоном при pH 7, а затем добавляли к желудочному соку с последующим забором образцов через различные промежутки времени.

Уровень выживаемости клеток из каждого образца оценивали посредством выращивания клеток на агаре MRS, дополненном 0,05% цистеин-HCl, и определения количества колониеобразующих единиц (кое). Клетки подвергали воздействию желудочного сока (pH 2) при 37°C вплоть до 90 мин. Набор данных (см. таблицу 10-1) анализировали посредством U-теста Манна-Уитни.

Заключение

Между BB-12® и Bb-12Tet-S139 не было выявлено значимых различий в отношении переносимости желудочного сока.

Пример 10: Переносимость желчных кислот

Выживаемость любой потенциальной пробиотической бактерии в желудочно-кишечном тракте человека считают важной для ее пробиотической функциональности. Штамм Bb-12® Bifidobacterium animalis subsp. lactis обладает превосходной переносимостью желчной соли.

В данном эксперименте, штамм Bb-12Tet-S139 Bifidobacterium animalis subsp. lactis тестировали на его устойчивость к бычьим и свиным желчным экстрактам по сравнению с Bb-12®.

Устойчивость к желчи оценивали посредством выращивания клеток на чашках с агаром, дополненным желчной солью в различных концентрациях, по существу как описано Noriega L. et. al., Int. J. Food Microbiol 94, 79-86, 2004. Определение минимальной ингибиторной концентрации (MIC) для обоих штаммов проводили на чашках с агаром MRS-Цистеин-HCl, дополненных двукратными серийными разведениями бычьей желчи (Sigma B3883) и свиного желчного экстракта (Sigma B8631)

в концентрациях от 2% до 0,062% масс./об.

Результаты

Было показано, что оба штамма обладают переносимостью желчной соли в концентрации вплоть до по меньшей мере 2%.

Для каждого случая проводили по три эксперимента. Результаты представлены в таблице 11-1.

Таблица 11-1
Переносимость желчных кислот.
Бактериальный рост на чашках с агаром MRS-Цистеин-HCl, дополненным 2% мас./об. желчными солями   Бычья желчь Свиной желчный экстракт Bb-12® (A) + + Bb-12® (B) + + Bb-12® (C) + +       Bb-12Tet-S139 (A) + + Bb-12Tet-S139 (B) + + Bb-12Tet-S139 (C) + + + указывает на отчетливый бактериальный рост на всех чашках с агаром

Заключение

Как Bb-12®, так и Bb-12Tet-S139 являются устойчивыми по меньшей мере к 2% желчным кислотам, обладая минимальной ингибиторной концентрацией, превышающей 2% для обоих штаммов. Переносимость желчных кислот является показателем адаптации к условиям в желудочно-кишечном тракте.

Пример 11: Три новых чувствительных к тетрациклину производных двух пробиотических штаммов Bifidobacterium animalis подвида lactis - их выделение и молекулярная охарактеризация

Три новых производных культивировали, подвергали мутагенезу, отбирали и охарактеризовывали, как описано в примерах 1, 2 и 3.

Bb-12Tet-S79 и Bb-12Tet-S180 представляют собой производные Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12®. DR10Tet-S33 представляет собой производное HN019 (DR10™).

Bb-12Tet-S180

Секвенирование ДНК гена tetW из чувствительного к тетрациклину изолята Bb-12Tet-S180, производного Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® (CHCC5445), показало наличие трансверсии остатка аденина на остаток цитидина в нуклеотидном положении # 2731 в таблице 2 (SEQ ID 22), приводящей к аминокислотной замене серина на аргинин, как указано ниже.

Указанная выше последовательность представляет собой часть аминокислотной последовательности гена tetW, находящегося в CHCC5445. Подчеркнутый остаток аденина в CHCC5445 (nt: 2731) замещен остатком цитидина в мутантном штамме, что приводит к аминокислотной замене на 168 аминокислот выше трансляционного стоп-кодона.

Множественные мутантные формы DR10tet-S33 и Bb-12Tet-S79

Секвенирование ДНК гена tetW из чувствительных к тетрациклину изолятов DR10Tet-S33 и Bb-12Tet-S79 показало наличие двух и трех нуклеотидных замен соответственно, каждая из которых приводит к аминокислотной замене в продукте гена tetW, как описано ниже.

DR10tet-S33

nt # 1546[G] на 1546[T] в триплете G GC на T GC приводит к аминокислотной замене глицина на цистеин.

nt # 1774[A] на 1774[G] в триплете A TC на G TC приводит к аминокислотной замене изолейцина на валин. См. таблицу 2 (SEQ ID 22).

Bb-12Tet-S79

nt # 1358[C] на 1358[A] в триплете G C T на G A T приводит к аминокислотной замене аланина на аспарагиновую кислоту.

nt # 3023[A] на 3023[G] в триплете C A G на C G G приводит к аминокислотной замене глутамина на аргинин.

nt # 3095[T] на 3095[C] в триплете C T G на C C G приводит к аминокислотной замене лейцина на пролин. См. таблицу 2 (SEQ ID 22).

Чувствительность

Чувствительные к tet изоляты подвергали скринингу чувствительности E-test в соответствии со способами, описанными M. Danielsen and A. Wind (2003), для определения их порога чувствительности к тетрациклину. Результат приведен в таблице 12-1 ниже.

Таблица 12-1
Минимальные ингибиторные концентрации (MIC) тетрациклина в пробиотических штаммах Bifidobacterium animalis подвида lactis и двух его производных Тип Штамм Чувствительность к tet в соответствии с E-test (значение MIC) Родительский штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® ≥16 мкг/мл Мутантный штамм Bb-12Tet-S79 ≤1,0 мкг/мл Мутантный штамм Bb-12Tet-S139 ≤1,0 мкг/мл Мутантный штамм Bb-12Tet-S180 ≤1,0 мкг/мл Родительский штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis HN019 (DR10™) ≥16 мкг/мл Мутантный штамм DR10Tet-S9X ≤1,0 мкг/мл Мутантный штамм DR10Tet-S33 ≤1,0 мкг/мл

Пример 12: Классификация чувствительных к тетрациклину вариантов двух пробиотических штаммов Bifidobacterium animalis подвида lactis

Как указано в примере 2, приблизительно 85% предполагаемых "чувствительных к тетрациклину" изолятов росли в условиях, включающих в себя жидкий бульон MRS, содержащий тетрациклин (10 мкг/мл). Остальные 15% чувствительных к тетрациклину изолятов затем подвергали скринингу чувствительности E-test в соответствии со способами M. Danielsen and A. Wind (2003), для определения их порога чувствительности к тетрациклину.

Главным образом, с помощью E-test было выявлено два класса чувствительных к тетрациклину мутантных форм:

Класс 1: рост при концентрации тетрациклина 1,5 мкг/мл или менее в соответствии с E-test и

Класс 2: рост при концентрации тетрациклина > 1,5 мкг/мл.

Ген tetW анализировали в репрезентативном количестве чувствительных к тетрациклину мутантных форм класса 1 и класса 2.

Результаты:

Класс 1: рост при концентрации тетрациклина ≤ 1,5 мкг/мл; являются чувствительными к тетрациклину мутантными формами, которые характеризуются делециями нуклеотидов (nt) или заменами nt, некоторые из которых приводят к внесению стоп-кодонов в открытую рамку считывания гена tetW, и

Класс 2: рост при концентрации тетрациклина > 1,5 мкг/мл; нет мутаций в tetW. Этот класс мутаций, наиболее вероятно, вызван мутациями в клеточных стенке или транспортных белках.

Заключение

До настоящего времени, все мутации которые характеризуются значением E-test ≤ 1,5 мкг tet/мл, включают в себя мутантный tetW. Это дает возможность проведения процесса селекции, который обеспечивает селекцию чувствительных к тетрациклину Bifidobacteria, которые с высокой вероятностью содержат инактивированный ген tetW.

Пример 13: Три дополнительных чувствительных к тетрациклину производных пробиотического штамма Bifidobacterium animalis подвида lactis - их выделение и молекулярная характеристика.

Три новых производных культивировали, подвергали мутагенезу, отбирали и охарактеризовывали, как описано в примерах 1, 2 и 3.

Bb-12tetW-S73, Bb-12tetW-S14 и Bb-12tetW-S4 представляют собой производные Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12®.

Bb-12tetW-S73

Секвенирование ДНК гена tetW из чувствительного к тетрациклину изолята Bb-12tetW-S73, производного Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® (CHCC5445), показало замену остатка тимина на остаток гуанина в нуклеотидном положении # 1573 в таблице 2 (SEQ ID 22) (TAC > GAC), приводящую к аминокислотной замене тирозина на аспарагиновую кислоту.

Bb-12tetW-S14

Секвенирование ДНК гена tetW из чувствительного к тетрациклину изолята Bb-12tetW-S14, производного Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® (CHCC5445), показало замену остатка тимина на остаток цитозина в нуклеотидном положении # 2869 в таблице 2 (SEQ ID 22) (TCA CCA), приводящую к аминокислотной замене серина на пролин.

Bb-12tetW-S4

Секвенирование ДНК гена tetW из чувствительного к тетрациклину изолята Bb-12tetW-S4, производного Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® (CHCC5445), показало замену остатка аденина на остаток гуанина в нуклеотидном положении # 3176 в таблице 2 (SEQ ID 22) (CAG CGG), приводящую к аминокислотной замене глутамина на аргинин.

Чувствительность

Чувствительные к tet изоляты подвергали скринингу чувствительности E-test в соответствии со способами, описанными M. Danielsen and A. Wind (2003), для определения их порога чувствительности к тетрациклину. Результаты приведены в таблице 13-1 ниже.

Таблица 13-1
Минимальные ингибиторные концентрации (MIC) тетрациклина для Bb-12 и 3 новых его производных Тип Штамм Чувствительность к tet в соответствии с E-test (значение MIC) Родительский штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® ≥16 мкг/мл Мутантный штамм Bb-12tetW-S73 ≤1,0 мкг/мл Мутантный штамм Bb-12tetW-S14 ≤1,0 мкг/мл Мутантный штамм Bb-12tetW-S4 ≤1,0 мкг/мл

ССЫЛКИ

ОТНОСИТЕЛЬНО ДЕПОНИРОВАННЫХ МИКРОБИАЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ

[РЕШЕНИЕ ЭКСПЕРТИЗЫ]

Для всех депонированных микробиальных организмов, упомянутых в настоящей патентной заявке, принимается следующее.

В отношении тех указаний, которые приведены в европейском патенте, образец депонированного микроорганизма станет доступным не позже даты публикации указания о выдаче европейского патента, или не позже даты его отклонения или отзыва, или даты, когда его считают отозванным, посредством предоставления образца эксперту, назначенному ходатайствующим лицом, в случае согласия i) заявителя и/или ii) европейского патентным ведомством в зависимости от обращения. (правило 28 (4) и 28 (5) epc).

УКАЗАНИЯ, КАСАЮЩИЕСЯ ДЕПОНИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

(Правило PCT 12bis)

Дополнительный лист

В дополнение к микроорганизму, указанному на странице 16 описания, следующие микроорганизмы были депонированы в

DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GmbH

Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany

с датами и под регистрационными номерами, как указано ниже:

Регистрационный номер Дата депонирования Страница описания № Строка описания № DSM 17281 17 мая 2005 22 32 DSM 17282 17 мая 2005 23 13 DSM 15954 13 октября 2003 30 20

Для всех из указанных выше депонированных микроорганизмов, прилагаются следующие дополнительные указания:

В отношении соответствующих патентных ведомств соответствующих указанных государств, заявитель ходатайствует, чтобы образцы депонированных микроорганизмов, указанные выше, были доступны только эксперту, назначенному ходатайствующим лицом не позже даты подачи патента или даты отклонения или отзыва, или даты, когда его считают отозванным.

Таблица 1
Олигонуклеотиды, используемые для ПЦР-анализа и секвенирования ДНК кодирующего устойчивость к тетрациклину гена tetW в Bb-12     ^*Нумерация основана на последовательности ДНК, представленной в таблице 2. Приставка "D" указывает на прямой праймер, полученный на основе смысловой цепи. Приставка "R" указывает на обратный праймер, комплементарный смысловой цепи.  

Таблица 2
Последовательность ДНК tetW,
фланкируемая расположенным выше геном транспозазы, tps,
из Bifidobacterium animalis Bb-12 (SEQ ID 22)    

 

 

 

 

  Нуклеотидная последовательность неактивного транспозона TetW из Bifidobacterium animalis subsp. Lactis Bb-12®. Последовательность получали секвенированием в Chr. Hansen A/S. Выше расположена кодирующая транспозазу открытая рамка считывания, nt. # 4-966, с аминокислотами, изображенными под последовательностью ДНК (ММ приблизительно 35 кДа). Последовательность nt. # 1318-3234 представляет собой кодирующий устойчивость к тетрациклину ген, tetW, с аминокислотной последовательностью, представленной под последовательностью ДНК. (ММ приблизительно 70 кДа).
Мутация "amber" в положении nt # 1741 (nt # 424 относительно инициирующего кодона tetW) для чувствительного к тетрациклину штамма, DR10Tet-S9X (CHCC9070), указана над последовательностью ДНК.
Мутация со сдвигом рамки считывания в положении nt # 2722 (nt #1405 относительно инициирующего кодона) для чувствительного к тетрациклину штамма, Bb12Tet-S139 (CHCC8902), указана над последовательностью ДНК.
*): обозначен стоп-кодон.  

Изобретение относится к способу получения новых чувствительных к тетрациклину штаммов рода Bifidobacteriaum sp., содержащих мутантный ген tet на хромосоме, а также к новым чувствительным к антибиотикам штаммам, получаемым из устойчивых к антибиотикам пробиотических штаммов. Изобретение позволяет расширить арсенал чувствительных к тетрациклину штаммов. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 табл.

1. Способ изолирования штамма Bifidobacterium animalis, содержащего мутантный tetW на хромосоме, где указанная мутация придает штамму чувствительность к тетрациклинам, и указанный штамм изолируется из устойчивого к действию тетрациклина бактериального штамма-предшественника, причем устойчивый к антибиотику фенотип обусловлен экспрессией tetW, стабильно интегрированного в хромосоме, где указанный способ включает воздействие на клетки химического мутагена и физического мутагена, и где способ содержит следующие стадии:
1) культивирование клетки-предшественника с получением экспоненциально растущей культуры клеток,
2) перенос аликвоты клеток в свежую среду, содержащую бромид этидия (EtBr),
3) перенос культуры в один или несколько контейнеров для образования слоя культуры толщиной 0,5-10 мм,
4) воздействие на культуру УФ-излучения,
5) культивирование мутантных клеток с получением культуры экспоненциально растущих клеток,
6) перенос аликвоты бактерий в одну или несколько чашек Петри, содержащих пригодную среду для роста на основе агара, где аликвоту бактерии выбирают для получения единичных колоний,
7) идентификация тех колоний, которые обладают приобретенной чувствительностью к антибиотику посредством копирования посевов на чашках Петри с тетрациклиновым антибиотиком и без него, и
8) выделение, выращивание и хранение тех чувствительных к тетрациклиновому антибиотику колоний, которые идентифицированы как новый чувствительный к тетрациклиновому антибиотику штамм, и где минимальная ингибирующая концентрация (МИК) тетрациклина штамма-предшественника составляет, по меньшей мере, 10 мкг тетрациклина/мл и МИК тетрациклина чувствительного к антибиотику штамма составляет 1,5 мкг тетрациклина/мл или меньше.

2. Способ по п.1, где культуру после стадии 4) подвергают стадии накопления мутаций, содержащей стадии:
4а) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналога пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но которую переносят не растущие клетки, и
4b) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствии пенициллина или аналога пенициллина, такого как ампициллин.

3. Штамм Bifidobacterium animalis, который является чувствительным к тетрациклину вследствие инактивирующей мутации в tetW, расположенном на хромосоме, причем ген tetW содержит, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID 3 [GGA ТАС TGA ACC], SEQ ID NO: 6 [GTG GTTTAG TCT]; и где МИК тетрациклина чувствительного штамма составляет 1,5 мкг тетрациклина/мл или меньше.

4. Штамм по п.3, который идентифицирован как штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) и депонирован 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeplkulturen под регистрационным номером DSM17281.

5. Штамм по п.3, который идентифицирован как штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis CHCC9070 (DR10Tet-S9X) и депонирован 28 апреля 2005 года в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeplkulturen под регистрационным номером DSM 17282.

6. Штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis, который является чувствительным к тетрациклину вследствие инактивирующей мутации в tetW, расположенном на хромосоме, и где МИК тетрациклина чувствительного штамма составляет 1,5 мкг тетрациклина/мл или меньше.

7. Штамм Bifidobacterium animalis подвида lactis по п.6, где штаммом-предшественником является Вb-12 или HN019 (DR10).

8. Применение штамма по любому из пп.3-7 для изготовления продукта для улучшения микрофлоры кишечника, или для лечения или предотвращения заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры кишечника, или для улучшения переваривания пищевых добавок, или для улучшения общего состояния человека или позвоночного животного, где указанный продукт выбирают из группы, состоящей из молока, творога, продуктов брожения молока, сквашенного молока, йогурта, замороженного йогурта, молочного порошка, порошков на основе молока, концентрата молока, сыра, плавленого сыра, соусов, напитков, мороженого, ферментированных продуктов на основе злаковых, молочной смеси для младенцев, таблеток, жидких бактериальных суспензий, сухой пероральной добавки, жидкой пероральной добавки, сухого продукта для питания через зонд, жидкого продукта для питания через зонд и бактериальной культуры.