ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИФИЛИСА И ТЕСТ-СИСТЕМА "АКВАСИФ" НА ЕЕ ОСНОВЕ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/571 G01N33/535 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к препаратами диагностикумам (тест-системам) для определения сифилиса методами имунноферментного анализа (ИФА).

В настоящее время для диагностики сифилиса посредством реакции антиген-антитело используются композиции, содержащие иммуноглобулины человека и(или) животных, как правило, иммобилизованные на носителе (Рассказов Н.И. и др. Вестник, 1990 N1, c.12-16; Пат Японии NN 52114019, 1977 и 61007470, 1986 кл. G 01 N 33/16, 33/571), а также высокомолекулярные белковые соединения, например, белок Tmp А Treponema pallidum (Пат. Японии N 02234063, 1990 кл. G 01 N 33/571, G.Antoni, J. Immunol. Methods 1996, v.189, N1, р.137-140).

Недостатками указанных композиций является невысокая селективность, особенно в случае рецидивного, скрытых раннего и позднего сифилиса, вызываемая, по-видимому, стерическими затруднениями, с которыми сталкиваются при проведении реакции.

Для решения указанной проблемы было предложено использовать фрагмент белка возбудителя сифилиса с молекулярной массой 47 кДа (Патент США N 4868118, 1989, кл. G 01 N 33/53), однако при использовании данного пептида высока вероятность получения ошибочных результатов вследствие того, что не все антитела связываются с данным полипептидом, кроме того, его получение вызывает существенные технологические сложности.

Прототипом заявляемого решения является композиция и диагностикум, использующие для связывания антител (AT) липопротеиновый фрагмент Treponema pallidum с молекулярной массой 15 кДа (Евр.патент N 0670494, 1996, кл. G 01 N 33/53), подробно описанный в работе (Bunghn R. et all. Infect, Immun. 1996, v.64, N7, p.2457- 2466). Используемая при этом тест-система состоит из планшетов с иммобилизованными пептидами, конъюгата на основе малеимидобензоил- гидроксисукцинимида, реагента Траута (раствора 2-иминотиолана), буферных растворов, сывороток и антисывороток и вспомогательных устройств.

Однако данная композиция также обладает недостаточной селективностью, в ряде случаев дает ложноположительные результаты, а тест-система включает достаточно дорогие и дефицитные компоненты.

Задачей, решаемой в рамках заявляемого решения, являлось создание более надежного и точного диагностикума на основе такой композиции пептидов, которая связывалась бы с AT к различным эпитопам белковых молекул и не имела бы стерических затруднений в ходе реакции, обеспечивая тем самым селективность анализа.

Было найдено, что данная задача решается созданием композиции, содержащей несколько низкомолекулярных пептидных фрагментов белков Tr.pall., каждый из которых мог бы связываться с AT к отдельному эпитопу, а именно состоящей из пептидов 23-51.

TmpA (Sif 13), 67-87 TpD (Sif 15) и 44-61 TpD (Sif 16). (Аминокислотная последовательность указанных фрагментов приведена ниже в тексте описания)
При получении тест-системы указанные пептиды иммобилизуются на поверхности лунок входящего в нее планшета для ИФА в массовом соотношении соответственно 1:1-2:0.5-1.5.

Данное соотношение обеспечивает повышенную надежность связывания AT, т. к. исходит из ожидаемого соотношения различных AT в сыворотке больного.

Тест-система на основе данной смеси включает:
- иммуносорбент - пластиковые планшеты или стрипы планшетов, в лунках которого сорбирована вышеуказанная диагностическая композиция,
- концентрат фосфатного буферного раствора,
- цитратный буферный раствор,
- буферный раствор на основе казеина для разведения анализируемых сывороток (БРС), содержащий 0.02% консерванта,
- стоп-реагент - раствор (4 моль на 1 л) серной кислоты,
- таблетки о-фенилендиамина дигидрохлорида (ОФД),
- таблетки гидроперита,
- положительный контрольный образец (К+) -инактивированная сыворотка больных сифилисом, разведенная на БРС и окрашенная фуксином кислым,
- негативный контрольный образец (К-) -сыворотка здоровых доноров, разведенная на БРС и окрашенная бромтимоловым синим,
- концентраты конъюгата - смесь моноклональных AT против IgG и IgM человека с добавками стабилизаторов и консервантов, меченные пероксидазой хрена. Основными отличиями тест-системы от прототипа является природа иммуносорбента конъюгатов.

Диагностикум готовят следующим образом.

Полипептиды общей формулы соответственно
Sif-13 23-51 TmpA
Ala-Ser-Glу-Ala-Cуs-Glu-Glu-Ala-GhuLys-Lys-Ala-Ala-Glu- Gln-Alg-Ala-Leu-Leu-Val-Clu-Ser-Ala-His-Ala-Asp-Arg-Arg-Leu.

Sif-15 67-87 TpD:
Tyr-Phe-Gln-Pro-Val-Glu-Met-His-Pro-Ala-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro- Ser-Lys-Glu-Glu-Ala-Asp,
Sif-16 44-61 TpD:
Ala-Ala-Gly-Phe-Asp-Glu- Phe-Pro-Ile-GlyGlu-Asp-Arg-Asp-Val-Cly-Pro-Leu
получают твердофазным методом по стандартной методике с последовательным наращиванием пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензолом (Barany G. , Merri-field R.B. Solid-phase peptide synthesis In: Pcptides. Analys: s, Syntesis, Biology. Eds.: Gross E.,Meienhofer J., N.Y.-Academic Press. - 1980 - Vol.2,-р.3- 285.). Альфа-аминогруппы блокируют трет-бутилоксикарбонильными группами. Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот используют следующие группы:
для лизина - 2-хлорбензилоксикарбонильную,
для гистидина - тозильную,
для треонина и глютаминовой кислоты - соответствующие бензиловые эфиры, для аспарагиновой кислоты - циклогексиловый эфир, для аргинина - мезитиленсульфонильную, для тирозина - 2,6-хлорбензильную.

Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или его смесь с 1-оксибензотриазолом. Блокирование ведут с помощью 50% раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане, а нейтрализацию проводят 5% раствором диизопропиламина в дихлорметане. Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью HF, а очистку - гель- и обращеннофазовой хроматографией.

Полученный в результате диагностикум позволяет выявить суммарные (IgG, IgM) и IgM-антитела к возбудителю сифилиса в сыворотке или плазме крови доноров, больных, контактных и контингентов риска за счет их взаимодействия с диагностической смесью, сорбированной на поверхности лунок полистиролового планшета. Образовавшийся комплекс антиген-антитело обнаруживают с помощью конъюгата - меченных пероксидазой хрена MAT к иммуноглобулинам человека.

Диагностикум позволяет проводить одновременно от 32 до 96 анализов, включая контрольные.

Для приготовления иммуносорбента пептиды растворяют в 0.05М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе, pH 9.5, до конечной концентрации 2-10 мкг на 1 мл.

Растворы вносят по 0.1 мл в лунки планшетов и инкубируют при 4-6^oC в течение 24 часов. Затем лунки промывают раствором фосфатно-солевого буфера, высушивают и упаковывают.

Для проведения анализов лунки планшета промывают фосфатно-солевым буфером, содержащим поверхностно-активные вещества, например Твин-20 (ФСРТ), и вносят анализируемые пробы сыворотки, предварительно разведенные в 20 раз ФСРТ, и инкубируют 30-60 мин при 37^oC, после чего несвязанные компоненты смывают многократной промывкой ФСРТ. При наличии в сыворотке антител к сифилису последние специфически связываются пептидами, сорбированными на поверхности лунок, образуя комплекс антиген-антитело (Аг-Ат). Для выявления комплекса в лунки вносят по 0.1 мл конъюгата пероксидазы хрена с моноклональными антителами к иммуноглобулином человека в подходящем разведении ФСРТ и инкубируют 30-60 мин при 37^oC. Несвязанный продукт удаляют промывкой ФСРТ. Связанный коньюгат выявляют обработкой лунок субстратом, содержащим 0.05% орто-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода в 0.05М фосфатно-цитратном буферном растворе при pH 5.0
Планшет инкубируют 10-20 мин при 15-20^oC, а затем фиксируют реакцию добавлением в лунки 0.05 мл 2М раствора серной кислоты. Наличие комплекса фиксируется с помощью вертикального фотометра на длине волны 490 им.

Результаты анализа сывороток 165 больных и 50 доноров с помощью заявляемого изобретения приведены в табл.1. Влияние соотношения пептидов на свойства диагностикума приведены в табл. 2.

Таким образом, заявляемая тест-система со смесью пептидов на поверхности лунок обладает большей точностью и селективностью по сравнению с прототипом и диагностиками, содержащими индивидуальные пептиды.

Выпуск заявляемой тест-системы налажен в ТОО "Научно-производственное предприятие "Аквапаст" под условным наименованию "АКВАСИФ".

Изобретение относится к медицине, а именно к препаратам для диагностики сифилиса методами иммуноферментного анализа. Диагностическая композиция для определения сифилиса содержит фрагменты генома Trepnema pallidum, а именно смесь пептидов Sif- 1323-51 I=TmpA, Sif 1567-87 TpD, Sif-16, 44-61 TpD. При этом указанная композиция может содержать перечисленные пептиды в соотношении соответственно 1 : 1 - 2 : 0,5 - 1,5. Тест-система для определения сифилиса методом иммуноферментного анализа включает в качестве иммуносорбента пластиковый планшет с лунками, на которые иммобилизована диагностическая композиция, буферные растворы, сыворотки крови, вспомогательные растворы, а в качестве конъюгата - смесь моноклональных антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой хрена. Диагностическая композиция и тест-система на ее основе надежна, селективна и проста в использовании 2 с. и 1 з. п.ф-лы, 2 табл.

1. Диагностическая композиция для определения сифилиса методами иммуноферментного анализа, содержащая фрагменты белковых антигенов Treponema pallidum, отличающаяся тем, что в качестве фрагментов антигенов она содержит смесь пептидов Sif-13 23 - 51 TmpA, Sif-15 67 - 87 TpD, Sif-16 44 - 61 TpD Treponema pallidum. 2. Диагностическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она содержит смесь пептидов в соотношении: Sif-13 23 - 51 TmpA : Sif-15 67 - 87 TpD : Sif-16 44 - 61 TpD = 1 : 1 - 2 : 0,5 - 1,5. 3. Тест-система для определения сифилиса методом иммуноферментного анализа, состоящая из иммуносорбента - пластикового планшета с лунками, содержащими на внутренней стороне иммобилизованные фрагменты белковых антигенов Treponema pallidum, буферных растворов, сывороток крови, конъюгата и вспомогательных растворов и приспособлений, отличающаяся тем, что в качестве фрагментов антигенов иммуносорбент содержит смесь пептидов Sif-13 23 - 51 TmpA; Sif-15 67 - 87 TpD; Sif-16 44 - 61 TpD, Treponema pallidum, а в качестве конъюгата - смесь моноклональных антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой хрена.