СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ХРУСТАЛИКА С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2010 года по МПК A61K35/44 

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и может быть использовано в экспериментальной офтальмологии для получения клеточной культуры хрусталика с преимущественным содержанием эпителиальных клеток с целью последующих скрининговых исследований различных методов профилактики помутнения задней капсулы in vitro.

Несмотря на грандиозные достижения последних лет в хирургии катаракты, помутнение задней капсулы остается актуальной проблемой, частота развития которой достигает 50% и имеет тенденцию к росту со временем после удаления катаракты. Это обусловлено пролиферацией и миграцией сохранившегося после операции хрусталикового эпителия, полностью удалить который никогда не удается.

Высокий процент развития вторичной катаракты закономерно направляет поиск на наиболее эффективные патогенетически направленные методы, основанные на влиянии различных агентов на эпителий хрусталика. Однако на сегодняшний день отсутствует модель культуры клеток хрусталика, которая позволила бы проводить скрининговое исследование различных методов профилактики помутнения задней капсулы in vitro.

Авторам известен способ получения клеточной культуры хрусталика, разработанный Э.В.Мальцевым и М.С.Парфеновой (Мальцев Э.В. Хрусталик. - М.: Медицина, 1988. - 192 с. - 32 с). Недостатками данного метода являются длительный период культивирования (более 10 недель), гибель значительного числа клеток в центре эксплантата, преимущественное содержание в культуре фибробластов и детрита, что делает ее малопригодной для скрининговых исследований различных методов профилактики помутнения задней капсулы in vitro.

Задачей изобретения является создание клеточной культуры хрусталика с преимущественным содержанием эпителиальных клеток.

Техническим результатом заявляемого способа является быстрое получение клеточной культуры хрусталика, состоящей преимущественно из эпителиальных клеток. Технический результат достигается за счет того, что в качестве исходного материала используют мелкие фрагменты хрусталика, подвергнутые трипсинизации и коллагенизации, позволяющие получить отдельные клеточные элементы. У таких «разрозненных» клеток отсутствует препятствие для деления, что позволяет в короткие сроки получить культуру хрусталика, состоящую преимущественно из эпителиальных клеток.

Способ осуществляется следующим образом. Из энуклеированных глаз кролика задним доступом интракапсулярно выделяют хрусталик. Со стороны заднего полюса хрусталик разделяют на четыре части. После этого механически высвобождают капсулу хрусталика с прилежащими кортикальными массами от ядра, измельчают до мелких кусочков размером 1 мм³ с последующей обработкой смесью 0,05% коллагеназы первого типа и 0,25% трипсина. Затем культуру клеток отмывают трехкратным центрифугированием в течение 5 минут при температуре 4°С и 1500 оборотов в минуту в центрифуге CR 3i, «Joan» (Франция), разводя осадок клеток в бессывороточной среде DMEM/Ham′s F-12. Полученную культуру высевают в культуральные чашки в концентрации 5×10⁵ клеток на см³ и выращивают при температуре 37°С, 5% CO₂, 95% влажности в CO₂ инкубаторе.

Изобретение поясняется следующими данными.

Через 2 недели после начала культивирования была получена клеточная культура хрусталика кролика, занимающая 75% монослоя. Морфология клеток соответствовала эпителиальному типу (черепаховый панцирь) с видимым присутствием фибробластных клеток (веретенообразные клетки). При этом отмечалось, что эпителиальные клетки количественно преобладали над фибробластными. Для изучения клеточного состава полученной клеточной культуры хрусталика кролика проводили специфическое окрашивание моноклональными антителами. Так, при окрашивании моноклональными антителами на цитокератины 18 и 19 было подтверждено наличие эпителиальных клеток в культуре.

Воспроизводимость результатов получения культуры преимущественно эпителиальных клеток хрусталика кролика после пятикратных повторов культивирования позволила придти к заключению о пригодности разработанной технологии для создания экспериментальной модели клеток хрусталика, участвующих в развитии помутнения задней капсулы.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает быстрое получение клеточной культуры хрусталика, состоящей преимущественно из эпителиальных клеток.

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и может быть использовано в экспериментальной офтальмологии для получения пролиферирующей клеточной культуры хрусталика с преимущественным содержанием эпителиальных клеток с целью последующих скрининговых исследований различных методов профилактики помутнения задней капсулы in vitro. Сущность изобретения включает механическое высвобождение капсулы хрусталика с прилежащими кортикальными массами от ядра, измельчение до мелких кусочков размером 1 мм³ с последующей обработкой смесью 0,05% коллагеназы первого типа и 0,25% трипсина, затем культуру клеток отмывают центрифугированием, разводя осадок клеток в бессывороточной среде DMEM/Ham′s F-12; полученную культуру высевают в культуральные чашки в концентрации 5×10⁵ клеток на см³ и выращивают в CO₂ инкубаторе. Преимущество изобретения заключается в разработке простого метода получения клеточной культуры хрусталика, состоящей преимущественно из эпителиальных клеток.

Способ получения клеточной культуры хрусталика с преимущественным содержанием эпителиальных клеток, отличающийся тем, что хрусталик разделяют на четыре части, после этого механически высвобождают капсулу хрусталика с прилежащими кортикальными массами от ядра, измельчают до мелких кусочков размером 1 мм³ с последующей обработкой смесью 0,05% коллагеназы первого типа и 0,25% трипсина, затем культуру клеток отмывают центрифугированием, разводя осадок клеток в бессывороточной среде DMEM/Ham′s F-12, полученную культуру высевают в концентрации 5×10⁵ клеток на 1 см³ и выращивают в CO₂-инкубаторе.